الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

تتيح هذه الإجراءات تحديد أنماط التعبير الجيني في أجنة أسماك zebrafish بدقة عالية، حيث يتم تهجين مسبار ribo مضاد للمعنى مع mRNA المستهدف المكمل. يتم التعرف على مسبار Ribo المسمى بواسطة جسم مضاد مقترن بإنزيم بيروكسيداز، ثم يُضاف fluoro four المقترن بالأراميد إلى الأجنة، ويقوم البيروكسيداز بتحويل IDE إلى مركب عالي التفاعل، مما يؤدي إلى ترسيب مستقر للـ fluoro four. بعد ذلك يتم غسل IDE غير المرتبط، مما يكشف عن النمط التفصيلي لتوزيع mRNA داخل الخلايا.

يمكن ملاحظة تعبير جين ثانٍ باستخدام مسبار مُعلم بشكل متميز وفلوروكومور مختلف، مما يسمح بإجراء مقارنة تفصيلية للتعبير الجيني. مرحبًا، أنا تيم برينت من مختبر سكوت هولي في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية والنمائية بجامعة ييل. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتهجين الموضعي المتألق المزدوج عالي الدقة لـ zebrafish embryos في كامل العينة في المختبر.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة التجزؤ في أسماك الزيبرا. لذا، دعونا نبدأ. ابدأ الإجراء باستخدام أجنة تم تثبيتها طوال الليل في البرودة باستخدام البارافورمالدهيد.

يعد استخدام مخزون تم إذابة تجميده حديثاً من البارافورمالدهيد في عملية التثبيت هذه أمراً بالغ الأهمية لنجاح الصبغ. قم بإزالة محلول التثبيت واغسل الأجنة في درجة حرارة الغرفة مرتين، ولمدة خمس دقائق في كل مرة، باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بإزالة غشاء الكوريون من الأجنة.

توضع الأجنّة في أطباق زجاجية مقعرة. وباستخدام ملقط الساعات، يتم سحب الغشاء الكوريوني من هذه النقطة فصاعداً. استخدم ماصة زجاجيةية مصقولة بالنار لنقل الأجنّة.

وإلا، فإن الأجنة ستلتصق برؤوس الماصات المصنوعة من البولي بروبيلين العادية. تُنقل الأجنة منزوعة الكلور عبر سلسلة من عمليات الغسيل بتركيزات متزايدة من الميثانول، على أن تكون الغسلة الأخيرة في ميثانول 100%.

وأخيرًا، تُوضع الأجنة في ميثانول جديد وتُخزن عند درجة حرارة 20- درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُنقل الأجنة عبر سلسلة من عمليات الغسيل بتركيزات متناقصة من الميثانول، مع غسلتين بمحلول PBST المنظم لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة باستخدام البارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة.

أنهِ عملية التثبيت القصيرة بغسلتين من محلول PBST لمدة خمس دقائق لكل منهما. نحن الآن مستعدون لنفاذ الأجنة. تصبح الأجنة المثبتة نفاذة عن طريق تحضينها مع البروتين ACE K. تأكد من وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على جانبه.

تعتمد مدة خطوة الهضم على عمر الجنين. فعلى سبيل المثال، يتم تحضين الأجنة في مرحلة تكون الجسيدات لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع دقائق. تُشطف الأجنة لفترة وجيزة في PBST ثم تُغسل مرة واحدة في PBST لمدة خمس دقائق.

قم بتثبيت الأجننة في البارافورمالدهيد. وأخيراً، اغسل الأجننة مرتين في محلول PBST لمدة خمس دقائق. أصبحت الأجننة الآن جاهزة للتهجين باستخدام مجسات RNA.

الآن بعد أن قمنا بتثبيت الأجنة وجعلها نفاذة، نبدأ عملية التهجين من خلال تحضين عالي السالب لمدة خمس دقائق عند 65 درجة Celsius. تذكر تسخين محلول HIIN مسبقاً قبل الاستخدام. بعد ذلك، يتم تحضين الأجنة في عالي الموجب لمدة ساعة واحدة.

