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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

EMBL Heidelberg

&#x5728;&#x7EC6;&#x83CC;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#x901A;&#x5E38;&#x662F;&#x4F4E;&#x5F97;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x5931;&#x671B;&#x7684;&#x3002;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E86;&#x51E0;&#x79CD;&#x7B56;&#x7565;&#x4EE5;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4EA7;&#x91CF;&#x548C;&#x6700;&#x5E38;&#x7528;&#x7684;&#x7B56;&#x7565;&#x4E4B;&#x4E00;&#x662F;&#x878D;&#x5408;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x86CB;&#x767D;&#x4E0E;&#x5408;&#x9002;&#x7684;&#x5408;&#x4F5C;&#x4F19;&#x4F34;&#x3002;&#x5173;&#x4E8E;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8FD0;&#x8425;&#x5546;&#x589E;&#x52A0;&#x4E00;&#x4E9B;&#x91CD;&#x7EC4;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#x6210;&#x529F;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x62A5;&#x544A;&#xFF0C;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x90FD;&#x4E0D;&#x662F;&#x603B;&#x662F;&#x6210;&#x529F;&#x548C;&#x7EC4;&#x5408;&#x7684;&#x529E;&#x6CD5;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x627E;&#x51FA;&#x4E86;&#x6700;&#x4F73;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x4E3A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x8868;&#x8FBE;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x4E25;&#x91CD;&#x4F9D;&#x8D56;&#x5728;&#x9002;&#x5F53;&#x878D;&#x5408;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x7684;&#x7B5B;&#x9009;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x6700;&#x4F18;&#x7EC4;&#x5408;&#x7684;&#x8BC6;&#x522B;&#x901F;&#x5EA6;&#x3002;&#x672C;&#x767D;&#x76AE;&#x4E66;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E86;&#x4E00;&#x5957;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F7D;&#x4F53; (&#x4E16;&#x6781;) &#x4E13;&#x4E3A;&#x5FEB;&#x901F;&#x4E9A;&#x514B;&#x9686;&#x3001; &#x8868;&#x8FBE;&#x548C;&#x968F;&#x540E;&#x4F7F;&#x7528;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x91D1;&#x5C5E;&#x4EB2;&#x548C;&#x5C42;&#x6790; (IMAC) &#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x7EAF;&#x5316;&#x3002;

&#x7B80;&#x5316;&#x8868;&#x793A;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E00;&#x7EC4;&#x6A21;&#x5757;&#x5316;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E2D;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x878D;&#x5408;&#x6784;&#x9020;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7B5B;&#x67E5;&#x3002;

The solubility of recombinant proteins expressed in bacteria is often disappointingly low. Several strategies have been developed to improve the yield and one of the most common strategies is the fusion of the target protein with a suitable partner. Despite several reports on the successful use of each of these carriers to increase the solubility of some recombinant proteins, none of them was always successful and a combinatorial approach seems more efficient to identify the optimal combination for a specific protein. Therefore, the efficiency of an expression system critically depends on the speed in the identification of the optimal combination for the suitable fusion candidate in a screening process. This paper describes a set of expression vectors (pETM) designed for rapid subcloning, expression and subsequent purification using immobilized metal affinity chromatography (IMAC).

Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.

La solubilit&eacute; des prot&eacute;ines recombinantes exprim&eacute; chez les bact&eacute;ries est souvent d&eacute;cevant faible. Plusieurs strat&eacute;gies ont &eacute;t&eacute; d&eacute;velopp&eacute;es pour am&eacute;liorer le rendement et une des strat&eacute;gies plus courantes est la fusion de la prot&eacute;ine cible avec un partenaire appropri&eacute;. Malgr&eacute; plusieurs rapports sur l&#39;utilisation efficace de chacune de ces compagnies pour augmenter la solubilit&eacute; de quelques prot&eacute;ines recombinantes, aucun d&#39;entre eux n&#39;a toujours r&eacute;ussi et une approche combinatoire semble plus efficace pour identifier la combinaison optimale pour une prot&eacute;ine sp&eacute;cifique. Par cons&eacute;quent, l&#39;efficacit&eacute; d&#39;un syst&egrave;me d&#39;expression d&eacute;pend la vitesse dans l&#39;identification de la combinaison optimale pour le candidat de fusion appropri&eacute; dans un processus de pr&eacute;s&eacute;lection. Cet article d&eacute;crit un ensemble de vecteurs d&#39;expression (pETM) con&ccedil;u pour subcloning rapide, expression et purification ult&eacute;rieure &agrave; l&#39;aide de la chromatographie d&#39;affinit&eacute; m&eacute;tallique immobilis&eacute;e (IMAC).

