Name: الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: تعلم تقنيات التسجيل الكهربائي في أجنة ذبابة الفاكهة لدراسة خصائص العضلات والخلايا العصبية النامية. يوضح هذا الأسلوب تكوين المشابك العصبية العضلية والوظائف الإشاراتية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح كيلوبايت GM54544.

ليس لدى المؤلفين أي تعارض مصالح للإفصاح عنه.

تسجيل الكهربية من أجنة ذبابة الفاكهة تتطلب التلاعب اليدوي والتشريح. الحالة الصحية للإعداد ، ويترتب على ذلك من جودة التسجيلات ، ويعتمد على أن يكون أحدهما قادرا على بسرعة وبدقة يعد الأنسجة الجنينية الهشة للتسجيل ، وثم تنفيذ التجربة. وينبغي أن يتقن المجربون في كل من تشريح الجنينية والتصحيح الكهربية المشبك قبل محاولة معالجة كل دفعة واحدة. ويمكن أن يتم في واحدة من تسجيلات عدة أنواع من &quot;المعيار المعدل&quo...

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

ذبابة الفاكهة نموذجا رئيس الوزراء الجينية لدراسة كل من التطور الجنيني وعلم الأعصاب وظيفية. تقليديا ، لا بأس هذه الحقول المعزولة عن بعضها البعض ، مع تواريخ مستقلة إلى حد كبير والمجتمعات العلمية. ومع ذلك ، فإن التفاعل بين هذه المجالات المتباينة عادة البرامج التنموية الكامنة وراء اكتساب الخصائص الكهربائية وتمايز وظيفي الإشارات الكيميائية من نقاط الاشتباك العصبي وظيفية خلال المراحل النهائية لتشكيل الدوائر العصبية. هذه الواجهة هي منطقة ذات أهمية حاسمة للتحقيق فيها. في ذبابة الفاكهة ، وهذه مراحل التطوير الوظيفي يحدث خلال الفترة من 8 ساعات &lt;(عند درجة 25) خلال الثلث الأخير من مرحلة التطور الجنيني. واعتبر هذه الفترة الطويلة في وقت متأخر نظرا لالتنموية المستعصية التحقيق إلى ترسب من إهاب صعبة ، والبشرة غير منفذة. وكان مقدما اختراق تطبيق المياه البلمرة الغراء الجراحية التي يمكن تطبيقها محليا لإهاب لتمكين تشريح للرقابة في وقت متأخر من مرحلة الأجنة. مع شق طولي ظهري ، يمكن وضع الجنين شقة ، وكشف الحبل البطني العصب وعضلات الجسم الحائط لتحقيق التجريبية. ويمكن عندئذ خلية كاملة التصحيح ، المشبك تقنيات يمكن استخدامها لتسجيل من الخلايا العصبية بشكل فردي ، يمكن تحديدها والعضلات الجسدية. وقد استخدمت هذه التكوينات تسجيل لتتبع ظهور ونضوج التيارات الأيونية ونشر عمل محتمل في كل من الخلايا العصبية والعضلات. وقد اتسمت هذه المسوخ الوراثية التي تؤثر على الخواص الكهربائية للكشف عن التركيب الجزيئي للقنوات ايون وما يرتبط بها من مجمعات الإشارة ، والبدء في استكشاف الآليات الجزيئية للتمايز وظيفي. وثمة تركيز خاص على تجميع اتصالات متشابك ، سواء في الجهاز العصبي المركزي والأطراف. وglutamatergic الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو الأكثر الوصول إلى مزيج من التصوير الضوئي وتسجيل الكهربية. ويستخدم الزجاج الكهربائي الشفط لتحفيز الأعصاب الطرفية ، وتقاطع مع التسجيلات (EJC) الحالي مثير المحرز في العضلات فرضت الجهد. وقد تم استخدام هذا التكوين لرسم تسجيل التمايز الوظيفي للالمشبك ، وتتبع ظهور ونضوج قبل المشبكي خصائص الافراج الغلوتامات. بالإضافة ، يمكن أن يعاير خصائص بعد المشبكي بشكل مستقل عن طريق iontophoretic أو تطبيق ضغط الغلوتامات مباشرة إلى سطح العضلات ، لقياس مدى نضج ومظهر من الحقول مستقبلات الغلوتامات. وهكذا ، يمكن مراقبة كل من العناصر السابقة وبعد المشبكي بشكل منفصل أو مجتمعة خلال synaptogenesis الجنينية. وقد تم استخدام هذا النظام بشكل كبير لعزل وتوصيف طفرات جينية الجنينية التي تعوق تشكيل المشبك ، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم مواصفات وتمايز الاتصالات المشبك والوظيفية خصائص متشابك الإشارة.

