يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

يُستخدم مجهر البقع الفلورية لسبر ديناميكيات مختلف بروتينات الهيكل الخلوي في الخلايا الحية. وعند استخدامه بشكل صحيح، يمكن إجراء قياسات كمية لسرعة وحركية تجدد بروتينات الهيكل الخلوي. نبدأ هذا الإجراء بالحقن المجهري لحجم صغير من الأكتين المسمى فلورياً في الخلايا الحية.

نقوم بعد ذلك بتجميع غرفة التصوير لتقليل آثار التبييض الضوئي. أولاً، يتم وضع قطعتين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على كلا جانبي الشريحة المجهرية حيث ستستقر شريحة التغطية الخلوية. ثم يتم نقل وسط التصوير إلى الغرفة باستخدام الماصة عن طريق توزيع الوسط بالقرب من إحدى الفتحات المفتوحة.

أخيرًا، يتم ختم جميع الجوانب الأربعة باستخدام Parafilm. مرحبًا، اسمي جيمس ليم من مختبر جالدن ديوسر في قسم بيولوجيا الخلية بمعهد سكريبس للأبحاث. سنعرض لكم اليوم إجراءً حول مجهر البقع الفلورية.

نستخدم هذا الإجراء لاستقصاء ديناميكيات الأكتين في الخلايا الظهارية المهاجرة. لذا، فلنبدأ. إن المكون الأساسي للحصول على مقاطع فيديو جيدة باستخدام مجهر البقع الفلورية هو التوسيم الصحيح للأكتين باستخدام الفلوروفور الذي تختاره؛ ونوصي باستخدام فلوروفورات Alexa و Rhodamine، وهي مشتقات إستر لـ NHS تستهدف بقايا الليسين المكشوفة على سطح الأكتين.

من المهم أن تكون نسبة الوسم عالية، بحيث تتراوح بين 0.3 إلى 0.7 صبغة لكل مونومر من acton، لضمان ظهور البقع ساطعة ومنفصلة قبل التخزين طويل الأمد. يتم تصفية محلول Acton الموّسم عن طريق الطرد المركزي بسرعة تتراوح من 75,000 إلى 80,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. يجب تخزين Acton الموّسم في محلول G buffer عند درجة حرارة -80 °C.

قم بإعداد حصص مقدارها 2 µL لتجنب التجميد والإذابة المتكررين، واللذين قد يؤديان إلى تكوين تجمعات غير ذائبة. ولتجنب التبييض الضوئي لفلوروفورات، لا تعرض محلول الأكتين المسمى للضوء المباشر لفترات طويلة، واستخدم أنابيب طرد مركزي دقيقة معتمة للتخزين طويل الأمد. ضع الخلايا المخصصة للحقن المجهري على شرائح زجاجية مربعة مغسولة بالحمض.

يمكن تطبيق طلاء الركيزة القياسي على الشريحة الغطائية ولن يؤثر ذلك على الحقن المجهري. تُحفظ الخلايا عند 37 درجة أثناء تحضير الأكتين لاختيار الخلايا القابلة للحقن المجهري. بالنسبة لـ FSM، ضع هذه المعايير في الاعتبار.

يجب أن تكون الخلايا كبيرة، بحيث يتجاوز قطرها 50 micrometers، وأن تنبسط بشكل مسطح عند وضعها في الطبق وتكون ملتصقة طبيعياً بالركائز. ومن المفيد أيضاً أن يشغل السيتوبلازم في الخلية مساحة أكبر من مساحة نواتها. وتشمل بعض الخطوط الخلوية المناسبة PTK1، وخلايا رئة السلمندر، وعصبونات AIA.

في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بحقن PTK في الخلايا الظهارية. يعتمد الاختيار الصحيح لإبر الحقن المجهري على حجم فتحة الطرف. وعادةً ما تتفاوت أحجام الفتحات من 0.5 µm إلى ما يصل إلى 3 µm.

نوصي بأن يكون حجم الفتحة الأمثل بين 0.5 و1 ميكرومتر. وبالنسبة لحقن Acton، يمكن إما شراء إبر الحقن المجهري أو تصنيعها. وفي حال توفر جهاز سحب إبر تجاري، نوصي المبتدئين بتجهيز من 10 إلى 20 إبرة مسحوبة قبل البدء في إجراء الحقن.

الخطوة التالية هي تخفيف الـ acton الموسوم باستخدام منظم حقن (injection buffer) مبرد بالثلج. يجب الاحتفاظ بجميع المحاليل التشغيلية على الثلج. يتراوح تركيز الحقن المثالي، وهو التركيز النهائي لـ acton المحمل في الإبرة، ما بين 0.5 إلى 1 µg/µL.

