التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

نقدم نظاماً لاستزراع السلائف العصبية للجهاز العصبي المركزي أثناء تطورها وتمايزها إلى عصبونات ودبق ناضجين. تبدأ الإجراءات بعزل أربعة أدمغة من أجنة جرذان في المرحلة E 16 وهضمها باستخدام البروبان. ثم يتم تحويل الأنسجة إلى معلق من الخلايا المفردة، وتصفيته، وعدّها، وتوزيعها في ستة.

يتم إعادة تعليق الخلايا في أطباق الزرع بلطف مرة واحدة يومياً لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للسماح بتكوين التجمعات الخلوية. بعد ذلك، يتم جمع التجمعات ونخلها عبر غربال بقطر 200 micrometer، مع إزالة التكتلات الصغيرة وبقايا الخلايا عن طريق الغسل. وأخيراً، يتم عد التجمعات وزرعها على شرائح غطاء زجاجية مطلية بـ matrigel.

مرحباً، أنا كوتو من مختبر الدكتور جون لـ في قسم العلوم الحيوية البيطرية المتكاملة في جامعة تكساس إي آند إم. سنعرض لكم اليوم إجراءً لزراعة تجمعات دماغية. نستخدم هذا الإجراء في مستوانا الثالث لدراسة سلالة الخلايا الداخلية، وتطور الخلايا والتفاعلات المتسارعة.

لنبدأ الآن. قبل البدء، جهز على طاولة المختبر أدوات معقمة، وإيثانول 70%، ووسادة امتصاص (diaper pad) للعمل عليها، وأطباق بتري بقطر 10 سنتيمتر للتشريح، ووسطاً موضوعاً على الثلج.

داخل خزانة الأمان الحيوي، قم بتجهيز مجهر تشريحي مزود بمنصة ثلجية وعدة أطباق بقطر 10 سنتيمتر تحتوي على وسط تشريحي موضوعة أيضًا على الثلج. وأخيرًا، قم بتحضير المحاليل التي ستستخدمها وقم بتسخين وسط الزرع إلى 37 درجة في حمام مائي. تبدأ هذا البروتوكول بجمع أجنة في اليوم الجنيني 16 E 16 من جرذ Sprague dolly.

أولاً، يتم القتل الرحيم لأنثى حامل وفقاً للإجراء المعتمد من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. ضع الجرذ بعد القتل الرحيم على وسادة حفاضات وقم برش منطقة البطن بالكحول لتنظيفها. بعد ذلك، استخدم الملاقط لقرص جلد البطن، وباليد الأخرى، استخدم المقص لقص الجلد فقط، ثم باعد بين طيتي الجلد، واستخدم مجموعة أخرى من الملاقط والمقصات المعقمة لقص الطبقة العضلية.

بعد ذلك، قم بإزالة الرحم ونقله إلى طبق سعة 10 سنتيمتر يحتوي على وسط تشريح مبرد بالثلج. يتم تنفيذ الخطوة التالية داخل خزانة التدفق الصفائحي باستخدام مقصات التشريح الدقيق. قم بإزالة كل جنين بعناية من الرحم.

حان الوقت الآن للجمع والبدء. تعامل مع الأدمغة الجنينية. اجمع الدماغ من كل جنين وضع الأدمغة المحررة في طبق نظيف بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على وسط التشريح فوق منصة ثلجية. أكمل عملية تشريح الأدمغة تحت مجهر التشريح.

قم بإزالة أقسام الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي. استخدم ملقطاً دقيقاً لإزالة السحايا، ثم انقل ما تبقى من الدماغ الأمامي إلى أنبوب فالكون سعة 50 ملليلتر يحتوي على وسط التشريح. الآن أصبح النسيج جاهزاً للخطوة التالية.

تفكيك الخلايا عن طريق الهضم الإنزيمي. قبل البدء في عملية الهضم مباشرة، قم بتحضير محاليل جديدة من البروتين ومثبط التربسين المرشح. قم بتعقيمها وتدفئتها حتى 37 °C في حمام مائي.

أزل الوسط الزائد من الأدمغة التي تم تشريحها. ثم أضف 4 mL من محلول هضم البروتين المُحضّر إلى أنبوب سعة 50 mL. قم بحضن الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس دقائق بالضبط.

عند انتهاء الوقت، استخدم ماصة لإزالة محلول البروبان. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من محلول مثبط التريpsin المحضر حديثاً وضع الأنبوب مرة أخرى في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية. عند انتهاء الوقت، قم بإزالة محلول مثبط التريpsin.

كرر عملية الحضن مع محلول مثبط التربسين ثلاث مرات إضافية. بعد إزالة محلول مثبط التربسين للمرة الأخيرة، أضف 20 milliliters من وسط الزرع pm الدافئ إلى الأنبوب.

حان الوقت الآن لترويق الخلايا وغسلها. قم بترويق الخلايا باستخدام ماصة سعة 10 milliliter حتى تختفي جميع التكتلات، وذلك بالتكرار من 20 إلى 30 مرة تقريبًا. بعد ذلك، قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 100 GS لمدة سبع دقائق.