من التسجيلات الكهربية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة السماح تحليلات العضلات النامية وخصائص الخلايا العصبية الكهربائية ، وكذلك توصيف وظيفي synaptogenesis في مفترق العصبية والعضلية وglutamatergic كوليني نقاط الاشتباك العصبي المركزي وGABAergic.

تُعد ذبابة الفاكهة (Drosophila) نموذجاً جينياً رائداً لدراسة كل من التطور الجنيني وعلوم الأعصاب الوظيفية. وتقليدياً، كانت هذه المجالات...

يمكن الحصول على تسجيلات فيزيولوجية كهربائية من العضلات والعصبونات الحركية من جدار جسم جنين oph مُعد بشكل صحيح. يمكن تسجيل القراءات من العضلات 6 أو 7 أو 12 أو 13 بسهولة باستخدام تكوين تسجيل الخلية الكاملة، ويمكن قياس تيارات سعة مصغرة قوية بعد تحقيق ختم غيغا أوم للتسجيل من الوصلة العصبية العضلية. يمكن استخدام قطب امتصاص لسحب عصب حركي بالقرب من نقطة خروج الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتقديم تحفيز قبل مشبكي بينما يتم قياس تيارات الخلية الكاملة في العضلة بعد المشبكية.وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ماصة لإيصال النواقل العصبية الاستثارية بالقرب من قطب التسجيل عبر الرحلان الأيوني أو القذف بالضغط. مرحباً، أنا تون من مختبر ديف في قسم العلوم البيولوجية بجامعة إلينوي في شيكاغو. سأعرض لكم اليوم كيفية التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي للوصلة العصبية العضلية في المرحلة الجنينية من السلمندر والعصبونات المركزية.نستخدم هذه الإجراءات لدراسة وظيفة وتطور الجهاز العصبي العضلي في ذبابة الفاكهة. قام كيندال برودي بتطوير هذه التقنيات في الأصل، ثم انتقلت إلى ديفيد فيت ستون ومن ثم إليّ، واليوم سأنقلها إليكم.يتطلب هذا الإجراء جمع الأجنة وتشريحها بشكل صحيح مسبقاً. ولمعرفة كيفية إنجاز ذلك، يرجى الاطلاع على منشور JoVE المصاحب من إعداد Brody وFeatherstone وChen. تعتمد التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية من عضلات وعصبونات أجنة Jossa على تقنيات تثبيت الرقعة للخلية الكاملة القياسية. أولاً، يتم وضع الجنين المشرح في غرفة تسجيل صغيرة من البلكسي جلاس.يتم تخميد منطقة تسجيل الفسيولوجيا كهربائياً بواسطة قفص فاراداي، وهي موضوعة على طاولة مخمدة للاهتزازات. وتُفحص الحجرة تحت ضوء نافذ باستخدام مجهر مركب رأسي مزود ببصريات KY وعدسة غمر مائي ذات مسافة عمل طويلة 40 x. وعادةً ما يتم إجراء تسجيلات الهدف في درجة حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة، حيث تزداد صعوبة إجراء تثبيت الرقعة (patch clamp) لعضلات oph مع ارتفاع درجات الحرارة.يجب أن تتراوح المقاومة النهائية لقطب التسجيل بين 5 إلى 10 mega ohms، وأن يتم صقله حراريًا ليصل القطر الداخلي إلى حوالي 1 micrometer. يتم ملء أقطاب التسجيل عند الطرف بمحلول فسيولوجي يحتوي على potassium chloride وsucrose. يتم وضع سلك أرضي من silver chloride في الحمام الذي يحتوي على محلول ملحي قياسي، والذي يُستخدم أيضًا في تشريح الأجنة.يتم تضخيم الإشارات باستخدام مضخم patch clamp، ثم تُرشح وتُخزن رقمياً لتحليلها لاحقاً. يمكن استخدام أي نظام مناسب لتجارب patch clamp، مثل هذه المعدات والبرمجيات المقدمة من axon. يمكن الآن تحفيز وتسجيل الخلايا من ثلاثة أنسجة مختلفة في الجهاز العصبي الجنيني، وهي العضلات، والعصبونات عند NMJ، والعصبونات الحركية المركزية.