Electroporation في الجسم الحي وخارج الرحم للتعبير الجينات في خلايا الشبكية العقدة ماوس

في الرحم ، يبدأ التثقيب الكهربائي للشبكية بشق في البطن على سد مخدر E من 13.5 إلى 14.5 مرحلة لفضح السلسلة الجنينية. يتم حقن الحمض النووي في شبكية واحدة لكل جنين ويتم تزويد الرؤوس بالكهرباء مما يتسبب في امتصاص الحمض النووي من قبل أسلاف RGC. في E 18.5 يتم تقويم الأجنة وإيجابية GFP.

يتم تحليل الشبكية والإسقاطات البصرية للتثقيب الكهربائي للشبكية X vivo. يتم تثبيت E من 13.5 إلى 14.5 رأسا على الجانب الظهري لأعلى في طبق ويتم حقن الحمض النووي في المنطقة الظهرية الطرفية لشبكية العين ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي. يتم زراعة شبكية العين الكاملة لمدة 40 ساعة ، متبوعة بطلاء مستخلصات الشبكية الإيجابية GFP لمقايسات الثقافة في المختبر.

مرحبا ، أنا تيم بيتروس من مختبر الدكتورة كارول ماسون في قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب في جامعة كولومبيا. سنوضح لك اليوم كيفية إدخال الجينات في شبكية العين المتطابقة الجنينية من خلال استخدام التثقيب الكهربائي للشبكية في الرحم وخارج الجسم الحي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية التلاعب بالتعبير الجيني والخلايا العقدية الشبكية إلى تغيير مسار إسقاطها على وجه التحديد في التصلب البصري.

حسنا ، هيا بنا نبدأ. قبل محاولة التثقيب الكهربائي لشبكية الرحم ، يعد التحضير المناسب أمرا ضروريا. يرجى الاطلاع على بروتوكولنا المكتوب للحصول على معلومات مفصلة حول تحضير تعقيم التخدير للأدوات والأجهزة ، وإعداد محاليل الحمض النووي للحقن والمضادات الحيوية المضادة للفطريات بعد الجراحة ، وتجهيز المنطقة الجراحية وتدفئة المحاليل المناسبة.

يجب تحضير الماصات الدقيقة ذات الرؤوس الدقيقة قبل الجراحة باستخدام مجتذب قطب كهربائي صغير. كسر الطرف لعمل نقطة بزاوية في التثقيب الكهربائي للرحم ، قم أولا بحقن 0.15 مل من مزيج التخدير بين الصفاق في سد مرحلي E 13.5 إلى E 14.5. يجب أن يستغرق الأمر من ثلاث إلى سبع دقائق حتى يخضع السد للتخدير بالكامل لاختبار ما إذا كان الفأر مخدرا.

اضغط على المخلب الخلفي وتحقق من عدم وجود استجابة خلال الفترة التي يستسلم فيها للتخدير. قطع قطعة صغيرة من خمسة ميكرولترات من محلول الحمض النووي وماصتها على البارام. قم بثني مكبس سلكي معدني بزاوية 90 درجة وأدخله في ماصة صغيرة مسحوبة باستخدام المكبس ، واستنشق محلول الحمض النووي في الماصة الدقيقة.

الآن كشف أجنة الفئران جراحيا. يرجى الاطلاع على بروتوكول JoVE بواسطة Wal Inus et al للحصول على التقنية المناسبة. الآن نحن مستعدون للتثقيب الكهربائي.

الخطوة الأولى هي توجيه شبكية العين بشكل صحيح. ثم سنحقن الحمض النووي في شبكية العين ثم سنعرض الرأس بالكهرباء. حسنا ، هيا بنا نبدأ.

حسنا ، الخطوة الأولى هي توجيه شبكية العين بحيث تكون متجهة لأعلى مثل هذه. ثم باستخدام الماصة الدقيقة ، سنثقب جدار السلى ونحقن الحمض النووي مباشرة في شبكية العين بشكل مثالي. بمجرد أن تخترق جدار الرحم ، ستضغط على المكبس ، مما يؤدي إلى طرد الحمض النووي إلى شبكية العين وسحب المكبس.