في هذه المرحلة، يجب أن تكون الخلايا منفصلة جيداً عن بعضها البعض. بعد مرور سبع دقائق، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الراسب في 10 milliliter من وسط الزرع لغسل الخلايا.

ثم قم بطردها مركزياً مرة أخرى. تخلص من السائل الطافي وكرر عمليتي الغسيل والطرد المركزي. هذه هي الخطوة التي تلي الغسلة الثانية.

أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط زراعة التجمعات، ثم مرر الخلايا عبر منخل خلايا بقطر 70 micrometer. وأخيرًا، قم بعد الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

والآن أصبحت مستعداً للسماح للخلايا الدماغية المفككة بتكوين تجمعات. بعد العد، قم بتعليق الخلايا المفككة في وسط استزراع التجمعات بكثافة 2 × 10⁶ خلية/ملل. انقل 2 ملل من معلق الخلايا إلى كل بئر في طبق استزراع بست آبار غير مطلي.

لمدة ثلاث ليالٍ، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق كل يوم. وبمجرد استخدام ماصة P 1000، ستبدأ الخلايا في تكوين تجمعات في يوم زراعة التجمعات. وبعد نمو الخلايا لمدة ثلاث ليالٍ، أعد تعليق الخلايا برفق مرة أخرى وقم بتصفية المعلق من خلال شبكة بقطر 200 ميكرومتر إلى أنبوب فالكون سعة 50 ملليلتر.

اترك التجمعات تترسب في قاع الأنبوب لمدة تتراوح بين ثلاث إلى خمس دقائق تقريباً. ثم قم بإزالة الطافي بعناية، وأضف الوسط، وأعد تعليق التجمعات بلطف واتركها تترسب مرة أخرى. كرر هذا الإجراء عدة مرات.

لإزالة الخلايا الميتة والخلايا الفردية والحطام الخلوي، استخدم المجهر للتحقق مما إذا كانت السوائل الطافية لا تزال تحتوي على خلايا غير متجمعة وحطام. وبمجرد غسل التجمعات جيداً، أعد تعليقها بلطف في الوسط نفسه وقم بعد التجمعات لتحديد تركيزها. بعد ذلك، اضبط كثافة التجمعات لتكون حوالي 25 إلى 30 تجمعاً لكل 50 microliters.

حان الوقت الآن لاستزراع التجمعات الخلوية على شرائح التغطية. انقلي حصصاً بحجم 1000 µL من معلق التجمعات الخلوية إلى أنابيب Eppendorf سعة 2 mL؛ وبما أن التجمعات تميل للترسب في قاع الأنابيب، فمن الضروري تحضير أنابيب متعددة من معلق التجمعات الخلوية لعملية الزرع. أما شرائح التغطية المستخدمة في هذه الخطوة، فقد تم طلاؤها بـ matrigel، وهو ركيزة للزراعة الخلوية، عن طريق التحضين طوال الليل عند 37 °C.

بعد إعداد توزيعات معلقة التجمعات، أخرج طبق الزرع الذي يحتوي على شرائح التغطية المغطاة بالماتريجيل من الحاضنة. قم بإزالة المحلول من كل بئر، واغسل شرائح التغطية باستخدام PBS دافئ ثم DD H2O.

أصبحت العينات الآن جاهزة لعملية استزراع التجمعات (aggregate seeding) من أجل توزيع هذه التجمعات على غطاء الشريحة. اقلب أنبوب معلق التجمعات لخلطها وتوزيعها بشكل متساوٍ، ثم ضع 50 µL من معلق التجمعات في مركز كل غطاء شريحة.

أعد الطبق برفق إلى الحاضنة دون أي تحريك إضافي للسماح للتجمعات بالالتصاق بالتساوي بلاميلا التغطية. تُعد كثافة التجمعات أمراً حاسماً، فإذا كانت التجمعات متقاربة جداً من بعضها البعض أو إذا كانت كثافة التوزيع عالية، فإنها تميل إلى الاندماج معاً أثناء نموها بعد مرور أربع إلى ست ساعات من التوزيع الأولي. أضف 500 µL من وسط الزرع إلى كل بئر.

للحفاظ على استنبات التجمعات الخلوية، استبدل نصف كمية الوسط الغذائي كل ثلاثة إلى أربعة أيام. عند تغيير الوسط، أضفه على طول الجدار الجانبي للبئر لتجنب تشتيت التجمعات. بعد بضع ساعات من التصاق التجمعات بغطاء الشريحة، يمكن ملاحظة نمو نتوءات من التجمعات.

تنمو المحاور العصبية بسرعة في أول أسبوعين وتُشكل اتصالات وفيرة بين التجمعات. تهاجر سلائف Ggl شعاعياً خارج التجمعات وتتمايز بمرور الوقت إلى خلايا نجمية وخلايا دبقية قليلة التغصن ناضجة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية زراعة تجمع CS.

عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر تقدير السعة بشكل صحيح وتقليب المزيج بالتساوي. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.