Name: تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: تعلم تقنية الحقن الدقيق لدراسة الانقسام الميتوزي في أجنة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. تُستخدم هذه الطريقة لمراقبة ديناميكيات الانقسام الخلوي بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويجري حاليا استخدام هذا البروتوكول في مختبرنا وتم صقلها على مر السنين الكثير من الناس بمن فيهم الدكاترة ديفيد شارب ، كوون Mijung ، Sommi باتريسيا ، Cheerambathur Dhanya. نشكر الدكتور بيل سوليفان (UCSC) الذين قدموا لنا المشورة ممتازة على التلاعب وmicroinjection للأجنة ذبابة الفاكهة في وقت مبكر عندما كان يجري بدأ عملنا في هذا النظام (المرجع 13). نشكر جميع أعضاء المختبر Scholey. ويدعم عملنا على الانقسام في ذبابة الفاكهة المعاهد الوطنية للصحة منح GM55507.

وصفات : لوحات عصير العنب : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5g bacto آغار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14.5 غرام سكر العنب او الجلوكوز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.15 ز سكروز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 45 مل من عصير العنب التركيز (100 ٪ عصير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 204.5 مل من H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 625 ميكرولتر 10N هيدروكسيد الصوديوم </li></ul> مزيج جميع المكونات والميكروويف حتى الغليان. إضافة 2.8 مل من مزيج حمض (حمض مزيج : 20.9 مل حمض البروبيونيك ، 2.1 مل حمض الفوسفوريك ، و 27 مل من H 2 0) ويسكب المزيج على أطباق بتري 35 ملم. اسمحوا يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم أو يومين. إذا لوحات ليست على وشك أن يستخدم في وقت قريب ، مع ختم parafilm والحفاظ على 4 درجات مئوية (السماح للتوازن لRT قبل استخدام). لصق الخميرة : إذابة حوالى ملعقة صغيرة من الخميرة (سيغما YSC2 ، خميرة البيرة السكيراء من النوع الثاني) في الماء لتكوين عجينة سميكة. ضع كمية صغيرة من هذا على كل لوحة عصير العنب فقط قبل استخدامه. G - PEM العازلة : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 ملم نا أنابيب ، ودرجة الحموضة 6.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم EGTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم GTP </li></ul> حقن العازلة : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K - 150 مم الأسبارتات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي K - الفوسفات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ملي إيميدازول ، ودرجة الحموضة 7.2 </li></ul> هيبتان الغراء : انبسط شريط لاصق مزدوج ووضعه في زجاجة 100ML ، إضافة حوالي 50ml هيبتان ، ختم زجاجة ، والصخور لعدة أيام. عند استخدام ، إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا. الجفاف الغرفة : تأخذ طبق بيتري 100 ملم ، وطرح جزء واحد من 35 مم داخل صحن لتقديم &quot;جدول&quot; وإضافة Drierite (كبريتات الكالسيوم اللامائية) حول هذا الأمر بحيث ارتفاع Drierite ليست أعلى من &quot;الجدول&quot; و الغطاء. سيتم وضع ساترة مع الأجنة على هذا &quot;الجدول&quot; لجفاف قبل الحقن. انها فكرة جيدة لاستخدام ما لا يقل عن بعض تشير Drierite وتغييره اذا كان قد تغير اللون. البروتوكول : ويمكن استخدام هذا البروتوكول لحقن أي كاشف للذوبان تقريبا في جنين ذبابة الفاكهة المخلوي : على سبيل المثال ، إما بروتين فلوري للمراقبة أو مثبط البروتين المستهدف أو كليهما. الحصول على كل شيء جاهزا : 1.- 2 إلى 3 أيام قبل التجربة ، وجعل لوحات عصير العنب واقامة وضع القفص : خذ زجاجة من البلاستيك (6 أوقية ، ذهابا وإيابا من أسفل التطبيقية العلمية ذبابة الفاكهة) ، وقطع اثنين من الثقوب الصغيرة (حوالي 1cm 2) على طرفي نقيض من وملء الزجاجة بقطعة قطن (وهذا سوف يسمح لتدفق الهواء) ، اضغط على الذباب في زجاجة ، وتغطي مع لوحة عصير العنب. إبقاء على درجة حرارة 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) ، وينبغي وضع الذباب الأجنة لنحو 10 يوما. 2.- ما لا يقل عن يوم واحد قبل التجربة سحب الإبر للحقن ، ونحن نستخدم إبرة Kopf / الماصة مجتذب طراز 720 و شعيرات رقيقة الجدران الزجاجية (البنك الآلات الدقيقة tw100f). لحقن تويولين الفلورسنت ، والحفاظ على الإبر في 4 درجات مئوية لمنع درجة الحرارة التي يسببها البلمرة في الإبرة. تويولين التحضير : ملاحظة : يجب أن يتم العمل مع جميع تويولين في 4 درجات مئوية لمنع البلمرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ تويولين المسمى من الثلاجة ووضعها على الجليد لمدة 5 إلى 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مع G - PEM العازلة (من 4 إلى 10 أضعاف تبعا للكثافة المطلوبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في دورة في الدقيقة 13K عند 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1-2 ميكرولتر في الإبرة. </li></ol> الضد أو مثبط الكيميائية : تعد الإبر بالنسبة تويولين ، وذلك باستخدام التركيز المناسب (وهذا قد تحتاج إلى اختبار). يمكن أن يكون في الضد العازلة الحقن ، G - PEM العازلة أو برنامج تلفزيوني. إذا كان هناك حاجة لالعازلة ، وسوف تحتاج إلى هذا المخزن المؤقت يتم حقنه كعنصر تحكم للتأكد من هذا المخزن المؤقت يسبب أي ضرر من تلقاء نفسها. ملاحظة : يمكن أن تكون مختلطة والمانع الفلورسنت تويولين وحقن معا إذا كانت تركيزات تسمح بذلك. خلاف ذلك ، حقن تويولين الفلورسنت وانتظر 5 إلى 10 دقائق قبل حقن المانع. عند إجراء الحقن المزدوج ، وتبدأ مع مزيد من الأجنة ، منذ أقل من الأجنة سوف يتعافى بشكل طبيعي. جمع الأجنة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عصير