يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

يستخدم الفحص المجهري للبقع الفلورية لاستكشاف ديناميكيات بروتينات الهيكل الخلوي المختلفة في الخلايا الحية. عند استخدامها بشكل صحيح ، يمكن إجراء قياسات كمية لسرعة وحركية دوران بروتينات الهيكل الخلوي. نبدأ هذا الإجراء عن طريق الحقن الدقيق لكمية صغيرة من الأكتون المسمى بالفلورسنت في الخلايا الحية.

ثم نقوم بتجميع غرفة التصوير لتقليل آثار التبييض الضوئي. يتم وضع أول قطعتين من الشريط على الوجهين على جانبي الشريحة الصغيرة حيث ستستقر زلة غطاء الخلية. ثم يتم سحب وسائط التصوير في الغرفة عن طريق توزيع الوسائط بالقرب من إحدى الشقوق المفتوحة.

أخيرا ، جميع الجوانب الأربعة مختومة بخادم السيارات. مرحبا ، اسمي جيمس ليم ومختبر جالدن ديوسر في قسم بيولوجيا الخلية في معهد سكريبس للأبحاث. سنعرض لكم اليوم إجراء على الفحص المجهري للبقع الفلورية.

نستخدم هذا الإجراء لاستكشاف ديناميكيات أكتون في ترحيل الخلايا الظهارية. لذلك دعونا نبدأ. أحد المكونات الرئيسية للحصول على أفلام الفحص المجهري الفلورية الجيدة هو وضع العلامات المناسبة على أكتون باستخدام الفلورو أربعة من اختيارك ، نوصي باستخدام أربعة فلورو من Alexa و X rodine cin، وهي مشتقات إستر الوسطى التي تستهدف بقايا اللايسين المكشوفة على سطح أكتون.

من المهم أن تكون نسبة الملصقات عالية حوالي 0.3 إلى 0.7 صبغة لكل مونومر من الأكتون لضمان ظهور البقع ساطعة وسرية قبل التخزين طويل الأجل. قم بتوضيح محلول Acton المسمى عن طريق الطرد المركزي عند 75،000 إلى 80،000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يجب تخزين Acton المسمى في محلول عازلة G عند سالب 80 درجة مئوية.

أعد حصتين من الميكرولتر لتجنب الذوبان المتكرر بالتجميد ، مما قد يؤدي إلى مجاميع غير قابلة للذوبان. لتجنب تبييض الصور لأربعة الأزهار ، لا تعرض محلول الأكتين المسمى للضوء المباشر لفترات طويلة من الوقت واستخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة غير الشفافة للوحة التخزين طويلة الأجل. خلايا الحقن المجهري على انزلاق غطاء زجاجي مربع مغسول بالحمض.

يمكن تطبيق طلاء الركيزة القياسي على زلة الغطاء ولن يؤثر على الحقن المجهري. قم بتخزين الخلايا عند 37 درجة أثناء تحضير الأكتين لاختيار الخلايا القابلة للحقن المجهري. بالنسبة إلى FSM ، ضع في اعتبارك هذه المعايير.

يجب أن تكون الخلايا كبيرة ، وقطرها أكبر من 50 ميكرومتر يجب أن تنتشر بشكل مسطح مطلي وتكون ملتصقة بشكل طبيعي بالركائز. من المفيد أيضا أن يحتل موقع الخلية مساحة أكبر من مساحة نواتها. تشمل بعض خطوط الخلايا المناسبة PTK one وخلايا الرئة نيوت والخلايا العصبية AIA.

في هذا العرض التوضيحي ، سنقوم بحقن PTK واحدة من الخلايا الظهارية. يعتمد الاختيار الصحيح لإبر الحقن المجهري على حجم فتحة الطرف. عادة ، يمكن أن تختلف أحجام الثقوب من 0.5 ميكرومتر إلى ثلاثة ميكرومترات.

نوصي بحجم فتح مثالي يتراوح بين 0.5 إلى ميكرومتر واحد. لحقن أكتون الإبر الحقن المجهري يمكن إما شراؤها أو صنعها. إذا كان مجتذب الإبرة التجاري متاحا للمبتدئين ، فإننا نوصي بوجود 10 إلى 20 إبرة مسحوبة في متناول اليد قبل البدء في إجراء الحقن.

الخطوة التالية هي تخفيف الأكتون المسمى بمحلول حقن الثلج البارد. احتفظ بجميع حلول العمل على الجليد. يتراوح تركيز الحقن المثالي ، وهو التركيز النهائي للأكتون المحمل في الإبرة ، بين 0.5 إلى ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.