تذكر مرة أخرى تسخين محلول high plus مسبقًا. الآن، قم بإزالة معظم محلول hip plus، مع ترك 50 µL، والتأكد من أن الأجنة مغمورة تمامًا. أضف 1 µL من كل مسبار وقم بالمزج عن طريق نقر الأنبوب برفق.

قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم من الآن فصاعداً. ونظراً لأن الفلوريسين حساس للضوء، يتم تحضين العينات طوال الليل عند 65 درجة Celsius، وبذلك تكتمل عملية التهجين. لذا، سنقوم الآن بإزالة المسابير الزائدة.

يتم التخلص من المنظف من أجل تحسين عملية التلوين. ومع ذلك، لاحظ أن الأجنة تصبح لزجة في غياب المنظف. اغسل مرتين باستخدام محلول 50% form amide two XSSC لمدة 30 دقيقة في كل مرة.

اغسل مرة واحدة ومرتين بمحلول 2X SSC لمدة 15 دقيقة. وأخيراً، اغسل مرتين بمحلول 0.2X SSC لمدة 30 دقيقة في كل مرة. بعد ذلك، سنقوم بتصوير كل مسبار.

يمكننا الآن البدء في الكشف عن المجسات المهجنة. يتم الكشف عن مجس الفلوريسين أولاً لأنه أقل استقراراً وأضعف من مجس dig oxygen. أولاً، يتم الحجب باستخدام 500 µL من كاشف الحجب بتركيز 2% في محلول منظم من حمض الماليك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد للفلوريسين المقترن بإنزيم البيروكسيداز بتخفيف 1 إلى 500 في محلول الحجب. حضّن المزيج طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. تأكد من وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بشكل أفقي.

بعد ذلك، ابدأ عملية الكشف باستخدام نظام تضخيم إشارة tyrom أو TSA TYROM IDE المرتبط بفلوروفور. يقوم إنزيم peroxidase الفجل الحار الموجود على الجسم المضاد بتحويل TY IDE إلى وسيط عالي التفاعل. يشكل TY IDE التفاعلي رابطة تساهمية مع البقايا الموجودة على مقربة من الجسم المضاد، مما يؤدي إلى ترسيب موضعي للفلوروفور.

ابدأ بأربع عمليات غسل لمدة 20 دقيقة باستخدام محلول حمض المالييك المنظم بتركيز 1x في درجة حرارة الغرفة، مع الغسل مرتين في PBS. تم إذابة fluorescein TY IDE مسبقاً في DMSO بغرض التخزين. قم بإجراء عملية طرد مركزي سريعة لهذه الركيزة TSA.

بعد ذلك، قم بتخفيف ركيزة TSA بنسبة 1 إلى 50 في محلول التخفيف للتضخيم. أضف المحلول إلى الأجنة واحضنها لمدة 45 دقيقة. ضع أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق على جانبه.

خلال خطوة الحضن هذه، قم بنقل الأجنة من خلال سلسلة من عمليات الغسيل لمدة 10 دقائق بتركيزات متزايدة من الميثانول. تكون الغسلة الأخيرة لمدة 10 دقائق في 100%Methanol، ثم يتم الحضن لمدة 30 دقيقة في محلول من 1%hydrogen peroxide لتعطيل بيروكسيداز الأجسام المضادة؛ وإلا فقد يتداخل ذلك مع الكشف عن dig oxygen.

يتم نقل الأجنة باستخدام المسبار عبر سلسلة من عمليات الغسيل بتركيزات متناقصة من الميثانول، مع غسلتين بمحلول PBS المنظم لمدة 10 دقائق لكل منهما. يضمن ذلك إزالة الميثانول بالكامل. يبدأ وسم الأجسام المضادة لـ dig xigen والمسبار بعملية الحجب كما هو الحال مع الجسم المضاد السابق.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد anti dig oxy genin بتخفيف 1 إلى 1000. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على جانبه واتركه للحضن طوال الليل في مكان بارد. في اليوم التالي، اغسل الأنبوب في درجة حرارة الغرفة باستخدام منظم حمض المالييك.