العنب لوحة جديدة على وضع قفص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هذا الطبق بعد ساعة واحدة ، وهذه هي المجموعة الأولى من النهار ، وغالبا ما تكون ليست جيدة جدا. ويمكن تجاهل ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير لوحة في كل ساعة للحفاظ على جمع الأجنة لمدة ساعة واحدة لكل منهما. </li></ol> ساترة التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة × 50 22mm و على جانب واحد من شريحة المجهر. الشريط الزوايا الأربع إلى الشريحة بحيث لا تتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطعة من القطن يميل التطبيقية ، وضعت طبقة واحدة من الغراء هيبتان في سطر واحد على ساترة (الغراء لا ينبغي أن تكون لزجة ، وينبغي أن تجف في بضع ثوان ، إضافة خلاف أكثر هيبتان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة منالمزدوج شريط لاصق على الانزلاق نحو جانب ساترة. </li></ol> جنين التحضير : ملاحظة : يجب أن يكون تصوير الجنين حوالي 2 بعد ساعات من بدء المجموعة ، بحيث تبدأ الخطوات التالية يتيح وقتا كافيا للانتهاء منها في هذا الإطار الزمني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بفرشاة مبللة اختيار بعناية حتى الأجنة من عصير العنب لوحة ومكان على الشريط اللاصق المزدوج على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الجزء الخارجي من ملاقط ، ولفة الأجنة أكثر من الشريط المزدوج لزجة حتى المشيماء (الغشاء الخارجي) فواصل مفتوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الجنين قبل المتداول برفق على المشيماء ذلك تتمسك منتاش ووضعه على الغراء هيبتان على ساترة مع الجانب طويلة من خط الجنين الى جانب طويلة من ساترة. إعداد 10-20 الأجنة في صف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة ووضعه في غرفة الجفاف لمدة 3 إلى 8 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة ، والمبلغ الذي يتم حقنه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في غرفة مع الشحوم المعدنية فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الأجنة مع 700 الهالوكربون النفط لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن. </li></ol> حقن الجنين : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على الأجنة في إطار الهدف 16X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة بعيدا ، والعثور على ابرة دون تحريك الطائرة التنسيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز الإبرة ونقلها من دون تحريكه في اتجاه x أو ذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الإبرة غير مفتوح ، وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية ، ولكن ليس فيها الإبرة ستكون ، وخفض الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. نقل جدا بعناية ساترة حتى يضرب الإبرة بلطف وفواصل مفتوحا. إذا كانت إبرة فتح ، انتقل إلى الخطوة 5. (يمكن فتح إبر مع حامض الهيدروفلوريك قبل ملء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في عرض (ولكن ليس فيها الإبرة وسوف) ، وانخفاض الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرات السائل لطيفة من الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية ولكن بثبات الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين ونقل الجنين بعيدا. (أو اتباع تعليمات جهاز الحقن الخاص بك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم حقن جميع الأجنة ، وهم مستعدون للمراقبة على مبائر المجهر. </li></ol> التصوير : صورة الأجنة على المجهر مبائر مع الهدف 60 أو 100X : ملاحظات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن الفاصل الزمني على سلسلة الوقت الفاصل تكون في معظم ثوان قليلة ، ومنذ الانقسام في الجنين سريع جدا ، اعتمادا على العملية الدقيقة التي يتعين دراستها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الحصول على سلسلة 3D أو طائرة واحدة اعتمادا على عملية الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمثبطات سريع المفعول ، ونقل من الحقن لمجهر مجهر التصوير يجب أن يكون سريعا. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : دراسة الانقسام في جنين ذبابة الفاكهة المخلوي. النوى في الجنين في وقت مبكر من دون الخضوع لانقسامات سريعة الحرائك الخلوية ، خلال دورات من 10 إلى 13 (أ) شكل نواة المونولاير في القشرة. A. التخطيطي الجنين في وقت مبكر مع النوى في القشرة. ويمكن التعبير عن GFP الجنين و / أو البروتينات المسماة RFP ويمكن microinjected مع غيرها من البروتينات المسماة و / أو مثبطات. باء التصوير مرور الزمن من جنين ، معربا عن GFP تويولين وRFP - هيستون. جيم قطعة من قطب قطب لدورات الفصل 11 و 12 و 13 في جنين نوع البرية. المعارض طول فترات المغزل طول متساوي القياس وفترات الاستطالة ، والتي هي متسقة للغاية وقابلة للتكرار. حيوية دال ميكروتثبول المغزل. حقن تركيز منخفض من تويولين رودامين يؤدي إلى تشكل بقع من مفارز تويولين قليلة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات أنيبيب.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا ، ومع ذلك ، يتطلب ممارسة كل خطوة للتأكد من عدم تلف الأجنة. تجارب التحكم الدقيق دائما بحاجة إلى القيام به لضمان أن يتم الحصول على نتائج موثوقة. واحد وسيلة جيدة لبدء هذه هي microinjecting العازلة أو رودامين تويولين في التعبير عن السيطرة الأجنة GFP - تويولين للتأكد من أن الانقسام العائدات عادة من خلال جميع الدورات على سطح الجنين (دورات من 10 إلى 13). التحكم في الأجنة يجب أن لا نلاحظ أي اتصالات فعلية بين مغزل التي غالبا ما تكون نتيجة للجفاف كثيرا ، وأقل ذل...