بناء على نسبة وضع العلامات بنسبة 40٪ من D إلى مونومر الأكتين ، 0.5 إلى ميكرولتر واحد من محلول الأكتين المخفف. باستخدام إبرة حقنة صغيرة ، قم بتوزيع محلول أكتون بعناية. حاول تجنب الفقاعات.

إذا كانت هناك فقاعات ، فيمكن إزالتها بسهولة عن طريق امتصاص السوائل الزائدة المحيطة بالفقاعة. تأكد من أن محلول أكتون يستقر تماما عند طرف الإبرة. لا ينبغي أن يكون هناك محلول زائد في أي مكان على طول الشعيرات الدموية للإبرة لأنه يمكن أن يعطل تدفق الحقن.

الإبرة المحملة جاهزة الآن ليتم توصيلها بحامل الحقن للحقن المجهري. استرجع خلاياك من الحاضنة وضع زلة الغطاء على مرحلة المجهر. لبدء إجراء الحقن المجهري ، خذ الإبرة المحملة إلى المجهر.

قم بتوصيل الإبرة بعناية لتجنب ملامسة طرف الإبرة بحامل الحاقن. ضع الحامل بحيث تصنع الإبرة زاوية 35 إلى 50 درجة لقاعدة مرحلة المجهر. اخفض طرف الإبرة حتى بالكاد يكسر سطح الاستحمام الإعلامي.

تضع خلاياك الآن طرف الإبرة بحيث يستقر مباشرة فوق مركز الهدف. إذا كان طرف الإبرة محاذاة مع الهدف ، فيجب أن ترى هالة ساطعة من خلال العدسة. هذه هي نهاية طرف الإبرة.

قد يساعد تحريك الإبرة ببطء من جانب إلى آخر في تحديد موقع الهالة بشكل أفضل. عند التنقل ، تأكد من أن طرف الإبرة أعلى بكثير من خلاياك. لمنع كسر طرف الإبرة، اضبط Z.Focus على المجهر حتى تصبح خلاياك في رؤية واضحة.

ثم قم بخفض طرف الإبرة ببطء مع التحكم في التركيز حتى تنقبض الهالة تدريجيا وتتلاقى أخيرا في طرف الإبرة. يمكنك أيضا البحث عن عمود الإبرة ، والذي سيلقي بظلال خطية. سيؤدي خفض الإبرة إلى تحديد عمود الإبرة تدريجيا.

قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة على حلقة الطور لتحسين التباين ، يجب أن تكون نهاية الإبرة وخلاياك الآن في مرأى واضح. عند اختيار الخلايا لحقن الخلايا ذات الحواف الحرة يجب أن تواجه طرف الإبرة. سيضمن ذلك أن المنحدر المتناقص للخلية من النقطة السميكة حيث توجد النواة إلى أنحف نقطة في الحافة الأمامية سيجتمع مع طرف الإبرة بدلا من الجري بالتوازي معه.

اضبط ضغط الإبرة على 0.3 إلى 0.8 رطل لكل بوصة مربعة. سيؤدي الضغط المستمر المطبق إلى تدفق ثابت لمحلول الأكتون. عندما تقرر خلية للحقن ، ضع الإبرة بحيث يكون الطرف بجوار نواة الخلية ببطء ، وقم بخفض موضع الإبرة وأعد ضبط موضع الإبرة حتى يصبح الطرف منخفضا.

الغشاء بخفض الإبرة بشكل تدريجي حتى يخترق طرفها الغشاء. إذا اخترقت الإبرة الغشاء بالكامل ، فستظهر الخلية أكثر إشراقا. بمجرد أن ترى هذا التغيير ، ارفع الإبرة حتى لا تلمس الخلية.

ستستغرق عملية الثقب والحقن الفعلية من 0.5 إلى ثانيتين. عند القيام بذلك بشكل صحيح ، سيظهر شكل الخلية دون تغيير. لتقليل الضغط على الخلايا ، لا تنفق أكثر من 20 إلى 45 دقيقة لكل جلسة حقن مجهري.

في بعض الأحيان قد لا ترى تغييرات في الخلية عند الحقن ولا تصبح الخلية أكثر إشراقا. يشير هذا إلى أن طرف الإبرة قد يكون مغلقا. يمكنك اختبار ذلك بالضغط على زر التنظيف إذا كان متاحا في الحاقن العابر.

