استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر Sterivex فلاتر والسيزيوم كلوريد التدرج الكثافة الطرد المركزي

مرحبا ، أنا جودي من المختبر ، ستيفن هالام في قسم علم الأحياء الدقيقة في علم المناعة بجامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لك اليوم إجراء لاستخراج الحمض النووي الجيني ، المركز من عينات مياه البحر على مرشحات STX 0.2 ميكرون وتنقية هذا الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي المتدرج بكثافة كلوريد السيزيوم. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للحصول على الحمض النووي البيئي حتى نتمكن من دراسة بنية المجتمع الميكروبي والتنوع والتمثيل الغذائي في البيئات البحرية.

لذلك دعونا نبدأ. ابدأ هذا البروتوكول عن طريق الذوبان على الجليد ، وهو تحريك مرشحات X التي قمت بتركيزها مسبقا بالكتلة الحيوية العوالق ، والمعالجة بالتحلل والمخزن المؤقت والمجمدة من أجل البساطة. نصف هنا إجراء معالجة مرشح فردي.

من الناحية العملية ، نوصي بمعالجة 15 مرشحا أو أقل في المرة الواحدة. بمجرد إذابة الفلتر ، ابدأ أول حضانة. واحد لتحلل الخلايا وإزالة الحمض النووي الريبي والآخر لتكسير البروتينات.

بالنسبة للحضانة الأولى ، أضف 100 ميكرولتر من الليزوزيم ، و 20 ميكرولتر RN a إلى الفلتر. أعد إغلاق الفلتر بالعطر واتركه يدور عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. للحضانة التالية ، أضف 100 ميكرولتر من البروتين الآس KN 100 ميكرولتر 20٪ SDS إلى الفلتر.

أعد إغلاق الفلتر باستخدام perfil واتركه يدور لمدة ساعة إلى ساعتين أخرى. هذه المرة عند 55 درجة. استخدم حقنة سعة خمسة سم مكعب لنقل المحللة من مرشح Stax إلى أنبوب صقر سعة 15 مل.

اشطف الفلتر بمحلول تحلل مليلتر واحد وأضف سائل الشطف إلى المحللة في أنبوب الصقر. الآن بعد أن قمت بتحلل خلاياك وهضمها ، فأنت جاهز لاستخراج الحمض النووي الخاص بها. الخطوة التالية هي استخدام طريقة كلوروفورم الفينول لاستخراج الحمض النووي من المحللة.

أضف حجما متساويا حوالي ثلاثة ملليلتر من كلوروفورم الفينول ، كحول الأيزواميل إلى دوامة أنبوب المحللة. لمدة 10 ثوان للخلط جيدا ، قم بتدوير الأنبوب عند 2 ، 500 مرة جم لمدة خمس دقائق. أثناء الطرد المركزي ، يجب أن ينفصل خليط محللة كلوروفورم الفينول إلى طبقتين.

طبقة عضوية في الأسفل تحتوي على كلوروفورم الفينول والبروتينات من عينتك. وطبقة مائية عادة في الأعلى ، والتي تتكون من ماء الحمض النووي والجزيئات الأخرى المحبة للماء. انقل الطبقة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الخاص بك إلى أنبوب فالكون جديد سعة 15 مليلتر إلى هذا الأنبوب ، أضف حجما متساويا من دوامة خليط كحول الكلوروفورم الأيزواميل لمدة 10 ثوان.

تزيل هذه الخطوة أي فينول متبقي من عينة الحمض النووي الخاصة بك. قم بتدويرها 2 ، 500 مرة جم لمدة خمس دقائق أو حتى تصبح الطبقة المائية صافية. انقل الطبقة المائية إلى أنبوب صقر جديد مسمى وأضف ملليلترا واحدا من TE عند درجة الحموضة الثمانية.

الآن لديك مستخلص الحمض النووي الخاص بك. الخطوة التالية هي غسل عينة الحمض النووي وتركيزها في أنبوب جهاز طرد مركزي فائق سعة 15 ملليلترا من أمازون. انقل عينة الحمض النووي الخاصة بك إلى حجرة التصفية في anon.