على هذا النحو ، بمجرد حقن الحمض النووي ، يجب أن ترى الصبغة الخضراء تملأ السائل الأمنيوسي وكذلك شبكية العين. حسنا ، الآن بعد أن انتهينا من الحقن ، نحن مستعدون للتثقيب الكهربائي. لذا للصلاة الكهربائية، سنضع مجاذيف التثقيب الكهربائي حول الجنين مع المجداف الموجب المجاور لشبكية العين التي تم عرضها بالكهرباء.

وعندما تكون جاهزا ، مجداف قدم اكتئابي وسيؤدي ذلك إلى توصيل التيار إلى الجنين. ترى فقاعات تتشكل على مجداف وعاء الشحنة السالبة وهذا يدل على أن التثقيب الكهربائي كان ناجحا. وستكرر هذه الخطوة لجميع الأجنة المحقونة.

هذه هي الطريقة التي تقوم بها باستعراض الحمض النووي بالكهرباء في شبكية جنينية واحدة. يمكنك تكرار هذا الإجراء حتى عدد الأجنة التي تريدها. مع الأخذ في الاعتبار أنه كلما زاد عدد الأجنة التي تقوم بعرضها بالكهرباء ، زادت فرصة إجهاض الأم للأجنة.

بعد استعراض الأجنة بالكهرباء ، استخدم أصابعك لتدليك السلسلة الجنينية مرة أخرى في السد بمجرد عودة الأجنة. صب حوالي ملليلترين من محلول المضاد الحيوي المضاد للفطريات في تجويف البطن. استخدم المرقئ والملقط لخياطة الصفاق بدءا من عقدة مزدوجة في الجزء الأمامي من الشق واستمر في نمط خياطة مستمر بسيط إلى الجزء الخلفي من الشق.

استخدم الحلقة الأخيرة لربط الخيط وتقليم الخيط الزائد. أخيرا ، قم بتدبيس شق مغلق. للقيام بذلك ، ارفع الجلد في الجزء الأمامي من الشق باستخدام ملقط حاد.

احرص على فصل الجلد عن الصفاق. بعد ذلك ، ضع أسنان الدباسة حول الجلد واضغط على الدباسة ، استمر في تدبيس الشق مغلقا إلى الطرف الخلفي ، والذي يتطلب عادة من خمسة إلى سبعة دبابيس. بمجرد الانتهاء من التدبيس ، امسح الجرح حول الدبابيس بقطعة كحول.

دع السد يتعافى على وسادة التدفئة ثم ضعها في قفص جديد. عندما تبدأ في الارتعاش والتدحرج ، عادة ما يستغرق الأمر ما بين 15 إلى 90 دقيقة حتى تستيقظ لتقليل الألم وعدم الراحة. تتلقى الأمهات البوبرينورفين عند الاستيقاظ وفي نقاط زمنية لاحقة.

إذا استمر الانزعاج في منع الجفاف ، فقم بحقن السد بمحلول ملحي واحد تحت الجلد بعد حوالي ساعتين إلى أربع ساعات من الجراحة. بعد 24 ساعة بعد الجراحة ، يجب أن يستعيد السد سلوكه الطبيعي ويشرب ويأكل بانتظام. سنقوم بحصاد شبكية العين المثقبة بالكهرباء عند E 18.5 لتحليلها.

بدلا من ذلك ، يمكنك ترك السد يلد ويحصد شبكية العين في أعمار ما بعد الولادة لتحليلها في أعمار لاحقة. بعد تخدير ، استخدم المقص لقطع الجلد والصفاق تحت الدبابيس. لفضح تجويف البطن وقرون الرحم ، قم بإزالة الجنين الكهربائي وقم بتثبيت الجنين من خلال الأطراف إلى طبق تشريح الجانب البطني لأعلى ، وقطع الجلد البطني والصفاق وقطع الأجزاء الجانبية من القفص الصدري لكشف القلب.

بعد ذلك ، اخترق البطين الأيسر بإبرة التروية واقطع الأذين الأيمن بالمقص الدقيق. ابدأ الآن التروية واترك PFA يتدفق لمدة 60 إلى 90 ثانية. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، يجب أن يخرج الدم من الأذين الأيمن ويجب أن يصبح الجنين شاحبا.

بمجرد الانتهاء من التروية ، اقطع رأس الجنين واجمع الرؤوس في 4٪ PF في قارورة مخروطية سعة 15 ملليلترا. كرر هذا الإجراء لجميع الأجنة الكهربائية وجميع السدود. بمجرد الانتهاء من جمع جميع الأجنة ، قم بالتضحية بالسد عن طريق خلع عنق الرحم.

