عامل النمو المغلفه الموضع الخرزة على Explants الدماغ المقدم الظهرية

هذه هي النوع الأول من الخرز الذي سأستخدمه. إنها خرزات الجل الزرقاء، وهي رخوة.

لذا، سأحتاج إلى استخدام ماصة زجاجية مجمعة في نهاية ماصة فموية لوضع هذه الخرزات على Xs. أما النوع الثاني من الخرزات الذي سأقوم بتوضيحه فهو خرزات الهيبارين الأكريليك. وهي نوع من الخرزات الصلبة، وسأقوم بوضع هذه الخرزات على مستنبتات X باستخدام إبرة تنجستن. وهذه هي الأنابيب الشعرية الزجاجية التي سأقوم بصهرها أولاً باستخدام موقد بنزن.

بعد ذلك، سأقوم بسحبهما لتشكيل طرف أكثر دقة. لذا، أمسك بالأنبوب الشعري في منتصف اللهب وأقوم بتدويره أثناء انصهار الأنبوب، حيث يمكنني الشعور بأن ملمسه أصبح ليناً.

سأقوم برفعها من اللهب ثم سحبها. سأقوم بنقش خط عبر الأنبوب الشعري باستخدام هذا القلم ذي الرأس الماسي لضمان الحصول على قطع مستقيم ونظيف. بعد ذلك، سأقوم بتلميع النهايات باللهب لتنظيفها.

سأقوم بتمرير الشعيرة عبر اللهب لصقل طرفها وتصغير الفتحة بحيث يمكنها التقاط الخرزة بدلاً من مرور الخرزة عبر الشعيرة. ومن المهم ملاحظة أنك لا تريد إبقاء أنبوب الشعيرة في اللهب لفترة طويلة؛ بل يجب أن تكون عملية التمرير سريعة جداً، وإلا سينغلق الأنبوب.

عادةً ما أقوم بتصنيع عدة قطع من هذه، لأن العديد منها ينتهي الأمر بانسداد طرفها بسبب اللهب. من الصعب التحكم في هذه العملية، لذا يتم تصنيع عدة قطع. هذا مثال لواحدة انغلق طرفها.

هذا مثال على استخدام ماصة جيدة. لقد سحبت 250 µL من حبيبات الآجار في هذا الأنبوب الصغير، وسأقوم بغسلها خمس مرات باستخدام 1 mL من PBS لإزالة محلول azi الذي كانت مغمورة فيه. سأنتظر حوالي ثلاث دقائق للسماح للحبيبات بالترسب، ثم سأقوم بشفط الـ PBS الزائد وتكرار هذه العملية أربع مرات أخرى.

لم تستقر الحبيبات تماماً بعد، لذا بمجرد استقرار الحبيبات سأقوم بشفط فائض الـ PBS وتكرار هذه العملية أربع مرات. وفي النهاية سأضيف 300 µL من الـ PBS وأبدأ في العمل على الحبيبات. هذه ماصة فموية قياسية، وسأقوم فقط بأخذ الأنبوب الشعري الذي سحبته ودفعه إلى الداخل لمسافة تصل إلى ثلث الارتفاع تقريباً.

أولاً، املأ الماصات بـ PBS. وعادة ما يتم الملء عن طريق الخاصية الشعرية. هذا غطاء لطبق استزراع قطره 30 مليمتر، وقد وضعت عليه قطرة من الخرز الأزرق.

وبجانبه توجد قطرة صغيرة من PBS. وفي هذا الطبق هنا توجد قطرات بحجم 5 µL من محلول بروتيني. في هذه الحالة، البروتين المستخدم هو B and P four، ولكن يمكنك استخدام البروتين الذي تختاره باستخدام الماصة اليدوية.