Simplifi&eacute; de d&eacute;pistage pour la d&eacute;tection des constructions de fusion soluble exprim&eacute;e chez e. coli &agrave; l&#39;aide d&#39;un ensemble modulaire de vecteurs.

Die L&ouml;slichkeit von rekombinanten Proteinen in Bakterien ausgedr&uuml;ckt ist oft entt&auml;uschend niedrig. Mehrere Strategien wurden entwickelt, um den Ertrag zu verbessern und eine der h&auml;ufigsten Strategien ist die Verschmelzung von Zielprotein mit einem geeigneten Partner. Trotz mehrere Berichte &uuml;ber den erfolgreichen Einsatz der einzelnen Fluggesellschaften, die L&ouml;slichkeit von einigen rekombinanten Proteinen zu erh&ouml;hen keiner von ihnen war immer erfolgreich und ein kombinatorischer Ansatz scheint effizienter, die optimale Kombination f&uuml;r ein bestimmtes Protein zu identifizieren. Daher h&auml;ngt die Effizienz eines Systems Ausdruck die Geschwindigkeit bei der Ermittlung der optimalen Kombination f&uuml;r den geeigneten Fusion-Kandidaten in einem Screening-Verfahren. Dieses Papier beschreibt eine Gruppe von Expressionsvektoren (pETM) f&uuml;r die schnelle subcloning, Ausdruck und anschlie&szlig;ende Reinigung mit immobilisierten Metall Affinit&auml;ts-Chromatographie (IMAC).

Vereinfachte screening f&uuml;r die Erkennung von l&ouml;slichen Fusion-Konstrukte, die in E. Coli anhand eines modularen Vektoren ausgedr&uuml;ckt.

La solubilit&agrave; delle proteine ricombinanti espresse nei batteri &egrave; spesso deludentemente bassa. Diverse strategie sono state sviluppate per migliorare il rendimento e una delle strategie pi&ugrave; comuni &egrave; la fusione della proteina target con un partner adatto. Nonostante diverse segnalazioni sull&#39;uso riuscito di ciascuno di questi elementi portanti per aumentare la solubilit&agrave; di alcune proteine ricombinanti, nessuno di loro era sempre successo e un approccio combinatorio sembra pi&ugrave; efficiente per identificare la combinazione ottimale per una specifica proteina. Pertanto, l&#39;efficienza di un sistema di espressione dipende criticamente la velocit&agrave; nell&#39;identificazione della combinazione ottima per il candidato adatto fusione in un processo di screening. Questo documento descrive un insieme di vettori di espressione (pETM) progettato per subcloning rapida, espressione e purificazione successiva mediante cromatografia di affinit&agrave; immobilizzata metallo (IMAC).

Semplificate di screening per la rilevazione dei costrutti di fusione solubili espressi in e. coli usando un set modulare di vettori.

&#x7D30;&#x83CC;&#x3067;&#x8868;&#x660E;&#x3057;&#x305F;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x3070;&#x3057;&#x3070;&#x5931;&#x610F;&#x306E;&#x3046;&#x3061;&#x4F4E;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;&#x6B69;&#x7559;&#x307E;&#x308A;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x958B;&#x767A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3001;&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x6226;&#x7565;&#x306E; 1 &#x3064;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6EB6;&#x89E3;&#x5EA6;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x306B;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x3069;&#x308C;&#x3082;&#x304C;&#x5E38;&#x306B;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D3;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB; &#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x304C;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3068;&#x601D;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5F0F;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x6279;&#x5224;&#x7684;&#x306B;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0; &#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x305F;&#x878D;&#x5408;&#x5019;&#x88DC;&#x8005;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;&#x901F;&#x5EA6;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7570;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6025;&#x901F;&#x306A; subcloning&#x3001;&#x5F0F;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x56FA;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB; &#x30C6;&#x30A3;&#x30FC; &#x30FB; &#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30B0;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC; (IMAC) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;&#x6D44;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4E00;&#x9023;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB; (pETM) &#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8FF0;&#x3079;&#x308B;&#x3002;