باستخدام تحضير الجنين هذا، يمكن تسجيل أي عضلة جنينية من معظم التجارب. ركز على مجموعة العضلات البطنية الطولية الأربعة 6 و7 و12 و13، وبالأخص العضلة السادسة في الجزء الأمامي من البطن، A two to a three للتسجيل من العضلات الظهرية. يجب لصق الجنين بحيث يكون الجانب الظهري لأسفل، ويتم تشريحه على طول الخط الناصف البطني في الأجنة الصغيرة.لا حاجة إلى معالجة إنزيمية قبل تسجيل العضلات. ومع ذلك، في الأجنة المتأخرة ذات القشيرات المتطورة، يتطور أيضاً غمد عضلي قبل تسجيل الرقعة (patch recording). يجب إزالة هذا الغمد عن طريق الغمر لفترة وجيزة في كولاجيناز.تُجرى معظم التسجيلات باستخدام تكوين تسجيل الخلية الكاملة (whole cell recording)، والذي يمكن تحقيقه بسهولة من حالة الارتباط بالخلية عن طريق تطبيق شفط خفيف أو نبضة كهربائية. يُعرف ذلك باسم "الzap"، وهو عبارة عن تحفيز كهربائي لتمزيق غشاء الخلية.في إعداد الخلية الكاملة، تكون عادةً مقاومات الختم على العضلة أكبر من 1 giga ohm، وعادةً ما يتم الحصول على تيارات الخلية الكاملة في غضون أقل من ثلاث دقائق بعد تكوين الختم. تزداد المقاومة التسلسلية بشكل ملحوظ في معظم الحالات، ويمكن أن تطور الخلايا تيار تسريب متزايد. ومن أجل تثبيت الرقعة، يجب أن يكون عمر الأجنة 14 hours على الأقل، حيث تكون المراحل التنموية المبكرة.سيؤدي الاقتران الكهربائي الواسع بين الأنابيب العضلية إلى جعل تثبيت الجهد غير دقيق عند إجراء تسجيلات تثبيت الرقعة للألياف العضلية. تتراوح جهود التثبيت النموذجية من -60 إلى -80 millivolts، ويمكن استخدام طرق تثبيت الجهد وتثبيت التيار. وتصاحب تسجيلات الخلية الكاملة الناجحة عند -60 millivolts تيارات مشبكية تلقائية قوية تتراوح من بضع picoamps إلى عدة مئات منها، مثل تلك الموضحة هنا.يمكن استثارة تيارات كبيرة في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) عن طريق تحفيز العصب الحركي باستخدام أقطاب الشفط. ويمكن سحب هذه الأقطاب من مجموعة متنوعة من الأقطاب الزجاجية المملوءة بالألياف، ويجب صقلها حرارياً لتحقيق التكوين المطلوب. باستخدام شفط خفيف في الماصة، يتم سحب جزء صغير من العصب الحركي القطعي المناسب بالقرب من نقطة الخروج من الجهاز العصبي المركزي (CNS). ولتكوين سدادة محكمة، يُفضل استخدام تحفيز قصير بكثافة يتم تحديدها تجريبياً، وتتراوح عادةً بين 1 إلى 5 فولت. ويتم تحقيق تحفيز موثوق من خلال ضبط قوة التحفيز بمقدار 1 إلى 2 فولت فوق العتبة المحددة تجريبياً.يمكن تنشيط مستقبلات الغلوتامات في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) بعد التشابكية عن طريق تطبيق الناقل العصبي غلوتامات، حيث يمكن إيصال الجزيئات المشحونة مثل الغلوتامات إلى الوصلة العصبية العضلية باستخدام الرحلان الأيوني. تُستخدم الماصات ذات المقاومة العالية لرسم خريطة للمستقبلات، بينما تُستخدم الماصات ذات المقاومة المنخفضة لتقدير الاستجابة الكلية لمستقبلات الغلوتامات. يتم ملء ماصات الرحلان الأيوني بمحلول L glutamate بتركيز 100 millimolar.لتحرير L glutamate، استخدم نبضة قصيرة من التيار السالب مع تيار دعم موجب صغير لمنع التسرب، كما يمكن توصيل glutamate أو أي جزيء غير مشحون إلى NMJ باستخدام القذف بالضغط. بالنسبة للقذف بالضغط، استخدم glutamate بتركيز يتراوح من 1 إلى 2 millimolar وقم بتطبيق قوة دفع خارجية تتراوح من 5 إلى 10 PSI على الماصة، وذلك باستخدام pico spritzer.تتراوح التيارات الناتجة عن تحفيز العصب أو تطبيق الغلوتامات في الوصلات العصبية العضلية (NMJ) عند -60 mV عادةً ما بين 1500 إلى 2000 pA. ويمكن تحديد العديد من العصبونات الجنينية بشكل فردي بناءً على موقع جسم الخلية ومورفولوجيا الإسقاطات العصبية. وقد ركزت معظم التسجيلات التجريبية على مجموعة مكونة من خمس عصبونات ظهرية سطحية داخل الحبل العصبي البطني الجنيني.