أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

تبدأ هذه العملية بتحضير مصفوفة من CP one GFP من خلال زراعة سلالة من الخلايا أولاً، ثم نقل المصفوفة باستخدام الدبوس إلى طبق جديد. وفي الوقت نفسه، يتم تحضير نسخة حديثة من DMA. بعد ذلك، نقوم بتزويج مصفوفة ACP one GFP مع DMA واختيار ثنائيات الصيغة الصبغية، والتي يتم بعد ذلك تحفيز تكوين الأبواغ لها على أوساط التبوغ.

بعد مرور خمسة أيام، يتم استنبات نسل Myotic على وسط LRK، الذي لا تنمو عليه سوى الخلايا أحادية الصيغة الصبغية MAT A. ومن خلال جولتين إضافيتين من الاختيار، نستخلص الخلايا أحادية الصيغة التي تحمل كلاً من ACP one GFP، وجيناً معطلاً لـ can mycin. وأخيراً، يمكننا اختيار سلالات فردية مباشرة من الطبق وفحص مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام المجهر البؤري.

مرحباً، أنا تشاب تي من مختبر لو من قسم بيولوجيا الخلية والنمو في معهد علوم الحياة بجامعة كولومبيا البريطانية. ومرحباً، أنا جيسي تشاو، أيضاً من مختبر لو. سنعرض لكم اليوم طريقة عالية الإنتاجية لدمج علامات GFP في خلفيات طافرة متنوعة في الخميرة باستخدام نظام روبوتي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مورفولوجيا العضيات مثل D، والشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا. لذا، فلنبدأ. بالنسبة لهذا البروتوكول، نستخدم سلالتين مختلفتين من الخميرة.

سلالة CP one GFP هي سلالة تحتوي على وسم GFP في الطرف الكربوكسيلي (C terminal) لبروتين ACP one، وقد تم إنتاجها عن طريق إعادة التركيب المتجانس بوساطة PCR باستخدام البلازميد PKT 1 28. خلفية هذه السلالة هي BY 7 0 4 3. كما نستخدم سلالة DMA أو مصفوفة طفرات الحذف، وهي مصفوفة تضم حوالي 5, 000 من طفرات الحذف للجينات غير الأساسية.

تم تعطيل جميع هذه الجينات غير الأساسية في السلالة G four 18. وتعتبر السلالة BY 47 41 هي الخلفية الوراثية للمصفوفة. لبدء إنماء مستعمرات من خلايا ACP one GFP، يتم صب 5 milliliter من مزرعة ACP one GFP التي نمت طوال الليل على طبق hiss.

اترك الطبق ليجف بشكل كافٍ باستخدام لهب أو داخل غطاء دخان بيولوجي. وبمجرد جفافه، قم بتحضين الطبق عند 30 درجة Celsius طوال الليل. بعد التحضين، استخدم روبوتًا لترتيب سلالة A CP one GFP بواقع 1,536 مستعمرة لكل طبق.

في الوقت ذاته، قم بإعداد نسخة جديدة من DMA عن طريق التثبيت المكرر (replica pinning) على أربعة أطباق YPDG 18. بعد ذلك، قم بحضن الأطباق عند درجة حرارة 30 درجة مئوية طوال الليل حتى تنمو السلالات. قم بإعداد سلالة A CP one GFP باستخدام DMA عن طريق التثبيت المكرر وتغطية المستعمرات على أطباق YPD، ثم احضن الأطباق عند درجة حرارة 30 درجة مئوية طوال الليل.

بعد تحضين طبق النسخ، يتم نقل المستعمرات إلى أطباق SD hiss G four 18 لاختيار الخلايا المنشرة، ثم تُحضن الأطباق عند 30 درجة Celsius طوال الليل. ومن أجل بدء عملية التبوغ والإنبات، يتم أولاً نقل المزدوجات عبر طبق نسخ إلى أطباق YPDG four 18 لزيادة كفاءة التبوغ في الخطوة التالية. وبعد التحضين عند 30 درجة Celsius لمدة يوم واحد، تُنقل المزدوجات عبر طبق نسخ إلى وسط تحفيز التبوغ، الذي يحتوي على مستويات مخفضة من مصادر الكربون والنيتروجين لتحفيز تكوين الأبواغ الاختزالية.

بعد ذلك، يتم تحضين الأطباق عند 25 درجة Celsius لمدة خمسة أيام على الأقل. وبعد التحضين، يتم إنبات الحصيرة، وهي نسل ميوتي، عن طريق نقل المستعمرات بطريقة الزراعة المتكررة (replica plating) إلى أوساط LRK. سيعمل هذا الوسط على تحفيز إنبات الخلايا من الأبواغ؛ لذا يتم تحضين الأطباق عند 30 درجة Celsius لمدة يومين من أجل اختيار الخلايا التي تحمل كلًا من أليل GFP وأليل الطفرة المنفردة.

يتم إجراء عملية الزرع التكراري لخلايا Matt A على وسط Lade G four 18، والذي يعمل على انتخاب الخلايا أحادية الصيغة الصبغية التي تحمل حذف الجين، ثم تُحضن هذه الأطباق عند 30 درجة Celsius طوال الليل. بعد ذلك، يتم إجراء زرع تكراري للنسل الميوزي لـ Matt A على وسط L-H-R-K-G four 18 لانتخاب نمو الطفرات الفردية التي تحمل أيضاً ACP one GFP، وتُحضن طوال الليل عند 30 درجة Celsius.

يمكن بعد ذلك تخزين الأطباق عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. ومن أجل تصوير الطفرات المطلوبة التي تعبر عن CP one GFP مباشرة من الطبق، ابدأ بانتقاء المستعمرات المطلوبة من الأطباق. قم بتنمية الخلايا عند درجة حرارة 30 °C في أوساط YPD أو SD hiss حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكر.

أخيراً، قم بتصوير الطفرات باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) مع مجموعة مرشحات GFP؛ في هذه الصورة البؤرية، تم تصوير طفرة ونمط بري يحتويان على علامة ACP one GFP باستخدام المجهر البؤري لدراسة شكل الميتوكوندريا. تظهر هذه الطفرة تحديداً نمطاً ظاهرياً مضطرباً للميتوكوندريا، وبالتالي فهي مرشح جيد لمزيد من الاستقصاء. لقد أوضحنا لكم كيفية دمج علامة متعددة النسخ، وهي CP one GFP، بكفاءة في مصفوفة الطفرات المحذوفة باستخدام نظام روبوتي.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحضير الأوساط الغذائية حديثاً وترك المكان لفترة كافية ليجف. فإذا كانت الرطوبة عالية، سيتراكم التكثف مما يزيد من احتمالية حدوث التلوث. كما يجب عليك التحقق بدقة من تحضير جميع أوساط الانتخاب بشكل صحيح لأنها ضرورية جداً لهذا البروتوكول.

يمكن استخدام هذا الإجراء أيضاً لأنواع أخرى من العلامات. على سبيل المثال، لتصوير er، نستخدم عادةً العلامتين air 11 و GSP. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.