&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;, &#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30E9;&#x30FC; &#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x96C6;&#x5408;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x878D;&#x5408;&#x30B3;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x7C21;&#x7565;&#x5316;&#x3002;

&#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xB41C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC6A9; &#xD574;&#xB3C4; &#xC2E4;&#xB9DD; &#xB0AE;&#xC740; &#xACBD;&#xC6B0;&#xAC00; &#xB9CE;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC728;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xD55C; &#xD558; &#xACE0; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95; &#xC911; &#xD558;&#xB098;&#xB294; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC735;&#xD569; &#xC774;&#xB2E4;. &#xAC01;&#xAC01; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC6A9; &#xD574;&#xB3C4; &#xB192;&#xC774;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD1B5;&#xC2E0; &#xC0AC;&#xC5C5;&#xC790;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4; &#xC911; &#xB204;&#xAD6C;&#xB3C4; &#xC131;&#xACF5;&#xD55C; &#xD56D;&#xC0C1; &#xD558; &#xACE0; &#xC870;&#xD569; &#xC811;&#xADFC; &#xD2B9;&#xC815; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC778;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC2DD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC740; &#xBE44;&#xD310;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xD4E8;&#xC804; &#xD6C4;&#xBCF4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC870;&#xD569; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC18D;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB2E4;&#xB985;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC885;&#xC774; &#xC2DD; &#xBCA1;&#xD130; (pETM) &#xC138;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBE60;&#xB978; subcloning, &#xD45C;&#xD604;&#xACFC; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xC9C0; &#xAE08;&#xC18D; &#xCE5C;&#xD654;&#xC131; &#xD06C;&#xB85C;&#xB9C8;&#xD1A0;&#xADF8;&#xB798;&#xD53C; (IMAC)&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD6C4;&#xC18D; &#xC815;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; &#xAC83;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xBCA1;&#xD130; &#xBAA8;&#xB4C8; &#xC138;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xD604; &#xC6A9; &#xD4E8;&#xC804; &#xAD6C;&#xBB38; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xAC04;&#xC18C;&#xD654;.

La solubilidad de las prote&iacute;nas recombinantes expresadas en bacterias suele ser decepcionantemente baja. Se han desarrollado varias estrategias para mejorar el rendimiento y una de las estrategias m&aacute;s comunes es la fusi&oacute;n de la prote&iacute;na diana con un socio id&oacute;neo. A pesar de varios informes sobre el uso exitoso de cada uno de estos portadores para aumentar la solubilidad de algunas prote&iacute;nas recombinantes, ninguno de ellos siempre fue exitoso y un enfoque combinatorio parece m&aacute;s eficaz para identificar la combinaci&oacute;n &oacute;ptima para una prote&iacute;na espec&iacute;fica. Por lo tanto, la eficiencia de un sistema de expresi&oacute;n depende cr&iacute;ticamente de la velocidad en la identificaci&oacute;n de la combinaci&oacute;n &oacute;ptima para el candidato de fusi&oacute;n adecuada en un proceso de selecci&oacute;n. Este papel describe un conjunto de vectores de expresi&oacute;n (pETM) dise&ntilde;ado para la r&aacute;pida subclonaje, expresi&oacute;n y posterior purificaci&oacute;n mediante cromatograf&iacute;a de afinidad metal inmovilizados (IMAC).

Simplificado de cribado para la detecci&oacute;n de construcciones de fusi&oacute;n soluble expresado en e. coli mediante un conjunto modular de vectores.

Ann-Marie Lawrence

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