ثم باستخدام PBS quickpin، يتم تحضير ركيزة SCI five tyrom. خففها بنسبة 1 إلى 50 وأضفها إلى الأجنة. يتم التحضين لمدة 45 دقيقة مع وضع الأنبوب على جانبه.

أخيرًا، اغسل ثلاث مرات باستخدام PBST. وتعمل خطوة صبغ نهائية باستخدام prop iodide على وسم النوى. ابدأ بغسلتين لمدة خمس دقائق في two XSSC.

بعد ذلك، يتم المعالجة بـ RNAs لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. تُغسل ست مرات بمحلول two XSSC في درجة حرارة الغرفة، ثم يُضاف محلول propidium iodide وتُترك العينة للتصبغ لمدة ثماني دقائق. تُغسل ست مرات بمحلول two XSSC.

قم بتثبيت الأجنة في البارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة. وأخيراً، يتم الغسل مرتين في محلول PBST لمدة خمس دقائق في كل مرة. تبدأ عملية تثبيت الأجنة للعرض بـحضانتهما لمدة 10 دقائق مرتين في جليسيرول بتركيز 25% و50%.

بعد ذلك، ضع العينات في Glycerol بتركيز 75% وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. تهدف خطوة التصفية الليلية هذه إلى تسهيل عملية تشريح الأجنة. وأخيراً، قم بتشريح الأجنة وإزالة المح الكيس منها.

من أجل تقليل الفلورة الخلفية، يتم تثبيت الأجنة بشكل مسطح على شريحة مجهرية وفحصها تحت المجهر. تُظهر هذه الصور مقطعاً بؤرياً واحداً عبر الطرف الخلفي لجنين سمكة الزيبرا في مرحلة 10 somite. ويُظهر التصبيغ الأحمر وجود mRNA لـ delta C الذي تم الكشف عنه باستخدام مسبار مُعلم بـ dig oxygen وكاشف TSA sci-fi.

يمثل التلوين الأخضر mRNA الخاص بها والذي تم اكتشافه بواسطة مسبار مُسمى بالفلوريسين. وكاشف TSA fluorescein، بينما تظهر النوى المصبوغة بـ propidium iodide باللون الأزرق في الجنين المصبوغ مزدوجاً.

يمكن تحديد مناطق التعبير المتميزة أو المتداخلة بشكل لا لبس فيه. ويكشف هذا الإجراء عن التموضع تحت الخلوي لـ mRNA كما يظهر في هذه المشاهد المقربة لصبغة her one. ويظهر النسخ النشط للجين من خلال نقاط الصبغ في النواة.

تُظهر خلايا أخرى تموضعاً سيتوبلازمياً للـ mRNA. وفي الجنين المصبوغ صبغاً مزدوجاً، يمكننا رؤية خلايا تنسخ كلا الجينين أو أياً منهما.

وبشكل منفصل، لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إجراء التهجين الموضعي الفلوري المزدوج عالي الدقة على كامل جسم أجنة سمك الزيبرفيش. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أننا نقوم أولاً باختبار المسابير الخاصة بنا باستخدام مسابير التلوين القياسية التي تتوسطها الفوسفاتاز القلوية؛ فالمسابير التي تعطي إشارة نظيفة وقوية ستعمل بشكل جيد في التهجين الموضعي الفلوري.

لقد استخدمنا أيضاً بنجاح التحديد المناعي لموضع beta catenin بدلاً من الصبغ بـ propidium iodide. وعند تنفيذ هذا التباين، نقوم بإجراء تفاعلات التهجين عند 55 درجة مئوية بدلاً من 65. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.