تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

لبدء هذا الإجراء، يتم إذابة صبغة Kumasi Brilliant Blue أو CBG two 50 في لتر واحد من الماء المقطر مرتين عن طريق التقليب لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات. يُضاف بعد ذلك حمض الهيدروكلوريك إلى المحلول الأزرق الداكن مع التقليب لمدة دقيقة أخرى، ويُحفظ المحلول في مكان مظلم لاستخدامه لاحقاً. بعد تحضير عينة البروتين وإجراء STS page، يتم تفكيك كاسيت الهلام ووضع الهلام في صندوق لإجراء ثلاث خطوات غسيل متتالية باستخدام الماء المقطر مرتين.

بعد خطوة الغسل الثالثة، يُستبدل الماء بكمية كافية من محلول صبغة CBB لتغطية الهلام في الصندوق. يُسخن الصندوق في الميكروويف لمدة 10 ثوانٍ، ثم يُوضع الصندوق الذي يحتوي على الهلام على جهاز هزاز. ولإتمام عملية الصبغ، يمكن ملاحظة حزم البروتين بعد مرور دقيقة واحدة.

مرحباً، أنا أمري لورانس من مرفق تنقية وتعبير البروتينات في إمبرين هايدلبرغ. سنعرض لكم اليوم بروتوكولاً لصبغ البروتينات باستخدام صبغة كوما بريليانت بلو G 250 في هلامات كلوريد. وخلافاً لطرق الصبغ التقليدية، لا يستخدم البروتوكول الخاص بنا أي مذيبات عضوية أو حمض الأسيتيك.

نستخدم هذا البروتوكول لتحليل البروتينات الخاصة بنا بعد كل خطوة تنقية. لذا، فلنبدأ. لتحضير محلول صبغة CBB، يتم إذابة 60 إلى 80 مليجرام من CBB في لتر واحد من الماء المقطر مرتين عن طريق التقليب لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات.

بعد إذابة CBV، انقل المحلول إلى خزانة استرداد الغازات (fume hood). وفي خزانة استرداد الغازات، أضف بعناية 3 mL من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى المحلول الأزرق الداكن. يجب ارتداء القفازات أثناء التقليب لمدة دقيقة واحدة، حيث سيكون pH المحلول النهائي 2.

بمجرد تحضير المحلول، يتم تخزينه في مكان مظلم لاستخدامه لاحقاً. يمكن تخزين المحلول لأسابيع أو حتى عدة أشهر دون أن يفقد كفاءته في الصبغ. ولتحضير عينات البروتين لتقنية SDS page، تُخلط كميات مناسبة من عينات البروتين مع محلول تحميل (loading buffer) لتصل إلى تركيز نهائي قدره 1x loading buffer، ثم تُسخن عينات البروتين لمدة خمس دقائق تقريباً قبل التحميل.

أثناء تسخين العينات، يتم تجهيز حجرة الفصل الكهربائي للهلام لإجراء التشغيل. نستخدم هلامات مسبقة الصب في خلية صغيرة مع استخدام محلول MES المنظم كمحلول تشغيل. ومع ذلك، يمكن استخدام أي نظام آخر للهلام والفصل الكهربائي.

تُحمَّل عينات البروتين المسخنة بعد ذلك على الهلام ويُجرى الفصل الكهربائي لمدة 50 دقيقة عند 220 فولت. وعند اكتمال عملية SDS page، يتم تفكيك كاسيت الهلام ووضع الهلام في صندوق يحتوي على 100 ملليلتر من الماء المقطر مرتين. وبالنسبة لخطوات الغسيل اللاحقة، يُسخَّن الصندوق في فرن الميكروويف لمدة 30 ثانية.

يجب إيقاف التسخين قبل حدوث الغليان. بعد وضع الصندوق الذي يحتوي على الهلام على هزاز وتسخينه في الميكروويف لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق، كرر خطوة الغسيل هذه مرتين باستخدام ماء نقي. وبعد عمليات الغسيل الثلاث بالماء، يُضاف محلول CBB الجاهز لتغطية الهلام في الصندوق، ثم يُسخن الصندوق في الميكروويف لمدة 10 ثوانٍ دون الوصول إلى درجة الغليان.

بعد ذلك، يوضع الصندوق الذي يحتوي على الهلام على جهاز هزاز لاستكمال عملية التصبيغ. يمكن ملاحظة حزم البروتين بعد دقيقة واحدة، وبعد 15 إلى 30 دقيقة. وعادةً ما يكون التصبيغ قوياً بما يكفي.

يتم سكب محلول الصبغ وإضافة 50 إلى 100 مليليتر من الماء المقطر مرتين. ومن أجل إزالة الخلفية الزرقاء الفاتحة للهلام بشكل أكبر على جهازرجّ، يمكن استبدال الماء بماء نقي لمزيد من إزالة الصبغ. وعند الحاجة، يمكن الآن مسح الهلام ضوئياً، أو تصويره، أو تجفيفه للتخزين طويل الأمد.

يجب أن يبدو الهلام الذي تم صبغه وفقاً لهذا الإجراء بهذا الشكل. في هذا الهلام، تظهر حزم البروتين مصبوغة بشكل جيد ومرئية بوضوح، بينما تكون الخلفية مهملة.

يحتوي المسار الأول المشار إليه بالنجمة على علامات الوزن الجزيئي. وفي المقابل، سيبدو الهلام الذي لم يتم غسله بشكل كافٍ قبل الصبغ بهذا الشكل؛ ففي هذا الهلام، كانت خطوات الغسيل قصيرة جدًا، لذا لم يتم صبغ حزم البروتين بشكل كافٍ. لاحظ أن المسار المشار إليه بالنجمة يحتوي على نفس كميات البروتين لعلامات الوزن الجزيئي كما في الهلام السابق، ولكنه يظهر صبغاً أقل كفاءة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية صبغ البروتينات باستخدام صبغة Coomassie Brilliant Blue في هلامات البولي أكريلاميد دون الحاجة إلى استخدام أي مذيبات عضوية سامة أو قابلة للاشتعال. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن خطوات الغسل تُعد بالغة الأهمية لضمان صبغ البروتينات بكفاءة. وبهذا نكون قد انتهينا.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.