إذا كان طرف الإبرة مفتوحا ، فسيؤدي ذلك إلى زيادة تدفق الضغط المستمر بشكل كبير ، والذي يمكن رؤيته على أنه تموجات وتشتت الحطام القريب. إذا كان طرف الإبرة مغلقا ، فيمكنك إما إدخال إبرة حقن دقيقة جديدة أو محاولة كسر طرف الإبرة عن طريق خفض الإبرة برفق حتى يضغط طرف الإبرة على زلة الغطاء الزجاجي. مما يتسبب في كسر نهاية الحافة.

يجب ألا تزيد منطقة الكسر عن خمس مساحة نقطة الإبرة ، وهو جزء الإبرة الذي يبدأ في التقارب إلى نقطة عند انتهاء الحقن المجهري. استبدل وسائط الخلية في الطبق بوسائط التسخين الطازجة لإزالة أي بقايا فلورسنت. بعد تغيير الوسائط ، اسمح للخلايا بالتعافي لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة قبل التصوير.

سيسمح هذا أيضا للأكتين بالاندماج في شبكة الهيكل الخلوي الحالية أثناء تعافي الخلايا في الحاضنة ، والبدء في تجميع غرفة التصوير. قم أولا بتسخين وسائط التصوير مسبقا في حمام مائي بزاوية 37 درجة. الذوبان التالي ، يتم مسح 15 ميكرولتر من أوكسا في درجة حرارة الغرفة.

ستؤدي إضافة RA إلى الوسائط لاحقا إلى تقليل تأثيرات التبييض الضوئي بشكل كبير. سيضمن الحفاظ على محو الأوكسا ملفوفا بورق الألمنيوم حماية المركب الحساس للصور من الضوء. قم بتسخين مانع التسرب VAP مسبقا على لوح ساخن مضبوطة على درجة حرارة منخفضة ، ولا تسخن أو تحرق vap ، وإلا ستفقد فعاليته كمادة مانعة للتسرب.

امسح شريحة صغيرة بمنديل كيم مغموس بالإيثانول النقي لتنظيف وإزالة الحطام الصغير. قم بتكديس طولين متساويين الحجم ، بطول 2.5 سم من الشريط على الوجهين فوق بعضهما البعض باستخدام سطح مستو نظيف مثل شريحة صغيرة أخرى. كمنصة ، اضغط على أي فقاعات هواء محاصرة لإنشاء طائرة مسطحة تماما.

بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة لقطع شريطين مستقيمين على طول المحور الطويل للشريط بحيث يبلغ عرض كل شريط 0.5 سم. باستخدام الملقط ، ضع كل شريط على طول الحواف الطويلة للشريحة الصغيرة بحيث يخلق شريطان من الشريط فجوة في وسط الشريحة الصغيرة. اضغط برفق على الشريط لعمل ختم لطيف بالزجاج.

ستعمل شرائط الشريط هذه كفواصل بين الشريحة الصغيرة وزلة الغطاء. تحقق من الصمام للتأكد من أنه سائل تماما. قبل أن تبدأ الخطوة التالية ، استرجع وسائط التصوير الدافئة مسبقا.

أضف 15 ميكرولترا من أشعة الأوكسجين لكل 500 ميكرولتر من الوسائط. قم بطي مسح كيميائي في مثلث لإنشاء ثلاثة حواف صلبة. سيتم استخدام هذا لمسح زلة الغطاء لاحقا.

استرجع الخلايا من الحاضنة باستخدام الملقط. التقط زاوية من زلة الغطاء بسرعة. ضع زلة الغطاء على منديل كيم بحيث يكون جانب الخلية متجها لأعلى ولا يلمس المنديل ، واستخدم مناديل كيم المطوية لمسح جانبين متقابلين من زلة الغطاء لإنشاء سطح شبه جاف.

ثم التقط زاوية من زلة الغطاء بالملقط وضع زلة الغطاء على الشريحة الصغيرة بحيث يتم محاذاة الأسطح الجافة مع شريطي الشريط. لاحظ الآن أن لديك جانبين مغلقين وشقين مفتوحين. قم بسحب 200 ميكرولتر من محلول RA لوسائط التصوير ببطء بالقرب من فتحة واحدة.

من المهم عدم إدخال أي فقاعات هواء. يجب امتصاص المحلول في الغرفة المجمعة حديثا بواسطة قوى الشعيرات الدموية ، وبالتالي غمر خلاياك بالكامل في المحلول. باستخدام قطعة قطن ، امسح الزوايا الأربع لزلة الغطاء باستخدام vap المذاب لتثبيت زلة الغطاء وتثبيتها بسرعة.