سأقوم بنقل خرزة من هذه الدائرة الزرقاء هنا، وشطفها مرة واحدة في قطرة من PBS. بعد ذلك، سآخذ الخرزة باستخدام الماصة الفموية وأضعها في قطرة من محلول البروتين، ثم أقوم بتحضينها إما في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريباً أو في درجة حرارة 4 درجة مئوية لعدة ساعات. لذا، ترى هنا تجمعاً من الخرز في PBS، وأنا بحاجة إلى اختيار الخرزات ذات الحجم المناسب.

إذا كانت صغيرة جداً، فستمر ببساطة عبر ماصة الفم؛ لذا يجب أن تستقر عند الطرف فقط. والآن ترون أنني اخترت بضع خرزات، ثلاث خرزات كبيرة وثلاث خرزات صغيرة.

سأستخدم الخرزات الأكبر حجماً في التجربة. سأقوم الآن بنقل خرزة كبيرة من قطرة PBS إلى قطرة محلول البروتين. وللقيام بذلك، سأسحب لساني بلطف بعيداً عن ماصة الفم.

إنها ليست حركة شفط، بل هي مجرد تطبيق لضغط سلبي. ومن ثم سأقوم بنقلها وأعيد وضع لساني فوق الفتحة. رأس الأنبوب، ليس نفخاً، بل مجرد إضافة بعض الضغط الإيجابي لدفع الخرزة خارج الطرف.

لدي الآن خمس خرزات في قطرة محلول البروتين، وسأقوم بتحضينها عند درجة حرارة 4 °C لعدة ساعات، أو بدلاً من ذلك في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من نصف ساعة إلى ساعة واحدة. هذا هو طبق الزرع الذي يحتوي على الغشاء العائم في الوسط الغذائي جنباً إلى جنب مع البادئات التي قمت بتشريحها مسبقاً. سأقوم الآن باستخدام طرف الماصة لسحب كمية من الوسط الغذائي.

سأقوم بشطف الحبيبات في قطرة من الوسط المادي لمرة واحدة فقط مباشرة قبل وضع الحبيبة على المستوى X. هذه هي إبر التنجستن التي سأستخدمها لالتقاط ووضع الحبيبات الأكريليكية. هذه هي إبرة التنجستن وهي في حاملها الآن.

وهذه مجموعة من الملاقط الدقيقة، بزاوية 45 درجة. سأستخدم الملقط ذو الإبرة التنجستنية لرفع حبيبة من تجمع محلول PBS ونقل الحبيبة إلى قطرة من محلول البروتين.

كما فعلت مع حبيبات الهلام. فكما هو الحال مع حبيبات الهلام، قمت بشطف هذه الحبيبات الأكريليكية خمس مرات في PBS ونقلت قطرة إلى هذا الطبق. سأستخدم بعد ذلك إبرة تنجستن مثبتة في ملقط لنقل حبيبة إلى قطرة من البروتين وتحضينها تماماً كما فعلت مع حبيبات الهلام.

وبذلك يتم رفع الخرزة. أضع يدي اليمنى بثبات على الطاولة، وأستخدم إصبع السبابة في يدي اليسرى لتثبيت الإبرة أثناء غمسها في السائل، ثم ألامس خرزة برفق باستخدام الإبرة وأرفعها ببطء خارج السائل. أحياناً تسقط الخرزة من الإبرة، لذا ما عليك سوى تكرار العملية للحصول على خرزة أخرى.

الآن، وباستخدام يدي اليسرى، أمسك بملقط بزاوية 45 درجة. مع توجيه الطرفين للأسفل، ألمس الخرزة والإبرة بالسائل، ثم أستخدم طرف الملقط للضغط عليها بلطف لإزالتها.

لدي الآن خمس خرزات في البروتين. حسناً، سأمسك بإبرة التنجستن في الخرزة بيدي اليمنى، وباستخدام الملقط في يدي اليسرى مرة أخرى مع توجيه الطرف للأسفل بنفس الطريقة التي دفعت بها الأربعة السابقة، سأكرر ذلك هنا على الشريحة. يتم التحضين عند 37 °C ويعتمد الوقت على المقايسة المحددة.