لتسجيل النشاط من هذه العصبونات، يجب إزالة غمد الورم العصبي للحبل العصبي البطني عبر معالجة بؤرية وجيزة باستخدام البروتياز؛ حيث يتم نزع الغلاف عن أجسام الخلايا عن طريق إدخال البروتياز بتركيز 0.5 إلى 1% في ماصة الرقعة (patch pipette) ذات القطر الكبير، ثم سحب مادة الغمد إلى داخل الماصة التي تحتوي على البروتياز. يمكن استخدام عملية شفط خفيفة بالفم لتكرار إدخال الغمد وإخراجه من الماصة بشكل متكرر. وبعد مرور دقيقة إلى دقيقتين، سينفجر الغمد.أصبحت الخلايا الآن مكشوفة لإجراء تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamping). لا يتطلب نموذج التسجيل هذا تدوير المحلول الملحي أو تدفئته. ويختلف المحلول الملحي الخارجي المستخدم للتسجيل في هذه التحضيرة عما يتم استخدامه عند التسجيل من العضلات.يمكن تعبئة ماصة الرقعة (patch pipette) بصبغة Lucifer yellow لتصوير موقع وشكل الخلية المرقوعة لاحقاً. يظهر هنا عصبون حركي مركزي امتص صبغة Lucifer yellow وتم تصويره باستخدام المجهر الفلوري. يتم إجراء تسجيلات تثبيت الجهد للخلية الكاملة (Whole cell voltage clamp recordings) عند جهد تثبيت يبلغ 60- millivolts وبدرجة حرارة 18 °C.كما يمكن إجراء تسجيلات تثبيت التيار (Current clamp). ويمكن تحفيز العصبونات باستخدام النواقل العصبية، مثل الأسيتيل كولين (acetylcholine) أو حمض غاما-أمينوبوتيريك (gaba). ويتم تطبيق هذه المواد عند جسم الخلية باستخدام عملية الرحلان الأيوني (iontophoresis) أو القذف بالضغط كما هو متبع عند التسجيل من الوصلات العصبية (njs).بمجرد إنشاء اتصال الخلية الكاملة، يتم أولاً رصد التيارات التلقائية. هذه دقيقة واحدة من البيانات الخام التي تم الحصول عليها من العضلة الطولية البطنية الجنينية السادسة باستخدام تثبيت الجهد الرقعي عند -60 millivolts في غياب التحفيز. تُظهر التحضيرات السليمة عادةً نشاطاً مشبكياً تلقائياً قوياً، تُمثله هنا العديد من انحرافات التيار المتجهة للأسفل.إليك بيانات من العضلة نفسها مع تطبيق تحفيز باستخدام ماصة شفط على العصب الحركي المؤدي إلى تلك العضلة. وقد أدى ذلك إلى انحرافات سفلية متعددة في التيار تمثل تيارات الوصلة المستحثة أو e jcs. وهذه بيانات من العضلة نفسها تم تحفيزها باستخدام 1 millimolar من الغلوتامات المطبق عن طريق القذف بالضغط.يؤدي الغلوتامات إلى فتح المستقبلات مما يتسبب في انحرافات كبيرة نحو الأسفل. يظهر في التيار الحالي أثران يمثلان تطبيقين متتاليين للغلوتامات. لقد أوضحت لكم للتو كيفية إجراء التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي من أجنة الـ geo soft في مراحلها المتأخرة؛ حيث يستخدم التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي بشكل عام تقنيات تثبيت الرقعة (patch clamping) القياسية، والتي لا يمكننا وصفها هنا بالتفصيل.من الناحية المثالية، يجب أن يكون أي شخص يسعى للتسجيل من أجنّة الرخويات التي أعددتها قد تعلم بالفعل تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) باستخدام تحضير أسهل. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا الفيديو يوضح الإجراء لعزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية باستخدام معيار تكنولوجيا الخلية بأكملها. وهو يتضمن صورا للخلايا العصبية وصفت GFP شوهدت أثناء التسجيل.

تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار

نحن هنا وصف أساليب الكهربية لقياس انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية لليرقة ذبابة الفاكهة. أثار إطلاق سراح يبدأ بشكل مصطنع من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية المحاور ، ويمكن قياسها من خلال انتقال NMJ التي أثارت استجابة بعد المشبكي في العضلات.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

هذا الأسلوب يعرض neuromusculature الجنينية لذبابة الفاكهة المناعية أو تسجيل الكهربية. ومن المفيد لدراسة الأحداث المبكرة في التنمية العصبية والعضلية أو أداء الكهربية في المسوخ التي لا يفقس.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

نظام الألياف العملاق هو الدائرة العصبية بسيطة من...

تسجيلات الكهربية من الألياف المسار عملاق د. melanogaster</em

يوضح هذا الفيديو بروتوكول التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لنشاط المستقبلات الضوئية في عين ذبابة الفاكهة الجامدة ، مما يتيح القياس الدقيق لتغيرات الجهد استجابة لمنبهات الضوء.

التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لاستجابات الجهد لذبابة الفاكهة المستقبلات الضوئية لشبكية العين لمحفزات الضوء

يوضح الفيديو التسجيل خارج الخلية للنشاط العصبي من الجهاز العصبي المركزي (CNS) ليرقات ذبابة الفاكهة. يتم وضع الجهاز العصبي المركزي المتقاطع في غرفة التسجيل ، ويتم تسجيل النشاط الكهربائي من العصب الهابط لتحديد تردد إطلاق الخط الأساسي. ثم يتم إدخال عامل اختبار ، ويتم تسجيل التغيير في تردد إطلاق النار لتحديد التأثير المثير أو المثبط للعامل.

تسجيل خارج الخلية للنشاط الكهربائي في ذبابة الفاكهة الجهاز العصبي المركزي

يصف هذا البروتوكول تسجيل خارج الخلية من العمل الاستجابات المحتملة التي أطلقتها الخلايا العصبية الذوق labellar في ذبابة الفاكهة.

تسجيل الكهربية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Labellar طعم الشعيرات

تتيح الأقطاب الكهربائية الدقيقة الحادة التوصيف الفيزيولوجي الكهربي الدقيق للمستقبلات الضوئية وإخراج الخلايا العصبية الداخلية البصرية في ذبابة الفاكهة الحية. نوضح هنا كيفية استخدام هذه الطريقة لتسجيل استجابات الجهد عالية الجودة للخلايا الفردية لتحفيز الضوء المتحكم فيه. هذه الطريقة مثالية لدراسة معالجة المعلومات العصبية في عيون الحشرات المركبة.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

تسجيلات خلية كاملة من مستقبلات ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر تمكن من قياس المطبات السوداء العفوية، المطبات الكم، والاستجابات العيانية للضوء، والعلاقات الحالية الجهد في ظل ظروف مختلفة. في تركيبة مع D. ميلانوغاستر أدوات التلاعب الجيني، وهذه الطريقة تمكن من دراسة في كل مكان إينوزيتول الدهون مسار الإشارات وهدفها، وقناة ترب.

طريقة الكهربية لالكامل خلية الجهد المشبك تسجيلات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المستقبلات الضوئية

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي تنازلي للنظام العصبي المركزي melanogaster المورفولوجية لتمكين فعالة من حيث التكلفة ومريحة لاختبار وكلاء الدوائية، الطفرات الوراثية للبروتينات العصبية، و/أو دور مسارات الفيزيولوجية غير مستكشفة.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد تصميم وأداء التجارب في الجسم الحي في دروسوفيلا melanogaster لتقييم العواقب الوظيفية للمتغيرات الجينية النادرة المرتبطة بالأمراض البشرية.

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

تعلم تقنيات التسجيل الكهربائي في أجنة ذبابة الفاكهة لدراسة خصائص العضلات والخلايا العصبية النامية. يوضح هذا الأسلوب تكوين المشابك العصبية العضلية والوظائف الإشاراتية.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

استكشف المزيد من الفيديوهات