ستلاحظ أن VAP يجف في غضون ثوان في درجة حرارة الغرفة. ثم بدءا من الجوانب المغلقة ، ضع شريطا رفيعا من VAP باستخدام قطعة قطن وتقليد ضربة بالفرشاة. كرر للجوانب المفتوحة.

قم ببناء طبقة vap ببطء ، مع تعزيز الختم عن طريق تكرار خطوات الطلاء. يجب أن يقتصر VAP على الحواف مع ترك مركز الغطاء واضحا. بعد إغلاق حواف زلة الغطاء، قم بتنظيف الجزء الأوسط من زلة الغطاء برفق باستخدام طرف Q مع DD H2O لإزالة أي وسائط متبقية.

احرص على عدم سحق الخلايا. كرر خطوة التنظيف هذه باستخدام الإيثانول النقي. لديك الآن غرفة تصوير مغلقة بالكامل محسنة لتصوير البقع الفلورية.

إن وجود حاوية محكمة الغلق بالكامل سيمنع الأزهار من التبييض الضوئي بسرعة. أصبحت الخلايا الموجودة في الغرفة المغلقة بالكامل جاهزة الآن للتصوير. نستخدم مجهر المجال الواسع المقلوب مع مصباح الزئبق ، ومصباح epi ، والمرشحات المناسبة ، وخطة الغمر بالزيت.

يتم التقاط صور الأهداف الملفقة باستخدام كاميرا CCD مبردة بدقة 6.7 ميكرون بكسل وبرنامج للحصول على الصور. قم بتسخين مرحلة المجهر إلى 37 درجة. ضع غرفة التصوير وانتظر من 10 إلى 15 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة قبل التصوير.

بمجرد استقرار درجة الحرارة ، ركز خلاياك في المجال الساطع ثم ابحث عن الخلايا المحقونة عن طريق تبديل إعدادات الفلورسنت الصحيحة. حاول تقليل وقت التعرض للمضان لتقليل التبييض الضوئي. ابحث عن الخلايا المحقونة ذات الحواف الأمامية السليمة والمنحنية.

ستتميز الخلايا المحقونة بحواف متراجعة وخشنة تشبه العديد من نباتات الشعبة. لا تقم بتصوير هذه الخلايا. تعتمد إعدادات الاستحواذ على نوع الخلية وجودة مكونات الأكتون والمجهر المسمى.

ومع ذلك، يجب ألا تزيد إعدادات التعريض الضوئي عن ثانيتين ويجب ضبط الفاصل الزمني بين الإطارات بين خمس و10 ثوان. يمكن تشغيل إعدادات الكسب على الكاميرا لزيادة الإشارة إلى الضوضاء. يجب أن تحتوي خصائص البقع المثالية على كل بقعة متباعدة بقطرين من البقع تقريبا إلى البقع المجاورة التالية.

بالنسبة للخلايا الظهارية ، ستظهر شبكة الأكتين المرقطة متجانسة. مع انتشار البقع بالتساوي. يجب ضبط إعدادات التعريض الضوئي للحصول على أفضل الصور المرقطة.

مفتاح الحصول على أفلام البقع الجيدة هو الحفاظ على التركيز. هذا مهم بشكل خاص للتحليل اللاحق الذي يتضمن قياسات تدفق البقع ودورانها. وبالتالي ، فإن جودة التحليل الكمي ستعتمد على تثبيت التركيز طوال فترة الفاصل الزمني.

تم تفصيل الاستراتيجيات المختلفة للحفاظ على التركيز في النص الخاص بهذا العرض التوضيحي باستخدام نظام التركيز البؤري Perfect من نيكون. فيما يلي أمثلة مختلفة للخلايا المحقونة الدقيقة. تظهر اللوحة اليسرى خلية محقونة تحت الصغر مع صورة بقع منخفضة التركيز.

تظهر اللوحة الوسطى خلية محقونة أكثر من الصغر مع صورة بقع عالية التركيز ، وتظهر اللوحة اليمنى خلية محقونة على النحو الأمثل. ل FSM مع صورة بقع جيدة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية الحقن الدقيق للأكتون المسمى بالفلورسنت في الخلايا الظهارية للفحص المجهري للبقع الفلورية.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم للغاية أن تتذكر أن جودة الأكتون المسمى ، بالإضافة إلى تقنية الحقن المجهري ، ستحدد الجودة الإجمالية لصور البقع الخاصة بك. هذا كل شيء ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.