لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق
مارس 13, 2009
ويقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة وفعالة للتحضير للأجنة ذبابة الفاكهة تعيش التصوير التحليل. بروتوكول يتيح لنا الرطوبة والغاز والصرف لا ضغط الجنين ذبابة الفاكهة. هذا الأسلوب هو مناسبة لGFP القائم على التصوير المباشر للأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام stereomicroscope أو تستقيم المجهر المركب.
مرحباً. اسمي بروس ريد، وأنا أستاذ مساعد في قسم الأحياء بجامعة واترلو في واترلو، أونتاريو، كندا. نقوم اليوم بإعداد هذا الأرشيف المرئي لتوثيق تقنية جديدة طورناها لتحضير أجنة softly من أجل تحليل التصوير الحي.
أثناء إجراء تحليل التصوير المباشر باستخدام أجنة ذبابة الفاكهة (drosophila)، نستخدم بشكل متكرر تقنية التصوير الزمني (time-lapse)، والتي قد تستمر لعدة ساعات. لذلك، من المهم توفر تقنية تضمن حماية الأجنة من الجفاف ونقص الأكسجة. بالإضافة إلى ذلك، نسعى لتطوير تقنية تتجنب حدوث أي ضغط على الجنين.
في عملية التثبيت، توصلنا إلى طريقة بسيطة وغير مكلفة وفعالة نطلق عليها اسم تحضير القطرة المعلقة. يعد تحضير القطرة المعلقة مناسباً لتحليل التصوير الحي للأجنة باستخدام المجهر المجسم أو أي مجهر مركب قائم. يظهر هذا الفيلم المسرع ثمانية أجنة تعبر عن GFP تم تحضيرها باستخدام بروتوكول القطرة المعلقة وتصويرها بواسطة المجهر الفلوري بنظام التصوير المتقطع (time-lapse).
يمثل تسلسل التصوير هذا فترة زمنية انقضت تزيد عن أربع ساعات. ويشير بدء الحركة إلى أن هذه الأجنة في حالة حيوية. سنقوم الآن بإرشادكم من خلال وصف تفصيلي خطوة بخطوة حول كيفية تنفيذ بروتوكول القطرة المعلقة.
تُجمع الأجنة من أطباق عصير العنب القياسية، أو أطباق البيض. وباستخدام جامع بيض dsof الآلي من شركة Fly max scientific equipment، يتيح الجامع الآلي جمع الأجنة بشكل متزامن في مرحلة نمو محددة مسبقاً. وتحضيراً للتنظيم اليدوي للأجنة، يتم لصق قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على شريحة مجهرية ثم تُزال الطبقة الخلفية للشريط.
يتطلب بروتوكول القطرة المعلقة غرفة مخصصة مصنوعة من صفيحة من بلاستيك البولي كربونات بسمك 5 mm. يتم قطع الصفيحة وفقاً لأبعاد شريحة المجهر، ويُصنع تجويف بعمق 3 mm باستخدام دوّار. ويتم تحقيق الترطيب في غرفة التصوير الحي باستخدام قطعة من الورق النشافي يتم قصها لتناسب بئر الغرفة وتُبلل بالماء المقطر.
يُعد زيت Halo Carbon مثاليًا للتصوير الحي لأجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) المنسقة نظراً لنفاذيته للغازات وصفائه البصري. ويؤدي خلط زيت Halo Carbon من السلسلة 700 والسلسلة 56 بنسبة واحد إلى واحد إلى الحصول على لزوجة مناسبة للعمل مع أجنة Drosophila. ويمكن جمع الأجنة من أطباق أغار عصير العنب باستخدام إما ملقط المجوهرات أو فرشاة رسم دقيقة جداً.
تلتصق الأجنة ببعضها البعض وبأطراف الملقط، مما يؤدي إلى تجمّعها بسهولة في كتل من الأجنة التي تلتصق بالملقط.
يتم خفض الرؤوس برفق على السطح اللاصق للشريط الموجود على شريحة التزيين التي تم تحضيرها مسبقاً. وأثناء معاينة الأجنة عبر مجهر ستيريو، يتم دفعها برفق أو مسحها بجانب الملقط. يجب كسر الإكليل دون تمزيق غشاء الفيلين الداخلي.
يتطلب هذا الأمر يداً ثابتة وصبراً وبعض التدريب. فبمجرد تمزق الغشاء الخارجي، يميل الجنين منزوع الكلور إلى الالتصاق بالملقط. احذر من السماح للجنين منزوع الكلور بملامسة السطح اللاصق للشريط.