احتفظ بالرؤوس في 4٪ PFA طوال الليل عند أربع درجات مئوية ثم اغسلها في PBS لعدة أيام بعد الغسيل باستخدام PBS ، فأنت الآن جاهز لفحص شبكية العين بحثا عن تعبير GFP ناجح. قم أولا بتثبيت الرأس في طبق تشريح بحيث تكون شبكية العين متجهة لأعلى ومغمورة في PBS. قم بإزالة الجلد من حول الشبكية للكشف عن ظهارة صبغة الشبكية أو RPE باستخدام إبرة قياس 26 ونصف.

ثقب الشبكية البطنية عند تقاطع RPE للعدسة. بعد ذلك ، أدخل إحدى حواف المقص الصغير في هذه الفتحة وقم بعمل شق رأسي عبر الشبكية البطنية إلى القرص البصري. سيسمح لك ذلك بتوجيه شبكية العين عند إخراجها.

افصل RPE عن شبكية العين عن طريق الإمساك ب RPE عند الشق البطني بزوج واحد من الملقط. واستخدم زوجا آخر من الملقط لتقشير RPE بعيدا عن شبكية العين ، وتحديدا عند تقاطع عدسة RPE حيث يتم توصيل RPE بإحكام. بعد إزالة RPE ، أمسك العدسة بالملقط واسحب لأعلى وبعيدا.

لإزالة العدسة ، قم بإزالة الشبكية بعناية عن طريق وضع ملقط أسفل شبكية العين واضغط على رأس العصب البصري لتحرير شبكية العين. أخيرا ، انقل شبكية العين إلى A PBS مملوء. حسنا ، تأكد من تتبع شبكية العين التي أتت منها ، والتي تكرر هذه الخطوات للشبكية المقابلة ولجميع الأجنة الأخرى المثقبة بالكهرباء ، استخدم مجهر تشريح فلوري لمسح جميع شبكية العين بحثا عن شبكية العين الإيجابية GFP ، مما يشير إلى أن التثقيب الكهربائي كان ناجحا في هذا الجنين ويمكن معالجة هذه الشبكية والدماغ المقابل لمزيد من التحليل.

يتطلب إجراء التثقيب الكهربائي للشبكية خارج الجسم الحي عدة خطوات تحضيرية إضافية تختلف عن التثقيب الكهربائي للرحم. يرجى الاطلاع على البروتوكول المكتوب للحصول على معلومات مفصلة حول تحضير وأكسجة وسط مصل خال من المصل وإعداد أطباق الاستزراع وفحوصات الحدود. بعد تخدير ، يتم فتح تجويف البطن كما هو موضح سابقا وإزالة السلسلة الجنينية بأكملها ووضعها في D-M-E-M-F 12 على الجليد.

يجب بعد ذلك القتل الرحيم للسد باستخدام خلع عنق الرحم. استخدم المقص لقطع جدار الرحم ، ثم قم بإزالة الأجنة من الكيس الأمنيوسي وجمعها في D-M-E-M-F 12 والحفاظ على الجليد قطع رأس الأجنة والاحتفاظ بها في وسط DMEA على الأجسام الجليدية يمكن التخلص منها. بعد ذلك ، استخدم ماصة الفم أو ماصة المكبس واملأ ماصة صغيرة بالكمية المطلوبة من محلول الحمض النووي.

ثم انقل واحدة. توجه إلى طبق تشريح باستخدام PBS وقم بتثبيت الجانب الظهري للرأس لأعلى. انتقل إلى نطاق تشريح الحقن.

حسنا ، نحن الآن جاهزون للبنت الكهربائي. سأقوم بحقن الحمض النووي في الظهر المحيطي لشبكية العين ثم سأقوم بتقطيع الرأس بالكهرباء. حسنا ، ها أنا ذا.

الخطوة الأولى هي إزالة الجلد من فوق شبكية العين. للقيام بذلك ، سنستخدم الملقط فقط لتقشير الجلد. الآن يمكننا رؤية الجزء الظهري من شبكية العين.

بعد ذلك سأقوم بحقن الحمض النووي أسفل طبقة ظهارة صبغة الشبكية مباشرة في كلتا الشبكية. للقيام بذلك ، سأحمل القطب الكهربائي في وضع أفقي تقريبا وأثقب RPE في الجزء الظهري المحيطي من شبكية العين. يجب أن ترى الصبغة الخضراء تملأ مساحة الشبكية وتتسرب إلى محلول PBS.

