ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع

من أجل إجراء التصوير المقطعي البصري الإسقاطي الموحد (normalized born optical projection tomography)، يتم أولاً تثبيت العينة وطمرها في أسطوانة من الأجار. ثم يتم تدوير العينة حول محور رأسي وإضاءتها بشكل منتظم بطول موجي للاستثارة، ويُقاس النفاذ باستخدام بصريات مناسبة من نوع C, CD. كما تُقاس الإشارة الفلورية عند الطول الموجي في وضع الإضاءة النافذة.

تُستخدم صور الفلورة والامتصاص المكتسبة لتحديد نسبة بورن المعيرة وإعادة بناء توزيع الفلوروفورات داخل العينة. مرحباً، اسمي كلوديا ناوني وأعمل في مراكز بيولوجيا الأنظمة في مستشفى ماس جنرال، كلية الطب بجامعة هارفارد. أنا دانييل راكي من معهد التصوير البيولوجي والطبي في جامعة ميونخ التقنية ومركز AI في ميونخ.

أنا جيزيل فيدو، مديرة وحدة التجارب هنا في C-M-I-C-S-B بمستشفى ماساتشوستس العام وكلية الطب بجامعة هارفارد. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتصوير الفوري للأعضاء الكاملة خارج الجسم الحي باستخدام نهج Born الموحد للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة توزيع المسبار الجزيئي الفلوري في الأعضاء المجوفة. لذا، لنبدأ الآن. سيشرح هذا الفيديو إجراء استخدام التصوير المقطعي بالإسقاط الضوئي لتصوير الأنسجة أو الأعضاء المُحضرة، مع فيديو مصاحب.

نشرح كيفية استخدام هذا النظام لإجراء التصوير بالفاصل الزمني على ذبابة الفاكهة (drosophila) النامية. تتطلب تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد عن طريق التصوير المقطعي بالإسقاط الضوئي مزيجاً فريداً من البصريات ومنصة دوارة. وفي هذا الجزء من الفيديو، سيتم توضيح إجراءات التصوير.

للبدء، يعمل مصدر الضوء الأساسي كمصدر لقياسات الإضاءة والامتصاص معاً، ولتوفير الإثارة الفلورية لقياسات الفلورة، يتم أولاً ترشيح مصدر الضوء الأساسي باستخدام مرشح تداخل ضيق النطاق. بعد ذلك، يمر الضوء عبر مجموعة من مرشحات الكثافة المحايدة الثابتة والمتغيرة. وتتكامل هذه المرشحات مع وجود غالق تلقائي للتحكم في كمية الضوء الساقطة على العينة والحفاظ عليها عند مستوى منخفض بما يكفي لمنع حدوث أي تبييض ضوئي.

يتم تحقيق إضاءة منتظمة للعينة باستخدام مُوسع للشعاع وعدسة تلسكوب جلان مدمجة مع عدسة تشتيت. وفي النهاية، تُستخدم مرشحات تداخل ضيقة النطاق بصرياً لتنقية ضوء مصدر الإثارة بصرياً. يتم غمر العينة في محلول ترويق وتثبيتها في مكانها للتصوير داخل أنبوب زجاجي.

يتم تدوير العينة حول محورها الرأسي بواسطة مرحلة دوران عالية السرعة بدقة مطلقة تبلغ 0.05 درجة. وتسمح ثلاثة وحدات تحكم يدوية متميزة بإمالة المحور الرأسي للعينة وضبطه في مستواه المتعامد. ويتم اكتساب إشارة الامتصاص من خلال الإضاءة النافذة ويتم رصدها مباشرة بواسطة كاميرا CCD.

يتم ترشيح الإشارة الفلورية عبر مرشح تداخل تمرير نطاقي ضيق، مقترن بمرشح تمرير طويل، ثم يتم تجميعها بواسطة عدسة مركزية عن بعد (telecentric lens). وتوفر هذه العدسات ميزة توفير خصائص فريدة تجعلها مثالية للتصوير المقطعي الإسقاطي البصري.

يعد وجود فتحة توقف تقع ضمن مجموعة العدسات عند البؤرة الرئيسية للعدسة أمراً أساسياً؛ فهي تضمن انتقال الصورة بشكل موازٍ للمحور البصري. وهذا يؤدي إلى القضاء على تشوه المنظور وتوفير تكبير متساوٍ عبر العديد من المستويات البؤرية ضمن عمق التمركز البؤري.

يصف مقطع الفيديو التالي تقنية لتحضير العينات، ويتبع ذلك المنهجية المستخدمة في التصوير. يعتمد تحضير أنسجة أو أعضاء العينة للتصوير المقطعي على عملية تجفيف للعينة باستخدام الإيثانول لتجنب الانكماش غير المتماثل.

تستغرق هذه العملية عدة أيام لاكتمالها. في هذا الفيديو، يتم تحضير قلب فأر، ولكن يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نسيج أو عضو. سنقوم باستعراض طريقة التصوير الفلوري الخاصة بنا باستخدام قلب حيوان أصيب باحتشاء محكوم.