قد يكون من الصعب جداً استرجاعها من الشريط، لذا يتم نقل الأجنة منزوعة الكلور بسرعة إلى قطرة زيت الهالو كاربون. توضع قطرات من زيت الهالو كاربون على غطاء الشريحة، ومن الجيد الاحتفاظ بها بالقرب من منطقة العمل. يتم ذلك عن طريق ملامسة طرف الملقط لسطح قطرة زيت الهالو كاربون.
يمكن التأكد من إزاحة الجنين من الملقط إلى وسط النقل الزيتي بالعين المجردة، باستخدام خلفية سوداء ومصدر إضاءة بالألياف الضوئية مُثبت بزاوية مائلة قبل البدء بنقل الجنين التالي. ومن المفيد مسح الزيت عن الملقط نظراً لقدرتها على الطفو في زيت الهالوجين الكربوني. تطفو الأجنة المنسقة على سطح قطرة الزيت.
يمكننا التحكم في موضع واتجاه الأجنة عن طريق دفعها إلى قاع قطرة الزيت وقلب شريحة الغطاء بسرعة في بروتوكول القطرة المعلقة. نقوم بقلب شريحة الغطاء فوق البئر المرطب في غرفة التصوير الحي. وعند قلب شريحة الغطاء، ستستقر الأجنة مقابل الجانب السفلي من الشريحة.
يمكن التحقق من وضعيات سكون الأجنة تحت مجهر ستيريو. وفي حال كانت النتائج غير مرضية، يمكن تكرار الإجراء. وبمجرد وصول الأجنة إلى الوضعية المطلوبة، يتم تثبيت غطاء الشريحة في غرفة التصوير الحي باستخدام شريط لاصق.
يتم تهوية الحجرة عن طريق عمل ثقوب في الشريط اللاصق. وبذلك تصبح الأجنة جاهزة الآن للتصوير.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة لتحضير أجنة Drosophila لتحليل التصوير الحي. يضمن البروتوكول الرطوبة المناسبة وتبادل الغازات مع منع انضغاط الأجنة، مما يجعله مناسباً للتصوير القائم على GFP.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- تقنيات التصوير
خلفية علمية
- يُجرى تحليل التصوير الحي لأجنة Drosophila عادةً باستخدام تقنية التصوير الزمني المتقطع.
- تكون الأجنة عرضة للجفاف ونقص الأكسجة خلال جلسات التصوير الممتدة.
- تعد التقنية التي تتجنب ضغط الأجنة ضرورية لضمان دقة التصوير.
- يتطلب التصوير المعتمد على GFP ظروفاً محددة لتحقيق أفضل النتائج.
الهدف من الدراسة
- تطوير طريقة تحمي أجنة Drosophila من الجفاف.
- ضمان تبادل الغازات بشكل كافٍ أثناء التصوير.
- تجنب ضغط الأجنة أثناء التصوير الحي.
الطرق المستخدمة
- تحضير أجنّة Drosophila للتصوير الحي.
- تنفيذ التحكم في الرطوبة أثناء جلسات التصوير.
- استخدام المجهر الستيريو أو المجهر المركب الرأسي للتصوير.
- تطبيق تقنيات التصوير المعتمدة على GFP.
النتائج الرئيسية
- تحافظ هذه الطريقة بفعالية على الرطوبة وتبادل الغازات للأجنة.
- تبقى الأجنة غير مضغوطة، مما يسمح بجودة تصوير أفضل.
- يعطي التصوير المعتمد على GFP نتائج واضحة على فترات زمنية ممتدة.
- تعد هذه التقنية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للباحثين.
الاستنتاجات
- تُحسّن هذه الطريقة جودة التصوير الحي لأجنة Drosophila.
- توفر هذه الطريقة نهجاً موثوقاً للباحثين في هذا المجال.
- يمكن اعتماد هذا البروتوكول بسهولة في مختلف الإعدادات المختبرية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التصوير الحي للكائنات النموذجية أمراً بالغ الأهمية للتحقق من الأهداف والمسح المظهري في مراحل الاكتشاف المبكرة. ويعالج بروتوكول القطرة المعلقة القيود الرئيسية المتمثلة في الجفاف، ونقص الأكسجين، والضغط الميكانيكي التي تؤثر سلباً على حيوية الأجنة وجودة البيانات أثناء التصوير المتقطع لفترات زمنية ممتدة. ومن خلال تمكين التصوير غير المضغوط وذي الصلة فسيولوجياً لأجنة Drosophila، تدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الميكانيكية للتدخلات الجينية والدوائية بتنسيق قابل للتوسع وفعال من حيث التكلفة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء التنظيم الجيني في العمليات الديناميكية مثل التشكل النسيجي والتصاق الخلايا دون حدوث شوائب ميكانيكية ناتجة عن الضغط.