حسنا ، حان وقت التثقيب الكهربائي. أولا قم بفك تثبيت الرأس. الآن سنفترس المجاذيف بالكهرباء ونريد أن يكون المجداف الموجب على الجانب البطني من الرأس.

لذلك سنضع الرأس داخل المجاذيف مع المجداف الموجب على السطح البطني وسنضغط للحفاظ على ثبات المجداف هكذا. والآن سنقوم بالعرض الكهربائي. يمكنك رؤية الفقاعات تتشكل على المضرب وعلى الجزء العلوي من الرأس.

وهذا كل شيء. الآن سننقل الرأس إلى طبق به متوسط. هذا كل شيء بالنسبة للتثقيب الكهربائي للشبكية خارج الجسم الحي.

كرر هذا الإجراء لأكبر عدد تريده من الأجنة وحالات الحمض النووي. الآن سنستعد لزراعة شبكية العين. بعد الانتهاء من جميع المستحضرات الكهربائية ، أضف حوالي 1.5 مل من محلول SFM المؤكسج إلى طبق من أربعة آبار واحتفظ به على الثلج.

احصل على بئر واحد لكل محلول DNA مختلف يتم حقنه. بعد ذلك ، انقل واحد كهربائي. توجه إلى طبق تشريح به D-M-E-M-F 12 مع وجود شبكية واحدة متجهة لأعلى على شبكية العين البطنية أو الجانب المقابل للمنطقة المستهدفة.

استخدم ملقطا دقيقا لقرص وتمزيق ثقب في RPE. استخدم هذا الثقب كنقطة انطلاق لتقشير RPE من حول شبكية العين. لا تقطع العين أو تتلفها لأن ذلك سيؤدي إلى انهيار شبكية العين على نفسها أثناء الحضانة.

بعد إزالة RPE ، استخدم ملقطا لإخراج شبكية العين عن طريق الضغط على العصب البصري في قاعدة شبكية العين ، واترك العدسة سليمة. انقل شبكية العين إلى SFM المؤكسج في قلب أطباق الآبار الأربعة. توجه وكرر إزالة الشبكية للعين المقابلة.

أكمل هذه الخطوة لجميع الرؤوس الكهربائية واحتضان شبكية العين في SFM المؤكسج عند 37 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة. بعد حضانة شبكية العين الكاملة ، انقل شبكية العين من بئر واحد من SFM المؤكسج إلى غطاء طبق بتري مع D-M-E-M-F 12. باستخدام منظار تشريح الفلورسنت ، اختر شبكية واحدة وتصور جزءا إيجابيا من شبكية العين.

بعد ذلك ، باستخدام مشرط دقيق وملقط ، قم بتشريح والتخلص من الجزء الإيجابي غير GFP من شبكية العين بحيث يبقى فقط جزء إيجابي GFP من شبكية العين. من المفيد التبديل باستمرار بين الضوء الفلوري والضوء العادي طوال فترة التشريح. لتحديد شبكية العين الإيجابية ل GFP على وجه التحديد ، انقل قطعة شبكية العين الإيجابية GFP إلى بئر باستخدام G-M-E-M-F 12.

كرر هذه الخطوة لجميع شبكية العين من واحدة حسنا ، لكل حالة من حالات الحمض النووي ، استخدم طبق بتري جديد ووسيط D-M-E-M-F 12 لتشريح هذه القطع الإيجابية GFP من شبكية العين إلى واجهة شبكية أصغر للطلاء. استخدم منظار تشريح لقطع القطعة الكبيرة من شبكية العين الإيجابية GFP إلى مخطط أصغر باستخدام مشرط صغير. يجب أن يكون طول وعرض الخطة حوالي 200 إلى 300 ميكرومتر.

يجب أن تنتج قطعة واحدة إيجابية من شبكية العين حوالي أربعة إلى 10 تخطيط شبكية إيجابي GFP اجمع كل explan في بئر باستخدام D-M-E-M-F 12. كرر هذه الخطوة لجميع مناطق الشبكية الإيجابية ل GFP التي يتم حصادها. بعد تحضير جميع مخططات الشبكية الإيجابية GFP ، أضف 250 ميكرولتر من SFM البارد بالإضافة إلى 0.4٪ ميثيل السليلوز إلى أطباق الثقافة المطلية بصفح.