تتكون أنابيب الأنبوب الفائق من مرشح يحتفظ بالجزيئات عند أو أعلى من وزن جزيئي محدد ، وأنبوب وأنبوب لالتقاط التدفق عبر المرشح. في هذه الحالة ، يحتفظ المرشح بدوران الحمض النووي عند 3 ، 500 مرة G لمدة 10 دقائق. تحقق للتأكد من وجود أقل من ملليلتر واحد من السائل المحتجز في مرشح آمون.

إذا بقي المزيد من reten Tate ، فأعد ملء الفلتر ب TE وقم بالتدوير مرة أخرى. قم بإزالة التدفق أو الترشيح إلى أنبوب صقر آخر واحتفظ به في الثلاجة حتى تؤكد منتجك النهائي على مادة هلامية ، وأضف ملليلترين من المخزن المؤقت TE إلى مرشح أمازون وقم بالدوران عند 3 ، 500 مرة جم لمدة ست دقائق. قم بإزالة المرشح كما كان من قبل.

اغسل الحمض النووي مرتين أخريين باستخدام TE لمدة ثلاث غسلات ، مما يوفر المرشح في كل مرة لآخر دورة غسيل حتى يبقى 200 إلى 500 ميكرولتر من Tate في مرشح Amon. لاحظ الحجم النهائي وانقله إلى أنبوب einor سعة 1.5 ملليلتر. اصنع 70 ميكرولترا من الحمض النووي المركز المغسول لاستخدامه كمخزون عمل.

قم بتخزين مخزون العمل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتجميد باقي الحمض النووي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تحقق من تركيز الحمض النووي وجودته لمنتجك النهائي عن طريق نفاد عيناتك على هلام بجوار الحمض النووي.

السلالم التي تعمل كمعايير للحجم والشدة بإعداد هلام AROS بنسبة 0.8٪ بالإضافة إلى بروميد الأثيريوم لتشغيله طوال الليل. في الممرات القليلة الأولى ، قم بتحميل السلالم بنطاقات ذات أوزان وتركيزات جزيئية مختلفة ، نوصي بنمط التحميل التالي. في المسارين الأولين ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كيلوبايت واحد بالإضافة إلى سلم في الممرات الثلاثة التالية ، وقم بتحميل ميكرولترين وخمسة ميكرولتر و 10 ميكرولتر على التوالي من 50 نانوغرام لكل ميكرولتر سلم Lambda H ثلاثة.

أخيرا ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات لكل حارة من عينة استخراج الحمض النووي. قم بتشغيل الجل بجهد 15 فولت لمدة 16 ساعة تقريبا. قم بتصوير الجل باستخدام نظام توثيق هلام الأشعة فوق البنفسجية لتحديد نطاق الوزن الجزيئي للحمض النووي وتركيزه.

قارن نطاقات العينة بنطاقات السلم. سيكون للحمض النووي عالي الجودة وزن جزيئي مرتفع ويظهر القليل من الأدلة على القص أو التدهور. إذا كانت جودة الحمض النووي جيدة وكانت الكمية كافية ، فتابع تنقية الحمض النووي عن طريق إجراء تدرج كلوريد السيزيوم.

الملصق الأول للطرد المركزي ، أنبوب طرد مركزي واحد لكل عينة لكل أنبوب طرد مركزي ، يضيف 160 ملليغرام من كلوريد السيزيوم و 178 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني. قم بتغطية الأنبوب بقطعة صغيرة من البيرفيل واقلب الأنبوب برفق من 10 إلى 20 مرة لخلط المكونات. لا تخلط عن طريق سحب العينات التي قد تسبب قص الحمض النووي.

ثم أضف 10 ميكرولترات من بروميد AUM إلى الأنبوب واخلطه مرة أخرى. تأكد من أن الأنابيب متوازنة جيدا قبل الطرد المركزي وأن اختلافات الوزن بين الأنابيب أقل من ملليغرام واحد. ضع الأنابيب في دوار الطرد المركزي الفائق باستخدام مقص الملقط.

ثم أغلق غطاء الدوار وضع الدوار داخل جهاز الطرد المركزي الفائق بإغلاقه. سيتم تطبيق مكنسة الباب فائقة الطرد المركزي بمجرد إغلاق الباب. اركض طوال الليل لمدة 18 ساعة عند 100,000 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية.