- القيمة التشغيلية: يحافظ على حيوية الجنين لأكثر من أربع ساعات، مما يدعم المراقبة الطولية لوظائف الجينات وديناميكيات المسارات.
- القيمة التنبؤية: يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن الأنماط الظاهرية الناجمة عن الإجهاد، مما يعزز الثقة في فحوصات التحقق من الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر منصة قياسية وقابلة للتكرار للتصوير الحي المعتمد على GFP، مما يقلل من التباين البيئي.
- القيمة التشغيلية: يستخدم مواد منخفضة التكلفة ومتاحة (زيت الهالوكربون، وغرفة من البوليكربونات، وشريط لاصق) مناسبة للتكيف مع الإنتاجية العالية.
- جاهزية المقايسة: يستفيد من طفو الأجنة في الزيت للحفاظ على الاستقرار الموضعي، مما يقلل من الانزياح ويحسن اتساق الإشارة في عمليات الحصول على الصور بنظام التصوير الزمني (time-lapse).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يدعم تصوير العمليات النمائية المحفوظة ذات الصلة بنماذج الأمراض البشرية، مما يسهل الاستقراء عبر الأنواع المختلفة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يسمح بمراقبة السلوكات الخلوية (مثل موت الخلايا والالتصاق) في ظل الظروف الفسيولوجية، مما يعزز الثقة التنبؤية للنماذج قبل السريرية اللاحقة.
- نظام ذو صلة بالمرض: يمكن استخدام أجنة Drosophila التي تعبر عن مراسلات GFP المرتبطة بالمرض لمراقبة تعديل المسارات في الجسم الحي (in vivo).
تكامل مسارات العمل وسير العمل
يتناسب بروتوكول القطرة المعلقة ضمن سلسلة الاكتشافات بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، لا سيما في المقايسات التي تتطلب تصويراً ديناميكياً وغير مضغوط للمراسلين المشفرة جينياً.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين التصوير المباشر لتأثيرات تثبيط الجينات أو الإفراط في تعبيرها على التشكل الجنيني.
- المسح: توفر قراءات فلورية كمية ومحددة زمنياً، وهي ضرورية لمقارنة تأثيرات المركبات أو الحالات الجينية.
- التحليلات: تُنتج بيانات تصوير زمني مستقرة وعالية الجودة، مناسبة للتحليل المورفومتري والقياس الكمي للمظاهر المظهرية.
- البحث الانتقالي: تربط النتائج الجينية في Drosophila بالمسارات المحفوظة، مما يوجه عملية اختيار الأهداف لنماذج الفقاريات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تتيح بساطة البروتوكول وتكلفته المنخفضة اعتماده على نطاق واسع بين الفرق كطريقة قياسية لتحضير التصوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تحسين الثقة التنبؤية من خلال التخلص من آثار الضغط الاصطناعية والحفاظ على الظروف الفسيولوجية أثناء التصوير.
- القيمة التشغيلية: ضمان قابلية التكرار من خلال التحكم الموحد في الرطوبة، وتبادل الغازات، والتعامل مع الأجنة.
- القيمة الاستراتيجية: تقليل الضوضاء البيولوجية في حملات المسح، مما يزيد من حساسية المقايسة ويقلل معدلات النتائج الإيجابية الكاذبة.
- التأثير على المحفظة: تمكين اتخاذ قرارات أكثر موثوقية بشأن المضي قدماً أو التوقف في عملية التحقق من الأهداف من خلال توفير بيانات نمطية ذات دقة أعلى.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع أجنة Drosophila وتقنيات إزالة الكوريون.
- يعتمد على توفر زيالهوكربون وأدوات التصنيع الدقيق الأساسية لتجهيز الغرفة.
- يستلزم توحيد عمر الأجنة، والنمط الجيني، واتساق عملية التثبيت بين جميع المستخدمين.
- قد يتطلب التكييف مع أنظمة نماذج أخرى تحسين طفو الزيت وهندسة الغرفة.
- قيد عملي: الأنسب للأجنة التي تظل طافية في زيت الهالوكربون؛ ولا ينطبق على أنواع الخلايا الأكثر كثافة أو التي تلتصق.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