وبعبارة أخرى، يحدث فقدان للإمداد الدموي يؤدي إلى نخر نسيجي واضح مسبقاً. تم حقن الفأر بـ pro since six 80، وهو مستشعر فلوري غير نشط يبلغ عن نشاط cathepsin في عضلة القلب التي تتماثل للشفاء. يتم تخدير الفأر لإجراء التروية واستئصال القلب باستخدام حقنة داخل البريتون من ketamine و xylazine، ثم يتم حقن 50 units من heparin داخل البريتون لمنع التخثر.

بعد مرور خمس دقائق، قم بإجراء عملية فتح بطن طولي للحيوان المخدر تماماً لإزالة الدم. أولاً، افتح الوريد الكلوي الأيسر. الآن، احقن 20 milliliters من المحلول الملحي ببطء في الوريد الأجوف السفلي.

يحل المحلول الملحي محل الدم بعد غسل جميع كميات الدم تحت مجهر تشريحي. استمر في استخدام طرق التشغيل القياسية لفتح الصدر وإزالة القلب. الآن، قم بتثبيت القلب لمدة ثماني ساعات في 4%PFA عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

من هذه النقطة فصاعداً، يجب تنفيذ خطوات تحضير الأنسجة في الظلام لتجنب بهتان أي عوامل تباين فلورية أو بروتينات تم تطبيقها على النسيج. عند اكتمال عملية التثبيت، يتم غسل PFA عن طريق الشطف بـ PBS لمدة 15 دقيقة، ثم يُغمر القلب الذي تم تنظيفه في تجمع من 0.8%aros. وبمجرد جفاف aros، يتم قطع الأغاروز حول النسيج لتشكيل كتلة.

بعد ذلك، قم بتجفيف قلب الـ aros المشفر من خلال سلسلة من خمس خطوات تبدأ بالنقع في 20%Ethanol، ثم تركيزات أعلى تدريجياً من الإيثانول، وأخيراً، الإيثانول النقي. يساعد إجراء التجفيف هذا في تجنب أي انكماش غير متماثل للعينة. يجب أن تتم أول أربعة حمامات في الإيثانول المخفف لمدة ساعة واحدة، بينما يجب أن يتم الحمام النهائي في 100%Ethanol لمدة 10 ساعات على الأقل.

بمجرد اكتمال معالجات الإيثانول، ضع العينة في محلول موراي الشفاف (Murray's clear solution) حتى تصبح العينة شفافة، وهي عملية تختلف مدتها من بضع ساعات إلى عدة أيام. يحاكي محلول التصفية هذا الماء الخلوي ويتطابق في معامل الانكسار مع الأغشية الخلوية، مما يجعل النسيج شفافاً. قد تظل آثار ضئيلة من الإيثانول موجودة في نهاية عملية التصفية، مما يؤدي إلى ظهور عدة عيوب تصويرية (artifacts) في عمليات إعادة البناء نتيجة الحركة الحرارية للكحول داخل محلول التصفية نفسه.

ولتجنب هذه المشكلة، يوصى بإجراء دورة تصفية ثانية. لا ينبغي أن تستغرق هذه العملية أكثر من أربع ساعات. وبمجرد اكتمالها، تصبح العينة جاهزة للإسقاط الضوئي.

التصوير المقطعي بمساعدة الحاسوب. يمكن الحصول على إعادة بناء للامتصاص الضوئي في حالة غياب تشتت الضوء باستخدام خوارزمية إسقاط رادون الخلفي المفلتر الشائعة. وتعد هذه العملية مشابهة للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية ثنائي الأبعاد.

ضع كتلة الأيروس (aeros) في غرفة التصوير الشفافة المملوءة بمحلول التصفية. قم الآن بتركيب الغرفة على المنصة، وأضئ العينة بحزمة مجمعة لكل من قياسات الإثارة والنفاذ. يعتمد اختيار مصدر الإثارة على البروتين الفلوري المختار أو عامل تباين التصوير الجزيئي.

من الملائم محاذاة المحور الرأسي للعينة بشكل موازٍ لعمود البكسلات في جهاز الـ CCD. قم بتدوير العينة عبر 360 مسقطاً باستخدام زيادات زاوية قدرها درجة واحدة، والتقط الصور عند كل زاوية بنظام الإضاءة النافذة (trans illumination) عند كل من الأطوال الموجية للامتصاص والفلورة. يقوم البرنامج الذي يدير عملية الالتقاط بالتحكم تلقائياً في الغالق الخاص بمصدر الضوء الأساسي لتجنب الإضاءة المستمرة وتقليل التبييض الضوئي للعينة.

تعد الغالق ذات أهمية خاصة عندما تكون هناك حاجة إلى أوقات تكامل طويلة لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من بيانات الامتصاص. ما عليك سوى استخدام خوارزمية إسقاط رادون الخلفي المفلترة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور الفلورية. يجب مراعاة مساهمات الامتصاص الأخرى، والتي يتم شرحها في مقطع الفيديو التالي.