بعد ذلك ، انقل أربعة إلى ثمانية explan إيجابية GFP إلى طبق الثقافة واستخدم الملقط لترتيب X explan برفق في مضلع مع x explan يقع في منتصف الطريق بين مركز وحافة الطبق. حدد أي جانب من الخطة X هو طبقة RGC. يمكن القيام بذلك من خلال البحث عن بلورات RPE ، والتي يمكن أن تظل في بعض الأحيان مرتبطة بطبقة الشبكية الخارجية مما يشير إلى أن الجانب الآخر هو طبقة RGC.

عادة ما يحتوي جانب RGC أيضا على بعض الحطام الخلوي الذي يمكن أن يساعد في التفسير الصحيح لطبقة RGC لأسفل. استخدم الملقط للضغط بإحكام على مركز المخطط بحيث يلتصق بزلة الغطاء الزجاجي على قاعدة طبق الثقافة. بعد طلاء كل X explan على طبق ثقافة ، انتقل إلى حاضنة 37 درجة مئوية.

تظهر نباتات شبكية العين X نموا وفيرا للمحور العصبي بعد 24 ساعة ويمكن استخدامها للعديد من المقايسات في المختبر ، ثم يتم تثبيتها باستخدام 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة. وصمة عار مناعية لمقايسة الحدود. نقل 4G FP الإيجابي explan إلى طبق تم إعداده لفحص الحدود.

رتب النماذج الخارجية X في خط مستقيم يقترب من حدود الفلورسنت مع الركيزة التي تهمك. تحت مجهر تشريح الفلورسنت ، استخدم الملقط لطلاء EXPLAN بحيث تكون على بعد حوالي 50 إلى 150 ميكرومتر من حدود الفلورسنت. بالتناوب بين قناتي الفلورسنت لتصور الواجهة الخضراء والحدود الحمراء.

بعد ذلك ، احتضن الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، مما يتيح متسعا من الوقت لمحاور RGC للوصول إلى الركيزة الحدودية. يمكن بعد ذلك إصلاح X explan في 4٪ PFA لمدة 30 دقيقة متبوعا بالتلوين المناعي. بعد التثقيب الكهربائي لشبكية الرحم.

يمكن تحضير حوامل ثقب الشبكية لتصور GFP إيجابي R GCs في شبكية العين وشبه سليمة. يمكن إعداد الأنظمة البصرية لتصور المحاور الإيجابية ل GFP في جميع أنحاء العصب البصري والتصلب البصري والقناة البصرية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء أقسام التبريد الأمامية من خلال شبكية العين ومسار RGC لتصور وتحليل أجسام خلايا RGC الإيجابية GFP في شبكية العين والمحاور في العصب البصري والمسالك.

يتم تصور جميع محاور الشبكية مع تلطيخ الخيوط العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، في الرحم ، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي لدراسة استهداف محور RGC في نواة الجيل الجانبي LGN عن طريق حصاد الجراء عند P four إلى P 10. في P ، تظهر ثمانية محاور إيجابية GFP في LGN مع قناة حمراء CTB LOR 5 94 يتم حقنها في شبكية العين المماثلة و CT bor 6 47 القناة الزرقاء في شبكية العين المقابلة لتسمية إسقاط RGC بالكامل بعد التثقيب الكهربائي خارج الجسم الحي وطلاء غرسات الشبكية.

مجموعة فرعية من محاور RGC موجبة RGFP ويمكن تصورها بوضوح عند كل من الطاقة المنخفضة والعالية كما هو موضح في الصور العلوية والسفلية على التوالي. يمكن تحليل استجابة المحاور الإيجابية ل GFP عن طريق طلاء XS المجاور لحدود الركائز المختلفة الموضحة هنا باللون الأزرق. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إدخال الجينات في شبكية العين المتطابقة الجنينية من خلال استخدام التثقيب الكهربائي للشبكية في الرحم وخارج الجسم الحي.

بينما ركزنا تحليلنا على التوجيه المحوري للتصلب البصري ، يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لأولئك الذين يدرسون تمايز RGC ، والتشكل الشجيري ، والخصائص الفيزيولوجية الكهربية لخلايا العقدة الشبكية. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل الضرر الذي يلحق بشبكية العين عند حقن الحمض النووي والحفاظ دائما على رطوبة الأجنة باستخدام PBS طوال التجربة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.