تقنيات microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

يصف هذا البروتوكول استخدام الأجنة melanogaster ذبابة الفاكهة لدراسة الانقسام المخلوي 1. ذبابة الفاكهة والوراثة مفيدة مع تسلسل الجينوم ، ويمكن بسهولة أنها حافظت والتلاعب بها. وجود العديد من المسوخ الإنقسامية ، ومعربا عن الذباب المعدلة وراثيا وظيفية fluorescently (GFP مثلا) -- البروتينات الإنقسامية الموسومة تم ويتم إنشاؤها حاليا. استهدفت التعبير الجيني هو ممكن باستخدام نظام GAL4/UAS 2. الجنين في وقت مبكر ذبابة الفاكهة ينفذ mitoses متعددة بسرعة كبيرة (خلية مدة الدورة ، ≈ 10 دقيقة). وهو مناسب تماما عن الانقسام والتصوير ، لأنه خلال دورات 10-13 ، نواة الانقسام بسرعة وبشكل متزامن دون التدخل الحرائك الخلوية على سطح الجنين في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة. هذه النوى تقسيم بسرعة على الأرجح استخدام الآلية الإنقسامية نفس الخلايا الأخرى ، ولكن ما هي الأمثل للسرعة ، ويعتقد عموما أن لا يكون نقطة تفتيش صارمة ، والسماح للدراسة البروتينات الإنقسامية الذي سيسبب عدم اعتقال خلية دورة في زنزانات مع نقطة تفتيش قوية . ويمكن التعبير عن البروتينات الأجنة GFP المسمى أو microinjected مع بروتينات fluorescently المسمى التقط بسهولة لمتابعة ديناميكية حية (الشكل 1). بالإضافة ، يمكن microinjected الأجنة مع وظيفة حجب الأضداد أو مثبطات لبروتينات محددة لدراسة تأثير فقدان أو اضطراب وظيفتها 3. يمكن لهذه الكواشف منتشر في جميع أنحاء جنين ، حيث بلغت مغزل لانتاج العديد من الانحدار تركيز مثبط ، والتي تؤدي بدورها في الانحدار من عيوب مماثلة لسلسلة أليلية من المسوخ. من الناحية المثالية ، إذا fluorescently المسمى البروتين المستهدفة ، ويمكن التدرج من تثبيط يمكن تصور مباشرة 4. فمن المفترض أن أقوى النمط الظاهري هو مشابه إلى النمط الظاهري فارغة ، على الرغم من أنه من الصعب استبعاد احتمال رسميا أن الأجسام المضادة قد تكون لها آثار المهيمنة في حالات نادرة ، والضوابط الصارمة وتفسير ذلك الحذر يجب أن يطبق. بعيدا عن موقع الحقن ، وظيفة البروتين هو فقط السماح فقدت جزئيا وظائف أخرى من البروتين المستهدف لتصبح واضحة.

يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في التصوير<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; الجنين المخلوي لدراسة الانقسام.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

يصف هذا البروتوكول استخدام الجنين المدمج لذبابة الفاكهة (Drosophila melanogaster) لدراسة الانقسام الفتيلي. تمتلك ذبابة الفاكهة (Drosophila) خصائص وراثية مفيدة مع تسلسل...

تبدأ هذه العملية بجمع الأجنة على أطباق عصير العنب الطازج لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد إخراج الطبق من القفص المائي، يتم التقاط الأجنة باستخدام فرشاة مبللة ووضعها على شريط لاصق مزدوج. يتم دحرجة جنين واحد برفق فوق الشريط باستخدام أحد طرفي الملقط حتى ينفتح الغشاء الكوريوني.التقط الجنين وضعه برفق على الغطاء. ثم ضع فوقه طبقة من صمغ het. كرر هذه العملية حتى يتوفر لديك العدد الكافي من الأجنة.بعد عملية التجفيف، تصبح الأجنة جاهزة للحقن. مرحباً، أنا إنغريد بروس موشر من مختبر الدكتور جوناثان سكولي في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة كاليفورنيا ديفيس. سنعرض لكم اليوم إجراءً للحقن المجهري لأجنة ذبابة الدروزيوفيلا في المرحلة المدمجة.نستخدم هذا الإجراء لدراسة دور الأنيبيبات الدقيقة والمحركات القائمة على الميتوسين في الانقسام الفتيلي. على سبيل المثال، نقوم بحقن الأجسام المضادة أو مثبطات أخرى لبروتينات انقسامية محددة مجهرياً. ومن خلال تحليل تأثير المثبط على الانقسام الفتيلي، نتمكن من تحديد وظيفة البروتينات المستهدفة.لنبدأ الآن. لبدء التحضيرات قبل التجربة بيومين إلى ثلاثة أيام، قم بتجهيز قفص وضع البيض عن طريق صنع ثقبين صغيرين بمساحة سنتيمتر مربع واحد تقريبًا على جانبين متقابلين من زجاجة بلاستيكية. املأ الثقوب بقطعة من القطن، بما يسمح بتدفق الهواء.انقر على الذباب لإدخاله في الزجاجة، ثم قم بتغطيتها بطبق عصير العنب. في حالة استخدام الخميرة، احتفظ بقفص الأرجل في درجة حرارة الغرفة؛ حيث سيضع الذباب البيض لمدة تصل إلى 10 أيام، وذلك قبل يوم واحد على الأقل من التجربة. اسحب الإبر المخصصة للحقن واحتفظ بها في درجة حرارة 4 °C.في يوم التجربة، قم بتجهيز الإبر وتحميلها. أولاً، أخرج التوبولين (tubulin) المسمى من المجمد وضعه على الثلج لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بتخفيفه باستخدام محلول GPEM المنظم، ثم قم بطرد المركز لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة بسرعة 13,000 RPM عند درجة حرارة 4 °C.وأخيراً، يتم تحميل 1-2 µL في الإبرة وتحفظ عند درجة حرارة 4 °C، وذلك لمنع البلمرة الناتجة عن تغير درجة الحرارة داخل الإبرة. وقبل تجهيز الشريحة الغطائية، يتم تحضير غراء الهيبتان عن طريق لف شريط لاصق مزدوج الوجه ووضعه في زجاجة سعة 100 mL.أضف حوالي 50 milliliters من الهبتان، وأغلق الزجاجة بإحكام ورجّها لعدة أيام. قبل تحضير الأجنة، قم بإنشاء غرفة تجفيف توضع فيها الأجنة قبل الحقن. وللقيام بذلك، ضع جزءاً من طبق بقطر 35 millimeter داخل طبق بتري بقطر 100 millimeter لإنشاء منصة، ثم أضف مادة مجففة، وهي كبريتات الكالسيوم اللامائية، حولها بحيث لا يتجاوز ارتفاع المادة المجففة مستوى المنصة والغطاء.لبدء تحضير الأجنة، قم أولاً بجمعها من القفص البحيري عن طريق تغيير طبق عصير العنب مع الخميرة كل ساعة؛ ويجب تصوير الأجنة بعد حوالي ساعتين من بدء عملية الجمع. ولتحضير شريحة التغطية، ضعها على أحد جانبي شريحة المجهر وثبت الزوايا الأربعة بشريط لاصق لضمان عدم تحركها. وباستخدام مسحة قطنية، ضع طبقة واحدة من غراء الهبتان على شكل خط فوق شريحة التغطية.