بناءً على نسبة وسم تبلغ 40% من D إلى حمولة مونومر الأكتين، قم بتحميل 0.5 إلى 1 ميكرولتر من محلول الأكتين المخفف. وباستخدام إبرة سرنجة دقيقة، قم بتوزيع محلول الأكتين بعناية، مع محاولة تجنب تكون الفقاعات.

في حال وجود فقاعات، يمكن إزالتها بسهولة عن طريق سحب السوائل الزائدة المحيطة بالفقاعة. تأكد من استقرار محلول Acton تماماً عند طرف الإبرة. يجب ألا يكون هناك محلول زائد في أي مكان على طول الشعيرة الخاصة بالإبرة لأن ذلك قد يؤدي إلى تعطل تدفق الحقن.

أصبحت الإبرة المُحمّلة الآن جاهزة للتثبيت في حامل الحقن لإجراء الحقن المجهري. استخرج الخلايا من الحاضنة وضع شريحة الغطاء على منصة المجهر. لبدء إجراء الحقن المجهري، انقل الإبرة المُحمّلة إلى المجهر.

قم بتثبيت الإبرة بعناية في حامل المحقن مع تجنب ملامسة طرف الإبرة. ضع الحامل بحيث تشكل الإبرة زاوية تتراوح بين 35 إلى 50 درجة مع قاعدة منصة المجهر. اخفض طرف الإبرة حتى يخترق سطح الوسط المغمر بالكاد.

تقوم الخلايا الآن بتحديد موضع طرف الإبرة بحيث يستقر مباشرة فوق مركز العدسة الشيئية. إذا كانت نهاية الإبرة محاذية للعدسة الشيئية، فمن المفترض أن ترى هالة مضيئة من خلال العدسة العينية، وهذا هو طرف الإبرة.

قد يساعد تحريك الإبرة ببطء من جانب إلى آخر في تحديد موقع الهالة بشكل أفضل. عند التنقل، تأكد من أن طرف الإبرة يقع فوق الخلايا بمسافة كافية. ولمنع كسر طرف الإبرة، قم بتعديل Z.Focus في المجهر حتى تصبح الخلايا واضحة الرؤية.

بعد ذلك، قم بخفض طرف الإبرة ببطء مع التحكم في التركيز حتى تضيق الهالة تدريجياً وتلتقي أخيراً عند طرف الإبرة. يمكنك أيضاً البحث عن جسم الإبرة، الذي سيلقي بظلال خطية. سيؤدي خفض الإبرة إلى تحديد جسم الإبرة تدريجياً.

قد يتطلب الأمر إجراء تعديلات طفيفة على حلقة الطور لتحسين التباين، ويجب أن يكون كل من طرف الإبرة وخلاياك الآن في مجال رؤية واضح. عند اختيار الخلايا للحقن، يجب أن تكون الخلايا ذات الحواف الحرة مواجهة لطرف الإبرة؛ وذلك لضمان أن المنحدر المتناقص للخلية، من أسمك نقطة حيث توجد النواة إلى أنحف نقطة في الحافة الأمامية، سيلتقي بطرف الإبرة بدلاً من أن يسير موازياً له.

اضبط ضغط الإبرة بين 0.3 إلى 0.8 PSI. سيؤدي الضغط الثابت المطبق إلى تدفق مستقر لمحلول acton. عندما تحدد الخلية المراد حقنها، ضع الإبرة بحيث يكون طرفها بجوار نواة الخلية ببطء، ثم اخفض وضعية الإبرة وأعد ضبطها حتى يبدأ الطرف في الضغط.

اخفض الإبرة تدريجيًا حتى يخترق رأسها الغشاء. إذا اخترقت الإبرة الغشاء بالكامل، فستبدو الخلية أكثر سطوعًا. بمجرد رؤية هذا التغيير، ارفع الإبرة حتى لا تعود ملامسة للخلية.

ستستغرق عملية الثقب والحقن الفعلية من 0.5 إلى ثانيتين. وعند تنفيذها بشكل صحيح، سيبدو شكل الخلية دون تغيير. ولتقليل الإجهاد الواقع على الخلايا، يجب ألا تزيد مدة كل جلسة حقن مجهري عن 20 إلى 45 دقيقة.

في بعض الأحيان، قد لا تلاحظ تغيرات في الخلية عند الحقن، ولا تزداد إضاءة الخلية. يشير هذا إلى احتمال انسداد طرف الإبرة. يمكنك اختبار ذلك عن طريق الضغط على زر التنظيف (clean button) إذا كان متوفراً في جهاز الحقن الخاص بك.

إذا كانت طرف الإبرة مفتوحاً، فإن هذا سيؤدي إلى زيادة تدفق الضغط الثابت بشكل ملحوظ، وهو ما يمكن ملاحظته على شكل تموجات وتشتت للحطام القريب. أما إذا كان طرف الإبرة مغلقاً، فيمكنك إما إدخال إبرة حقن مجهري جديدة أو محاولة كسر طرف الإبرة عن طريق خفض الإبرة برفق حتى يضغط طرفها على غطاء الشريحة الزجاجي، مما يتسبب في كسر النهاية القصوى للطرف.