بعد استكمال الخطوات المطلوبة لإعادة بناء الامتصاص، تتبقى بضع خطوات إضافية لإتمام عملية إعادة بناء الفلورسنت. يمكن الحصول على إعادة بناء الخريطة البصرية في غياب تشتت الضوء باستخدام خوارزمية إسقاط رادون العكسي المفلترة الشائعة. وتعد هذه العملية مماثلة للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية ثنائي الأبعاد.

عند إعادة بناء توزيع الفلورة، فإن الامتصاص المتباين المعتمد مكانيًا يجعل استخدام تحويل رادون العكسي للإسقاط الخلفي لصور الفلورة غير صحيح، مما يؤثر بشدة على توزيعات البروتين الفلوري أو المسبار الجزيئي الفلوري التي يتم الحصول عليها وعلى القدرة على تقديرها كمياً. يخضع كل شعاع عند طول موجة الإثارة Lambda X ينبعث من موضع مصدر تعسفي Xs لتوهين أسي أثناء مروره عبر الجسم الذي يتم تصويره.

بعد إثارة الفلوروكروم الموجود في الموضع X، يتم ترشيح الإشعاع عند طول موجة الانبعاث وجمعه بواسطة بكسل CCD الموجود في الموضع XD باستخدام نظام عدسات التصوير Teleric. وعلى الرغم من أن الفلورة المنبعثة لا تتبع نفس مسار شعاع الإثارة، إلا أن الشدة المسجلة في كل بكسل تمثل تقريبًا إسقاطًا لجميع الفلوروكرومات التي تم إثارتها على طول منطقة التركيز الكاملة المقابلة لشعاع الإثارة المحدد هذا. ونظرًا لخاصية المركزية البعيدة (telecentricity) العالية للنظام، يتم بعد ذلك تدوير الجسم المصوَّر بمقدار 360 درجة، ويتم الحصول على قياسات متعددة للمصدر والكاشف، UX عند طول موجة الإثارة و UFL عند طول موجة الانبعاث، باستخدام كاميرا CCD.

يتم بعد ذلك دمج هذه القيم تحت مجال ولادة طبيعي UB مُعرَّف كنسبة بين الاثنين. ويمكن تسهيل عملية إعادة بناء توزيع الفلوروكروم من خلال كتابة النموذج الأمامي لكل من انتشار ضوء الإثارة والانبعاث، حيث تصف دالة غرين عملية الإثارة. ويتبع انتشار الأشعة قانون بير لامبرت البسيط حيث تمثل moo A توزيع الامتصاص البصري الذي تم تحديده مسبقاً.

يمكن كتابة شدة الضوء UX المنبعثة من المصدر عند الموضع excess والمقاسة بواسطة الكاشف عند الموضع XD على C.C, D كحاصل ضرب الدالة الخضراء في ثابت B يعتمد على النظام. ومن ثم يمكن حساب التوزيع الدقيق لشدة ضوء الإثارة GX على طول كل مسار شعاعي. وتأخذ شدة الفلورية UFL المكتشفة عند الكاشف XD والمحفزة بالضوء المنبعث من المصدر Xs في الاعتبار مساهمة جميع theros التي تم إثارتها على طول المسار الشعاعي من X إلى xd.

يمكن كتابة النموذج الأمامي لمشكلة التصوير الخاصة بنا على النحو التالي ub ub، حيث تشتمل alpha على الثوابت المجهولة التي تعتمد على النظام. يتم بعد ذلك تقسيم النموذج الأمامي على الشبكة المفترضة وإجراء عملية عكسية لاستخلاص توزيع الفلوروكروم، والحصول على كل من إشارة النفاذية والإشارة الفلورية، واستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي التقليدية لإعادة بناء العينة. تظهر هنا عمليات إعادة بناء التصوير المقطعي الضوئي بالإسقاط لكل من النفاذية والفلورة التقليدية.

يظهر إعادة بناء لمستوى واحد من القلب بكل من الامتصاص والفلورة. تظهر إعادة بناء "بورن" (born) المُعايرة الفرق في توزيع الصبغة داخل القلب. بعد المعايرة، قمنا بتوضيح كيفية إعداد نظام التصوير المقطعي بالإسقاط الضوئي وكيفية إزالة الشوائب الناتجة عن الامتصاص الضوئي في عمليات إعادة البناء الخاصة بالتصوير المقطعي الفلوري.

من المهم جداً في الواقع مراعاة تصفية العينة لإزالة تأثير الضوء المشتت، ولكن في الوقت ذاته، من المهم أيضاً موازنة عملية التصفية للحفاظ على أكبر قدر ممكن من مساهمة الفلورة. وهناك أمر آخر مهم جداً يجب تذكره عند استخدام هذا النهج، وهو حساب النسبة المعيرة للعظم التي يتم الحصول عليها بقسمة صور الفلورة على صور الامتصاص. وهذا كل شيء.

شكرًا لانضمامكم إلى تجربتنا المصورة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم الخاصة.