يجب ألا يكون الغراء لزجاً وأن يجف خلال ثوانٍ قليلة. وإذا كان كثيفاً جداً، أضف المزيد من heptane. وأخيراً، ضع قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على الشريحة بجانب الغطاء.ضع مسحة باستخدام فرشاة مبللة. ارفع الأجنة بعناية من طبق عصير العنب وضعها على الشريط اللاصق مزدوج الوجه الموجود على الشريحة. بعد ذلك، استخدم طرف ملقط لدحرجة الأجنة فوق الشريط اللاصق مزدوج الوجه حتى ينفتح الغشاء السلوي.التقط الجنين عن طريق دحرجته بلطف فوق سطح الكوريان حتى يلتصق بالملقط، ثم ضعه على غراء الهبتان الموجود على الشريحة الغطائية. مرر الشريحة بحيث يكون الجانب الطولي للجنين موازياً للجانب الطولي للشريحة الغطائية. ضع من 10 إلى 20 جنيناً في صف واحد.قم بإزالة غطاء الشريحة ووضعه في غرفة التجفيف لمدة تتراوح من ثلاث إلى ثماني دقائق. يعتمد الوقت على الرطوبة المحلية والكمية المراد حقنها. بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة على غرفة معدنية تحتوي على شحم تفريغ الهواء.أخيرًا، قم بتغطية الأجنة بزيت الهالو كربون لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة الآن جاهزة للحقن. أولاً، حدد موقع الأجنة باستخدام عدسة شيئية بقوة 16 x.حرك الأجنة بعيداً وحدد موقع الإبرة دون تغيير المستوى البؤري. قم بتوسيط الإبرة ثم حركها للأعلى دون تحريكها في اتجاه X أو Y. لفتح الإبرة، ضع حافة شريحة التغطية في مجال الرؤية، ولكن بعيداً عن موقع الإبرة.ثم اخفض الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. حرك غطاء الشريحة بحذر شديد حتى تلامس الإبرة وتؤدي إلى كسرها برفق. بعد ذلك، ارفع الإبرة للأعلى.الآن، اجعل الأجنة تظهر في مجال الرؤية. أخفض الإبرة في الزيت، وتأكد من الحصول على قطرات سائلة جيدة من الإبرة. حرّك الجنين بثبات نحو الإبرة، وحقن قطرة داخل الجنين، ثم حرّك الجنين بعيداً.بعد الانتهاء من حقن جميع الأجنة، تصبح جاهزة للفحص باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مع عدسة شيئية بقوة 60 أو 100x. يجب أن يبدو الجنين الضابط مثل الذي يظهر في هذا المقطع. هذا جنين يعبر عن GFP tubulin و RFP histone تم تصويره بعدسة شيئية 100x باستخدام مجهر بؤري ذو قرص دوار (spinning disc confocal microscope).الوقت الإجمالي الموضح هو ثماني دقائق. وتعد مخططات المسافة من القطب إلى القطب قابلة للتكرار بشكل كبير وتعتبر مقياساً موثوقاً للنجاح في أجنة المجموعة الضابطة. ويجب أن تبدو مثل تلك الموضحة هنا للدورات من 11 إلى 13.يظهر في هذا المقطع جنين تحكم آخر، يعبر هذا الجنين عن KLP 61 FGFP وقد حُقن بـ r Domine tubulin. تم تصوير هذا الجنين أيضاً باستخدام عدسة شيئية بقوة 100 x على مجهر بؤري دوار (spinning disc confocal)، والمدة الزمنية الإجمالية هي سبع دقائق.تم الحصول على هذا المقطع المرئي مباشرة بعد الحقن المجهري، حيث يظهر تدرج تركيز r Domine tubulin بوضوح في بداية المقطع. يمكن استخدام هذه الأجنة لدراسة تثبيط Klp 61 F بعد الحقن المجهري للأجسام المضادة لـ Klp 61 F. ونلاحظ هنا فقدان Klp 61 FGFP من المغازل.لقد شرحنا لك للتو كيفية إجراء الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) في المرحلة المقطعية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء الضوابط، والتدرب أولاً على حقن المحلول المنظم أو الروتين وحده، والتأكد من أن الانقسام الميتوزي يسير بشكل طبيعي عبر المراحل الخلوية. وبمجرد أن تصبح جميع عمليات الحقن موثوقة ولا تسبب أي ضرر، يمكنك حقن المثبط ودراسة تأثير ذلك التثبيط المحدد.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