يجب ألا تتجاوز منطقة الكسر خمس مساحة رأس الإبرة، وهي جزء الإبرة الذي يبدأ في التقارب لتكوين نقطة عند الانتهاء من الحقن المجهري. استبدل الوسط الخلوي في الطبق بوسط جديد مُدفأ مسبقاً لإزالة أي بقايا فلورية. بعد تغيير الوسط، اترك الخلايا لتتعافى لمدة 30 دقيقة في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C قبل التصوير.

سيتيح ذلك أيضاً للأكتين الاندماج في شبكة الهيكل الخلوي الموجودة بينما تتعافى الخلايا في الحاضنة، ابدأ في تجميع غرفة التصوير. أولاً، قم بتدفئة وسط التصوير مسبقاً في حمام مائي عند 37 °C. بعد ذلك، قم بإذابة حصة قدرها 15 µL من oxa erase في درجة حرارة الغرفة.

ستؤدي إضافة RA إلى الوسط لاحقاً إلى تقليل آثار التبييض الضوئي بشكل كبير. كما أن إبقاء oxa erase ملفوفاً بورق ألومنيوم سيضمن حماية المركب الحساس للضوء من الإضاءة. قم بتسخين مانع التسرب VAP مسبقاً على لوح تسخين مضبوط على درجة حرارة منخفضة؛ وتجنب التسخين المفرط أو حرق VAP، وإلا سيفقد فاعليته كعامل سد.

امسح شريحة مجهرية باستخدام منديل Kim wipe مبلل بالإيثانول النقي للتنظيف وإزالة الشوائب الصغيرة. ضع قطعتين متساويتين من الشريط اللاصق مزدوج الوجه، بطول 2.5 centimeters كل منهما، فوق بعضهما البعض باستخدام سطح مستوٍ ونظيف مثل شريحة مجهرية أخرى. وباعتماد السطح كمنصة، اضغط لإخراج أي فقاعات هواء محبوسة لإنشاء مستوى مسطح تماماً.

بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة لقص شريطين مستقيمين على طول المحور الطولي للشريط اللاصق بحيث يكون عرض كل شريط 0.5 centimeters. وباستخدام الملقط، ضع كل شريط على الحواف الطويلة للشريحة المجهرية بحيث يشكل شريطا اللاصق فجوة في مركز الشريحة المجهرية. اضغط برفق على الشريط اللاصق لتحقيق إغلاق محكم مع الزجاج.

ستعمل شرائط اللاصق هذه كفواصل بين الشريحة المجهرية وغطاء الشريحة. تحقق من الصمام للتأكد من أنه قد تم تمييعُه بالكامل. قبل البدء في الخطوة التالية، استرجع وسائط التصوير التي تم تسخينها مسبقاً.

أضف 15 µL من oxy rays إلى كل 500 µL من الوسط الزرعي. قم بطي منديل تنظيف كيميائي (chem wipe) على شكل مثلث لتكوين ثلاث حواف صلبة؛ حيث سيُستخدم هذا المنديل لاحقًا لمسح الغطاء الزجاجي (cover slip).

استخرج الخلايا من الحاضنة باستخدام الملقط. ارفع زاوية غطاء الشريحة بسرعة. ضع غطاء الشريحة على منديل كيم (Kim wipe) بحيث يكون جانب الخلايا متجهًا للأعلى ولا يلامس النسيج، واستخدم منديل كيم المطوي لمسح جانبين متقابلين من غطاء الشريحة لإنشاء سطح شبه جاف.

بعد ذلك، ارفع زاوية غطاء الشريحة باستخدام الملقط وضع الغطاء على الشريحة المجهرية بحيث تتماشى الأسطح الجافة مع شريطي الشريط اللاصق. لاحظ الآن أن لديك جانبين مغلقين وشقين مفتوحين. قم بسحب 200 µL من محلول RA الخاص بوسائط التصوير ببطء باستخدام الماصة بالقرب من إحدى الفتحات.

من المهم عدم إدخال أي فقاعات هوائية. يجب أن يتم سحب المحلول إلى الغرفة التي تم تجميعها حديثاً بواسطة القوى الشعرية، مما يؤدي إلى غمر الخلايا بالكامل في المحلول. باستخدام مسحة قطنية، ضع كمية من الـ vap المصهور على الزوايا الأربع لشريحة التغطية لتثبيتها وتأمينها بسرعة.

