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The Preparation of <em>Drosophila</em> Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

University of Waterloo

&#x81EA;&#x566C;&#x6027;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x4E0E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51CB;&#x4EA1;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x5173;&#x7CFB;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x77E5;&#x4E4B;&#x751A;&#x5C11;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x6027;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1; (PCD)&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7814;&#x7A76;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5173;&#x7CFB;&#x901A;&#x8FC7;&#x7814;&#x7A76;&#x6D88;&#x9664; extra-embryonic &#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A; amnioserosa (AS) &#x7684;&#x679C;&#x8747;&#x53D1;&#x80B2;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;AS &#x6210;&#x4E3A;&#x81EA;&#x566C;&#x5728;&#x6700;&#x540E;&#x9636;&#x6BB5;&#x7684;&#x80DA;&#x80CE;&#x53D1;&#x751F; &#xFF1B;&#x6700;&#x7EC8;&#xFF0C;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6D88;&#x9664;&#x6D89;&#x53CA;&#x4F9D;&#x8D56;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684;&#x6838;&#x5206;&#x88C2;&#x3001; &#x7EC4;&#x7EC7;&#x5206;&#x79BB;&#x548C;&#x88AB;&#x706B;&#x7130;&#x541E;&#x6CA1;&#x7684;&#x541E;&#x566C;&#x5DE8;&#x566C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x6709;&#x7F3A;&#x9677;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x6216;&#x6267;&#x884C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684; PCD &#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x964D;&#x4F4E;&#x548C;&#x6D88;&#x9664; AS &#x4F46;&#x662F;&#x663E;&#x793A;&#x6CA1;&#x6709;&#x6D88;&#x51CF;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x81EA;&#x566C;&#x3002;&#x6301;&#x7EED;&#x81EA;&#x566C;&#x4E0D;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x4E00;&#x5B9A;&#x80FD;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;&#x5947;&#x602A;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x4E0B;&#x8C03;&#x7684;&#x81EA;&#x566C;&#x8FD8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6301;&#x4E45;&#x6027;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x8868;&#x578B;&#x548C;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;&#x76F8;&#x53CD;&#xFF0C;&#x81EA;&#x566C;&#x7684;&#x4E0A;&#x8C03;&#x4F1A;&#x5BFC;&#x81F4;&#x4F9D;&#x8D56;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684;&#x79BB;&#x89E3;&#x4E3A;&#x65F6;&#x5C1A;&#x65E9;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x610F;&#x89C1;&#x662F;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x89E3;&#x91CA;&#xFF0C;&#x81EA;&#x566C;&#x662F;&#x5B58;&#x4E3A;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7684;&#x5148;&#x51B3;&#x6761;&#x4EF6;

&#x81EA;&#x566C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x679C;&#x8747;&#x53D1;&#x80B2;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;

The relationship between autophagic cell death and apoptosis is a poorly understood aspect of programmed cell death (PCD). We have examined this relationship by studying the elimination of an extra-embryonic tissue, known as the amnioserosa (AS), during Drosophila development. The AS becomes autophagic during the final stages of embryogenesis; ultimately, however, the elimination of the AS involves caspase-dependent nuclear fragmentation, tissue dissociation and engulfment by phagocytic macrophages. Mutants that are defective in the activation or execution of caspase-dependent PCD fail to degrade and eliminate the AS but show no abatement in AS autophagy. Sustained autophagy does not, therefore, necessarily result in cell death. Surprisingly, the downregulation of autophagy also results in a persistent AS phenotype and reduced cell death. Conversely, upregulation of autophagy results in caspase-dependent premature AS dissociation. These observations are consistent with the interpretation that autophagy is a prerequisite for caspase-dependent cell death in the AS.

Autophagy promotes caspase-dependent cell death during Drosophila development.

La relation entre la mort cellulaire et l&#x26;#39;apoptose autophagie est un aspect mal connu de la mort cellulaire programm&#xE9;e (PCD). Nous avons examin&#xE9; cette relation en &#xE9;tudiant l&#x26;#39;&#xE9;limination d&#x26;#39;un tissu extra-embryonnaire, connu sous le nom amnioserosa (AS), lors de d&#xE9;veloppement de la drosophile. Le AS devient autophagique au cours des derniers stades de l&#x26;#39;embryogen&#xE8;se; finalement, cependant, l&#x26;#39;&#xE9;limination de la caspase-AS implique d&#xE9;pend fragmentation nucl&#xE9;aire, le tissu de dissociation et l&#x26;#39;engloutissement par les macrophages phagocytaires. Mutants qui sont d&#xE9;fectueux dans l&#x26;#39;activation ou &#xE0; l&#x26;#39;ex&#xE9;cution de la caspase-d&#xE9;pendant PCD ne parviennent pas &#xE0; se d&#xE9;grader et &#xE9;liminer l&#x26;#39;AS, mais ne montrent pas de r&#xE9;duction dans les AS autophagie. Autophagie soutenue ne constitue pas, par cons&#xE9;quent, n&#xE9;cessairement &#xE0; la mort cellulaire. &#xC9;tonnamment, la r&#xE9;gulation n&#xE9;gative de l&#x26;#39;autophagie se traduit aussi par un probl&#xE8;me persistant AS ph&#xE9;notype et la mort cellulaire r&#xE9;duite. A l&#x26;#39;inverse, la r&#xE9;gulation positive des r&#xE9;sultats autophagie dans la caspase-d&#xE9;pendant pr&#xE9;coce AS dissociation. Ces observations sont en accord avec l&#x26;#39;interpr&#xE9;tation que l&#x26;#39;autophagie est un pr&#xE9;alable &#xE0; la mort cellulaire caspase-d&#xE9;pendante de l&#x26;#39;AS.

