أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.
مارس 2, 2009
وتستخدم على نطاق واسع GFP الانصهار البروتينات لتصور العضيات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، الكشف عن الطفرات التي تؤثر في التشكل من العضيات يتطلب عموما الطفرات الفردية وقتا طويلا. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لدمج عضية في وقت واحد ، في GFP علامات الجينات غير الضرورية في 5000 ما يقرب من الخميرة.
يبدأ هذا الإجراء بإعداد مصفوفة من CP واحد GFP عن طريق زراعة خط من الخلايا أولا ثم تثبيت المصفوفة على لوحة جديدة. في الوقت نفسه ، قم بإعداد نسخة جديدة من DMA. بعد ذلك ، نقوم بتزاوج مصفوفة ACP one GFP مع DMA ونختار ثنائيات الصبغيات ، والتي يتم بعد ذلك تنتشر على وسائط التبواغ.
بعد خمسة أيام ، نبتت ذرية الميوتيك على وسائط LRK ، حيث ينمو MAT A haplos فقط. من خلال جولتين إضافيتين من الاختيار ، نستعيد خلايا هابلو التي تحمل كلا من ACP واحد GFP ، وجين تم التخلص منه على علبة المايسين. أخيرا ، يمكننا اختيار السلالات الفردية مباشرة من اللوحة ومراقبة مورفولوجيا الميتوكوندريا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
مرحبا ، أنا الفصل T من مختبر القانون من قسم الخلية والبيولوجيا التنموية في معهد علوم الحياة بجامعة كولومبيا البريطانية. مرحبا ، أنا جيسي تشاو ، أيضا من مختبر القرض. سنعرض لك اليوم طريقة إنتاجية عالية لدمج علامات GFP في خلفيات متحولة مختلفة في الخميرة باستخدام نظام آلي.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مورفولوجيا العضيات مثل D والشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا. لذلك دعونا نبدأ. بالنسبة لهذا البروتوكول ، نستخدم سلالتين مختلفتين من الخميرة.
CP one GFP عبارة عن سلالة ذات علامات GFP طرفي C ل ACP واحد ، والتي يتم إنشاؤها بواسطة إعادة تركيب متماثل بوساطة PCR باستخدام البلازميد PKT 1 28. خلفية الإجهاد هي BY 7 0 4 3. نستخدم أيضا سلالة DMA أو مصفوفة متحولة للحذف ، وهي عبارة عن مجموعة من حوالي 5،000 طفرة حذف للجينات غير الأساسية.
تم القضاء على كل هذه الجينات غير الأساسية في G four 18. خلفية الإجهاد للمصفوفة هي BY 47 41. للبدء في نمو آلان من ACP خلايا GFP واحدة عن طريق صب خمسة ملليلتر من ثقافة ACP واحدة بين عشية وضحاها على لوحة هسهسة.
اترك اللوحة تجف بدرجة كافية بواسطة اللهب أو في غطاء الدخان البيولوجي. بمجرد أن يجف ، احتضن الطبق عند 30 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، استخدم روبوتا لصفيف سلالة A CP one GFP إلى 1،536 مستعمرة لكل لوحة.
في الوقت نفسه ، قم بإعداد نسخة جديدة من DMA عن طريق تثبيت النسخة المتماثلة على YPDG أربع 18 لوحة. بعد ذلك ، احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية طوال الليل بعد نمو السلالات. صنع سلالة A CP one GFP مع DMA عن طريق تثبيت المستعمرات وتراكب المستعمرات على ألواح YPD ، واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
بعد لوحة النسخ المتماثلة للحضانة ، تقوم المستعمرات تحت SD همسة G بأربعة 18 لوحة من أجل اختيار الخلايا المنتشرة ، واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. من أجل بدء التبوغ والإنبات أول لوحة طبق الأصل ، فإن ثنائيات الصبغيات على YPDG أربعة 18 لوحة لزيادة كفاءة التبوغ في الخطوة التالية. بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية ليوم واحد من النسخة المتماثلة ، فإن ثنائي الصبغيات على وسائط Sporulation المحسنة ، والتي تحتوي على مستويات منخفضة من مصادر الكربون والنيتروجين للحث على تكوين جراثيم عضلية.
بعد ذلك ، احتضن الصفائح عند 25 درجة مئوية لمدة خمسة أيام على الأقل. بعد الحضانة تنبت الحصيرة ، ذرية عضلية عن طريق النسخة المتماثلة من المستعمرات على وسائط LRK. ستحفز هذه الوسائط على إنبات خلايا التابلويد من الجراثيم ، وتحتضن الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين من أجل اختيار الخلايا التي تحمل كل من أليل GFP والأليل المتحور الفردي.
يتم طلاء خلايا Matt A بالنسخ المتماثلة تحت وسائط Lade G four 18 ، والتي تختار خلايا haplo التي تحمل حذف الجينات ، وتحتضن هذه الصفائح عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اللوحة المتماثلة التالية ، الحصيرة ، ذرية انخفاضية على L-H-R-K-G أربعة وسائط 18 لاختيار نمو الطفرات الفردية. هذا أيضا يحتضن ACP واحد GFP بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية.
يمكن بعد ذلك تخزين الأطباق عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. من أجل تصور الطفرات المرغوبة التي تعبر عن CP واحد GFP مباشرة من اللوحة ، ابدأ باختيار المستعمرات المرغوبة من اللوحات. قم بتنمية الخلايا عند 30 درجة مئوية و YPD أو SD وسائط الهسهسة إلى مرحلة السجل المبكرة.