عند اكتمال الطرد المركزي ، أخرج الأنابيب من الدوار باستخدام مقص الملقط وضعها على الرف. خذ الأنابيب إلى جهاز المصباح الأزرق، ووضع نظارات المرشح الكهرمانية. ثم قم بتشغيل الضوء الأزرق وانظر إلى شريط الحمض النووي الخاص بك باستخدام إبرة معقمة واحدة سم مكعب.

قم بإزالة شريط الحمض النووي ثم ضعه في أنبوب einor سعة 1.5 مل للمساعدة في استعادة معظم الحمض النووي المحاصر في المساحة الميتة في المحقنة. شطف المحقنة مع 100 ميكرولتر تي وإضافة محلول الشطف إلى الأنبوب. قم بإعداد أنبوب واحد يحتوي على 100 ميكرولتر من العازلة لكل عينة لمنع التلوث المتبادل.

لإزالة بروميد AUM من الحمض النووي ، أضف كمية متساوية من البيوتانول المشبع بالماء إلى الأنبوب. اقلب الأنابيب برفق ، من 10 إلى 20 مرة من أجهزة الطرد المركزي عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة وتخلص من الطبقة العليا. كرر الغسيل حوالي ثلاث إلى أربع مرات أخرى حتى يصبح لون البيوتانول شفافا.

ضع أربعة ملليلتر من TE في أنبوب الطرد المركزي الفائق ancon وأضف محلول الحمض النووي من أعلى جهاز الطرد المركزي عند 3 ، 500 مرة G في درجة حرارة الغرفة حتى ينخفض حجم الحمض النووي إلى حوالي 100 إلى 500 ميكرولتر وتخلص من التدفق من خلاله. أضف ملليلترين TE إلى مرشح أمازون وجهاز الطرد المركزي عند 3 ، 500 مرة G لمدة ست دقائق. كرر مرتين لمدة ثلاث غسلات بتركيز te إلى حجم نهائي من 50 إلى 100 ميكرولتر عن طريق الطرد المركزي الإضافي حسب الضرورة.

ونقل محلول الحمض النووي على المرشح إلى أنبوب إينور جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 40 ميكرولتر إلى الفلتر والماصة لأعلى ولأسفل على طول غشاء المرشح لغسل أي حمض نووي متبقي. أضف هذا المحلول إلى أنبوب الحمض النووي المركز.

ضع وحدة مرشح MicroCon YM 30 في أنبوب MicroCon واغسل MicroCon مسبقا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من ماء الأوتوكلاف والطرد المركزي عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة سبع دقائق. أضف محلول الحمض النووي إلى MicroCon المغسول مسبقا من أجل زيادة تركيز جهاز الطرد المركزي للحمض النووي عند 5 ، 000 إلى 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. تحقق من كمية السائل على الفلتر وكرر الطرد المركزي حتى تنخفض كمية السائل على الفلتر إلى حوالي 50 ميكرولترا.

ضع وحدة الفلتر رأسا على عقب في أنبوب MicroCon جديد وجهاز طرد مركزي عند 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق. الكمية المثالية من المحلول المركز هي 50 إلى 60 ميكرولتر. انقل عينة الحمض النووي الخاصة بك إلى أنبوب إينور جديد سعة 1.5 ملليلتر.

قم بقياس تركيز الحمض النووي على NanoDrop وتحقق من جودة الذروة. يجب أن يكون للرسم البياني لامتصاص الحمض النووي النظيف ذروة واضحة عند 260 نانومتر. قم بتجميد باقي الحمض النووي عند سالب 80 درجة مئوية.

عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، يجب أن ترى صورة هلامية مشابهة للشكل الأول ، وسيختلف تركيز الحمض النووي الفعلي للمستخلصات اعتمادا على مصدر العينة. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، يجب أن ترى بوضوح شريط DNA عبر منتصف الأنبوب. كما في الشكل الثاني ، أوضحنا لك للتو كيفية استخراج الحمض النووي الجيني من مرشحات sterex وتنقيتها باستخدام تدرج كثافة كلوريد السيزيوم.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم التحقق قبل البدء من أن لديك جميع الكواشف والعناصر المستهلكة اللازمة. وثانيا ، خطط لمدة ثلاثة أيام كاملة على الأقل لإتاحة متسع من الوقت لإكمال الإجراء بعناية. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.