L&#x26;#39;autophagie favorisant la mort cellulaire caspase-d&#xE9;pendante Pendant d&#xE9;veloppement de la drosophile

Die Beziehung zwischen autophagic Zellentod und Apoptose ist ein weitgehend unverstanden Aspekt der programmierten Zelltod (PCD). Wir haben diese Beziehung gepr&uuml;ft, durch das Studium der Beseitigung einer extra-embryonic Gewebe, bekannt als die Amnioserosa (AS), w&auml;hrend der Drosophila-Entwicklung. Die AS wird w&auml;hrend der Endphase der Embryogenese autophagic; letztlich umfasst jedoch die Beseitigung des AS Caspase-abh&auml;ngigen nuklearen Fragmentierung, Gewebe-Dissoziation und Engulfment durch phagozytische Makrophagen. Mutanten, die Defekte in der Aktivierung und Ausf&uuml;hrung der Caspase-abh&auml;ngigen PCD sind nicht beeintr&auml;chtigt und beseitigen der AS aber zeigen keine Minderung in als Autophagy. Nachhaltige Autophagy f&uuml;hrt nicht, daher unbedingt zu Zellentod. &Uuml;berraschend, f&uuml;hrt die Heraufregulation Autophagy auch eine persistente als Ph&auml;notyp und reduzierte Zelltod. Umgekehrt f&uuml;hrt Hochregulation von Autophagy Caspase-abh&auml;ngigen verfr&uuml;ht als Dissoziation. Diese Beobachtungen sind konsistent mit der Interpretation dieser Autophagy ist eine Voraussetzung f&uuml;r Caspase-abh&auml;ngigen Zellentod in den AS.

Autophagy f&ouml;rdert Caspase-abh&auml;ngigen Zelltod w&auml;hrend der Drosophila-Entwicklung.

Il rapporto tra morte autophagic delle cellule e apoptosis &egrave; un aspetto mal inteso della morte programmata delle cellule (PCD). Abbiamo esaminato questa relazione studiando l&#39;eliminazione di un tessuto fetale, noto come il amnioserosa (AS), durante lo sviluppo della drosofila. AS diventa autophagic durante le fasi finali dell&#39;embriogenesi; in definitiva, tuttavia, l&#39;eliminazione della AS comporta frammentazione nucleare caspasi-dipendente, dissociazione dei tessuti ed engulfment dai macrofagi fagocitosi. Mutanti che sono difettosi nell&#39;attivazione o esecuzione di PCD caspasi-dipendente non riescono a degradare ed eliminare il come ma non mostrare nessun abbattimento in come autophagy. Autophagy sostenuta, quindi, necessariamente non risulta nella morte delle cellule. Sorprendentemente, il downregulation di autophagy risultati anche in un persistente come fenotipo e ridotta di cellule morte. Al contrario, sovraregolazione di autophagy provoca prematura come dissociazione caspasi-dipendente. Queste osservazioni sono coerenti con l&#39;interpretazione che autophagy &egrave; un prerequisito per la morte delle cellule caspasi-dipendente in As.

Autophagy promuove la morte cellulare caspasi-dipendente durante lo sviluppo della drosofila.

&#x81EA;&#x5DF1;&#x8CAA;&#x98DF;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x3068;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3068;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30E0;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#xFF08;PCD&#xFF09;&#x306E;&#x3088;&#x304F;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x5074;&#x9762;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x4E2D;&#x306B;&#x3001;&#x7F8A;&#x6F3F;&#x819C;&#xFF08;AS&#xFF09;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x4F59;&#x5206;&#x306A;&#x80DA;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; AS&#x80DA;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x6700;&#x7D42;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x6D88;&#x53BB;AS&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306E;&#x6838;&#x306E;&#x65AD;&#x7247;&#x5316;&#x3001;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x3068;&#x8CAA;&#x98DF;&#x30DE;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x8CAA;&#x98DF;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x3002;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F9D;&#x5B58;PCD&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5B9F;&#x884C;&#x4E2D;&#x306B;&#x6B20;&#x9665;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3057;&#x3001;&#x6392;&#x9664;&#x3059;&#x308B;AS&#x304C;AS&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x524A;&#x6E1B;&#x3092;&#x793A;&#x3055;&#x306A;&#x3044;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5931;&#x6557;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A;&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5FC5;&#x305A;&#x3057;&#x3082;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x306B;&#x306F;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x9A5A;&#x304F;&#x3079;&#x304D;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3068;&#x9084;&#x5143;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6301;&#x7D9A;&#x6027;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3059;&#x3002;&#x89E3;&#x96E2;AS&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F9D;&#x5B58;&#x65E9;&#x7523;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x9006;&#x306B;&#x3001;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x89B3;&#x200B;&#x200B;&#x5BDF;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;AS&#x3067;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x306E;&#x524D;&#x63D0;&#x6761;&#x4EF6;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x89E3;&#x91C8;&#x3068;&#x6574;&#x5408;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;