أخيرا ، تصور الطفرات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع مرشح GFP المحدد في هذه الصورة متحد البؤر ، تم تصور نوع متحور وبري مع ACP علامة GFP واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر لدراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا. يظهر هذا الطفرة الخاصة النمط الظاهري للميتوكوندريا المعطلة ، وبالتالي فهو مرشح جيد لمزيد من التحقيق. يجب أن نكون قد أوضحنا لك كيفية دمج علامة متعددة النسيلة بكفاءة ، CP واحد GFP في مصفوفة الحذف المتحولة باستخدام نظام آلي.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم جعل الوسائط طازجة والسماح للمكان بالحصول على وقت كاف حتى يجف. إذا كان هناك تكاثف رطب جدا ، فسوف يتراكم ، مما يزيد من فرصة التلوث. أيضا ، يجب عليك التحقق مرة أخرى من أن جميع وسائط التحديد قد تم إجراؤها بشكل صحيح لأنها مهمة لهذا البروتوكول.
يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لأنواع أخرى من العلامات. على سبيل المثال ، لتصور er ، نستخدم بشكل روتيني علامة الهواء 11 و GSP. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لإدخال علامات الـGFP الخاصة بالأعضاء الخلوية في ما يقرب من 5000 جين غير أساسي في الخميرة، مما يبسط عملية تصور شكل الأعضاء الخلوية. من خلال استخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين فحص الطفرات التي تؤثر على بنية الأعضاء الخلوية بشكل فعال.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الوراثة
الخلفية
- تعد بروتينات اندماج GFP أدوات أساسية لتصور الهياكل الخلوية.
- الطرق التقليدية لفحص الطفرات كثيفة العمالة.
- تعمل الخميرة ككائن نموذجي للدراسات الوراثية.
- تتيح الفحص المجهري المجسم تصويرًا مفصلاً للأعضاء الخلوية.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لإدخال علامات الأعضاء الخلوية بشكل متزامن.
- تسهيل فحص الطفرات التي تؤثر على شكل الأعضاء الخلوية.
- تعزيز كفاءة الدراسات الوراثية في الخميرة.
الطرق المستخدمة
- إعداد مصفوفة GFP واحدة من الخلايا المستزرعة.
- تزاوج مصفوفة GFP مع DMA لاختيار الثنائيات.
- تكوين الأبواغ للثنائيات في وسط محدد.
- مراقبة شكل الميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري المجسم.
النتائج الرئيسية
- الإدخال الناجح لعلامات الـGFP للأعضاء الخلوية في جينات الخميرة.
- الاستعادة الفعالة للخلايا أحادية الصيغة الصبغية مع التعديلات الجينية المطلوبة.
- تصور شكل الأعضاء الخلوية من خلال الفحص المجهري المجسم.
- عملية مبسطة لفحص الطفرات الجينية.
الاستنتاجات
- تخفض هذه الطريقة بشكل كبير الوقت المطلوب للفحص الجيني.
- توفر إطارًا قويًا لدراسة وظيفة الأعضاء الخلوية.
- يمكن تطبيق هذا النهج على العديد من الدراسات الوراثية في الخميرة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This high-throughput yeast organelle morphology method enables systematic interrogation of gene function in organelle biogenesis, supporting target validation in early discovery. By integrating robotic array handling with dual-marker selection, it delivers scalable, reproducible phenotypic data for mechanistic de-risking of genetic hits. The approach accelerates pathway mapping and prioritization of targets affecting mitochondrial or ER function in preclinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables genome-wide assessment of gene deletions on mitochondrial morphology to validate targets involved in organelle inheritance.
- Operational Value: Uses robotic pinning to process 4,672 mutants efficiently, reducing manual labor and increasing throughput.
- Predictive Value: Identifies genetic modifiers of organelle structure to de-risk targets early in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable organelle morphology readouts via confocal microscopy for assay standardization.
- Operational Value: Produces homozygous deletion strains with integrated GFP markers, ensuring consistent reporter expression across the array.
- Assay Readiness: Delivers arrayed haploid mutants ready for compound screening or genetic interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links yeast organelle phenotypes to conserved pathways relevant to human disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene function in organelle biogenesis to support target selection for preclinical validation.
- Pathway Elucidation: Maps genetic networks governing mitochondrial dynamics to inform mechanism-based compound screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification by providing organelle morphology data that informs target confidence and pathway relevance before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in organelle formation through systematic morphological profiling.
- Screening: Enables reproducible, array-based organelle imaging for high-content screening of genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Delivers imaging-based phenotypic readouts that allow comparison of mutant conditions to wild-type controls.
- Translational Research: Connects yeast organelle defects to conserved cellular processes with potential relevance to preclinical disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for organelle-wide phenotypic screening across multiple GFP-tagged markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking genotype to organelle phenotype at scale.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized robotic handling and dual-selection workflow.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel evaluation of thousands of genetic backgrounds.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted target prioritization based on organelle morphology phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, mating, sporulation, and fluorescent microscopy.
- Depends on robotic pinning systems and controlled incubation environments for array handling.
- Necessitates standardized media preparation and selection protocols to avoid contamination and ensure mutant recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different organelle markers (e.g., ER vs. mitochondria).
- Limited to non-essential gene backgrounds; essential genes require alternative approaches such as conditional alleles or CRISPRi.