ستلاحظ أن VAP يجف خلال ثوانٍ في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، وبدءاً من الجوانب المغلقة، ضع شريطاً رفيعاً من VAP باستخدام مسحة قطنية وبحركة تشبه ضربات الفرشاة. كرر العملية للجوانب المفتوحة.

قم ببناء طبقة الـ vap ببطء، مع تعزيز الختم عن طريق تكرار خطوات الطلاء. يجب أن يقتصر الـ VAP على الحواف مع ترك مركز الغطاء الزجاجي (cover slip) نظيفاً. بعد ختم حواف الغطاء الزجاجي، نظف الجزء المركزي من الغطاء الزجاجي برفق باستخدام مسحة قطنية (Q-tip) مبللة بـ DD H2O لإزالة أي بقايا من الوسط.

احرص على عدم سحق الخلايا. كرر خطوة التنظيف هذه باستخدام الإيثانول النقي. لديك الآن غرفة تصوير مغلقة تماماً ومُحسّنة للتصوير بالنقط الفلورية.

سيمنع استخدام غلاف محكم الإغلاق تماماً تعرض عيناتك الزهرية للتبييض الضوئي السريع. الخلايا الموجودة الآن في الغرفة المغلقة تماماً جاهزة للتصوير. نستخدم مجهراً مقلوباً واسع المجال مزوداً بمصباح زئبقي، ومضاء فوقي، وفلاتر مناسبة، وعدسة شريحية غمر زيتية.

يتم التقاط الصور باستخدام عدسات شيئية أبوماتيكية (Apochromatic) وكاميرا CCD مبردة ببكسلات بحجم 6.7 ميكرون وبرنامج لاكتساب الصور. يتم تسخين منصة المجهر مسبقاً إلى 37 درجة. توضع غرفة التصوير ويتم الانتظار من 10 إلى 15 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة قبل البدء في التصوير.

بمجرد استقرار درجة الحرارة، قم بضبط تركيز الخلايا باستخدام المجهر ذي الحقل المضيء (brightfield)، ثم حدد الخلايا المحقونة من خلال تفعيل إعدادات الفلورية المناسبة. حاول تقليل وقت التعرض للفلورية لتقليل التبييض الضوئي (photobleaching). ابحث عن الخلايا المحقونة التي تمتلك حواف رائدة منحنية وسليمة.

ستتميز الخلايا التي تم حقنها بزيادة عن الحد المطلوب بحواف متقلصة ومسننة تشبه العديد من الأقدام الخيطية (phylopodia). لا تقم بتصوير هذه الخلايا. ستعتمد إعدادات الالتقاط على نوع الخلية، وجودة الأكتين الملحق بعلامة، ومكونات المجهر.

ومع ذلك، يجب ألا تتجاوز إعدادات التعريض ثانيتين، وينبغي ضبط الفاصل الزمني بين الإطارات ليكون بين 5 و10 ثوانٍ. كما يمكن رفع إعدادات الكسب (Gain) في الكاميرا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضجيج. ويجب أن تكون خصائص النمش المثالية بحيث تفصل بين كل نمشة والنمشة المجاورة لها مسافة تعادل تقريباً قطري نمشة.

بالنسبة للخلايا الطلائية، ستظهر شبكة الأكتين المنقطة متجانسة، بحيث تكون النقط موزعة بشكل متساوٍ. يجب ضبط إعدادات التعريض للحصول على أفضل الصور المنقطة.

يكمن المفتاح للحصول على مقاطع فيديو جيدة للنقاط المتناثرة في الحفاظ على التركيز. وهذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص للتحليل اللاحق الذي يتضمن قياسات تدفق وتبادل النقاط المتناثرة. وبناءً على ذلك، ستعتمد جودة التحليل الكمي على تثبيت التركيز طوال فترة التصوير المتقطع.

يتم تفصيل استراتيجيات متنوعة للحفاظ على التركيز في النص، وسيتناول هذا العرض التوضيحي استخدام نظام Nikon Perfect focus. تظهر هنا أمثلة متنوعة لخلايا تم حقنها مجهرياً. تعرض اللوحة اليسرى خلية محقونة مجهرياً مع صورة بقعية ذات تركيز منخفض.

تُظهر اللوحة الوسطى صورة بنمط البقع لخلية تم حقنها مجهرياً بتركيز عالٍ جداً، بينما تُظهر اللوحة اليمنى خلية تم حقنها بشكل مثالي. وذلك من أجل تقنية FSM التي تتطلب صورة بقع جيدة. لقد شرحنا لكم للتو كيفية الحقن المجهري للأكتين المسمى فلوروسينياً في الخلايا الظهارية من أجل مجهر البقع الفلورية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم للغاية تذكر أن جودة الأكتين الموّسم، بالإضافة إلى تقنية الحقن المجهري، ستحدد الجودة العامة لصور الرقش (speckle images). هذا كل شيء، وبالتوفيق في تجاربكم.