&#x30AA;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30B8;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x4E2D;&#x306E;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;

Autophagic &#xC138;&#xD3EC; &#xC8FD;&#xC74C;&#xACFC; apoptosis&#xC758; &#xAD00;&#xACC4; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC8FD;&#xC74C; (PCD)&#xC758; &#xC800;&#xC870;&#xD55C; &#xC774;&#xD574; &#xCE21;&#xBA74; &#xC774;&#xB2E4;. Drosophila &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; amnioserosa (AS)&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; extra-embryonic &#xC9C1;&#xBB3C;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xB97C; &#xACF5;&#xBD80; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xAD00;&#xACC4;&#xB97C; &#xC0B4;&#xD3B4;&#xBCF4;&#xC558;&#xB2E4;. Embryogenesis;&#xC758; &#xCD5C;&#xC885; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB294; AS autophagic &#xB41C;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xAD81;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;,,&#xC758; &#xC81C;&#xAC70; &#xD3EC;&#xD568; caspase&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xD575; &#xBD84;&#xC5F4;, &#xC870;&#xC9C1; &#xBD84;&#xB9AC; &#xBC0F; engulfment phagocytic &#xB300; &#xC2DD; &#xC138;&#xD3EC;. &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB610;&#xB294; caspase &#xC885;&#xC18D; PCD &#xC2E4;&#xD589; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xACB0;&#xD568;&#xC774; &#xC788;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC800;&#xD558; &#xD558; &#xACE0; AS&#xB97C; &#xC81C;&#xAC70; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; autophagy&#xB85C;&#xC5D0; &#xC544;&#xBB34; &#xAC10;&#xC18C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; autophagy, &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xBC18;&#xB4DC;&#xC2DC; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC138;&#xD3EC; &#xC8FD;&#xC74C;. &#xB180;&#xB78D;&#xAC8C;&#xB3C4;, autophagy&#xC758; downregulation &#xD45C;&#xD604; &#xD615; &#xBC0F; &#xAC10;&#xC18C; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC8FD;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC601;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xB300;&#xB85C; autophagy&#xC758; upregulation caspase &#xC885;&#xC18D; &#xBD84;&#xB9AC;&#xB85C; &#xC870;&#xAE30; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD574;&#xC11D;&#xACFC; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xB294; &#xD574;&#xB2F9; autophagy caspase &#xC885;&#xC18D; &#xC140;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; &#xC774;&#xB984;&#xC73C;&#xB85C; &#xC8FD;&#xC74C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC804;&#xC81C; &#xC870;&#xAC74;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;

Autophagy&#xB294; Drosophila &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; caspase &#xC885;&#xC18D; &#xC138;&#xD3EC; &#xC8FD;&#xC74C;&#xC744; &#xC2B9;&#xC9C4; &#xC2DC;&#xD0A8;&#xB2E4;.

La relaci&#xF3;n entre la muerte celular por autofagia y la apoptosis es un aspecto poco conocido de la muerte celular programada (PCD). Hemos examinado esta relaci&#xF3;n mediante el estudio de la eliminaci&#xF3;n de un tejido extra-embrionario, conocida como la amnioserosa (AS), durante el desarrollo de Drosophila. El AS se convierte en la autofagia durante las etapas finales de la embriog&#xE9;nesis, en &#xFA;ltima instancia, sin embargo, la eliminaci&#xF3;n de la AS consiste en la caspasa-dependiente de la fragmentaci&#xF3;n nuclear, el tejido de la disociaci&#xF3;n y la absorci&#xF3;n por los macr&#xF3;fagos fagoc&#xED;ticas. Los mutantes que son defectuosos en la activaci&#xF3;n o la ejecuci&#xF3;n de la caspasa-dependiente de PCD no para degradar y eliminar el AS, pero no muestran ninguna reducci&#xF3;n de la autofagia en AS. Autofagia sostenido no, por lo tanto, necesariamente resulta en la muerte celular. Sorprendentemente, la disminuci&#xF3;n de la autofagia tambi&#xE9;n se traduce en una persistente como el fenotipo y la muerte celular reducida. Por el contrario, la regulaci&#xF3;n positiva de los resultados de la autofagia en la caspasa-dependiente de la eyaculaci&#xF3;n como una disociaci&#xF3;n. Estas observaciones son consistentes con la interpretaci&#xF3;n que la autofagia es un requisito previo para la muerte celular dependiente de caspasas en el AS.

Roopali Chaudhary

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