وkinetochore هو المكان الذي يبدأ SAC الاشارة رصد الفصل الإنقسامية من chromatids شقيقة. تم وصف طريقة لتصور التوظيف ودوران واحد من البروتينات kinetochore والتنسيق مع الحركة في...

دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين المخلوي

نظرا لحجمها الكبير وتنظيمها البسيط نسبيا ، فإن خلايا ممرضة ذبابة الفاكهة مناسبة بشكل مثالي لدراسات تصوير الخلايا الحية. يصف هذا الفيديو طريقة الحقن المجهري لتوصيل المركبات الخارجية إلى الخلايا ، ويوضح البروتوكول المميز الإجراء باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية التي تسمى المنارات الجزيئية (MBs) المستخدمة لتصور نصوص mRNA الذاتية.

الحقن المجهري لذبابة الفاكهة الخلايا الممرضة: طريقة للتوصيل داخل الخلايا

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء الحقن المجهري الذي ينقل الكواشف إلى أجنة ذبابة الفاكهة الحية. يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لإدخال مركبات خارجية مثل الأحماض النووية والبروتينات خلال المراحل المبكرة من نمو الجنين. يوضح البروتوكول المميز كيفية إعداد وتنفيذ إجراء حقن أي كاشف قابل للذوبان - هنا ، بروتين فلوري لتجارب التصوير الحي.

الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة الحية: التسليم المبكر للكواشف إلى الجنين النامي

نقدم تقنية الخلايا العصبية لوصفها واحد في الجهاز العصبي المركزي (CNS)...

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

والهدف من هذا البروتوكول هو حقن رودامين مترافقة في شكل اجناة دوزوفيليا وصورة إيننويا actin قضبان الجمعية بعد الإجهاد الحراري.

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير مباشر للانقسام غير المتماثل للخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs) في ذبابة الفاكهة في مكانة المبيض. نستخدم خطا معدلا وراثيا يعبر في كل مكان عن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لبروتين الطيف Par-1.

التصوير الحي الممتد لمنافذ الخلايا الجذعية الجرثومية ذبابة الفاكهة السوداء

توضح هذه البروتوكولات كيفية توصيف تنظيم ووظيفة الإغلاق لوصلات القطع الصوفية المطوية في الظهارة الجنينية الضابطة والطفرة في ذبابة الفاكهة.

تجارب صبغ المناعة واختراق الصبغة لتعريف بروتينات الوصلة الحاجز ذات الطيات الأساسية في ظهارة جنين ذبابة الفاكهة

تعلم تقنية الحقن الدقيق لدراسة الانقسام الميتوزي في أجنة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. تُستخدم هذه الطريقة لمراقبة ديناميكيات الانقسام الخلوي بدقة عالية.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات