ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع
June 2nd, 2009
نقترح نهجا ولد لتطبيع التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية (BnOPT) التي تمثل خصائص امتصاص عينات تصوير دقيقة للحصول على الكمية ومضان اعادة البناء تصوير الشعاعي الطبقي. نستخدم الخوارزمية المقترحة لإعادة توزيع ومضان المسبار الجزيئي داخل أجهزة الحيوانات الصغيرة.
من أجل إجراء التصوير المقطعي الإسقاط البصري الطبيعي ، يتم تثبيت العينة أولا وتضمينها في أسطوانة المثقاب. ثم يتم تدوير العينة على طول محور رأسي ثم تضيء بشكل موحد بطول موجي للإثارة ، ويتم قياس الإرسال باستخدام بصريات C ، CD مناسبة. يتم قياس إشارة الفلورسنت عند الطول الموجي في وضع الإضاءة.
تستخدم صور الفلورسنت والامتصاص المكتسبة لتحديد نسبة الولادة الطبيعية وإعادة بناء توزيع الفلورو الأربعة داخل العينة. مرحبا ، اسمي كلوديا ناون وأعمل في مراكز بيولوجيا الأنظمة في مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية الطب بجامعة هارفارد. أنا دانييل راكي من معهد التصوير البيولوجي والطبي في الجامعة التقنية في ميونيخ ومركز ميونيخ.
أنا جيزيل فيدو. أنا مدير شركة Experimental su Co هنا في C-M-I-C-S-B ، مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية هارفارد الطبية. سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير الأعضاء بالكامل في الوقت الفعلي خارج الجسم الحي باستخدام نهج بورن الطبيعي للتصوير المقطعي البصري.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة توزيع المسبار الجزيئي الفلوري في الأعضاء المجوفة. لذلك دعونا نبدأ. سيشرح هذا الفيديو إجراء استخدام التصوير المقطعي البصري لتصوير الأنسجة أو الأعضاء المحضرة ومقطع فيديو مصاحب.
نوضح كيفية استخدام هذا النظام لإجراء تصوير بفاصل زمني على تطوير ذبابة الفاكهة. تتطلب تقنية التصوير ثلاثي الأبعاد للتصوير المقطعي البصري مزيجا فريدا من البصريات ومرحلة الدوران. في هذا الجزء من الفيديو ، سيتم توضيح إجراء التصوير.
للبدء ، يعمل مصدر الضوء الأساسي كمصدر لكل من قياسات الإضاءة والامتصاص ، ولتوفير إثارة الفلورسنت لقياسات التألق ، يتم ترشيح مصدر الضوء الأساسي أولا باستخدام مرشح تداخل تمرير النطاق الضيق. بعد ذلك ، يمر الضوء عبر مجموعة من مرشحات الكثافة المحايدة الثابتة والمتغيرة. يتم دمجها مع وجود مصراع تلقائي للتحكم في كمية الضوء على العينة وإبقائها منخفضة بما يكفي لمنع أي تبيض للصور.
يتم تحقيق إضاءة عينة موحدة باستخدام موسع شعاع وعدسة تلسكوب شبح مدمجة مع عدسة ناشر. أخيرا ، يتم استخدام مرشحات تداخل تمرير النطاق الضيق البصري لتنظيف ضوء مصدر الإثارة بصريا. يتم غمر العينة في محلول مقاصة وتثبيتها في مكانها للتصوير داخل أنبوب زجاجي.
يتم تدوير العينة على طول محورها الرأسي عن طريق مرحلة دوران عالية السرعة بدقة مطلقة تبلغ 0.05 درجة. تسمح ثلاث وحدات تحكم يدوية متميزة بإمالة المحور الرأسي للعينة وتعديله في مستواه المتعامد. يتم الحصول على إشارة الامتصاص في الإضاءة العابرة ويتم اكتشافها مباشرة بواسطة كاميرا CCD.
يتم ترشيح إشارة الفلورسنت من خلال مرشح تداخل تمرير النطاق الضيق ، إلى جانب مرشح تمرير طويل ثم يتم تجميعها باستخدام عدسة مركزية عن بعد. توفر عدسات Tele ميزة توفير ميزات فريدة تجعلها مثالية. للتصوير المقطعي البصري.
يعد وجود نقطة توقف فتحة العدسة داخل مجموعة العدسة عند النقطة المحورية للعدسة أمرا أساسيا. يضمن أن الصورة ستنتقل بالتوازي مع المحور البصري. هذا يزيل تشويه المنظور ويوفر تكبيرا متساويا عبر العديد من المستويات البؤرية داخل العمق المتمركز عن بعد.
يصف مقطع الفيديو التالي تقنية لإعداد العينات. سيتبع ذلك منهجية مستخدمة للتصوير. يعتمد تحضير عينة الأنسجة أو الأعضاء للتصوير المقطعي على الجفاف القائم على الإيثانول للعينة الذي يتجنب الانكماش غير المتماثل.
تستغرق هذه العملية عدة أيام حتى تكتمل. في هذا الفيديو ، يتم تحضير قلب الفأر ، ولكن يمكن تطبيق البروتوكول على أي نسيج أو عضو. سنعرض طريقة التصوير الفلوري الخاصة بنا باستخدام قلب أصيب باحتشاء خاضع للرسائر.
بمعنى آخر ، فقدان إمدادات الدم مما يؤدي إلى نخر واضح في الأنسجة مسبقا. تم حقن الفأر باحتراف منذ ستة 80 مستشعر فلورسنت غير فعال يبلغ عن نشاط الكاثيبسين في الشفاء. تخدير عضلة القلب الفأر للتروية وبثق القلب باستخدام حقن داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين ثم حقن 50 وحدة من الهيبارين داخل الصفاق لمنع التخثر.
بعد خمس دقائق ، قم بإجراء شق البطن الطولي على المخدر بالكامل لإزالة الدم. أولا ، افتح الوريد الكلوي الأيسر. الآن حقن ببطء 20 مل من المحلول الملحي في الوريد الأجوف السفلي.
يزيح المحلول الملحي الدم بعد طرد الدم بالكامل تحت مجهر تشريح. استمر في استخدام طرق التشغيل القياسية لفتح الصدر وإزالة القلب. الآن ، قم بإصلاح القلب لمدة ثماني ساعات في 4٪ PFA عند أربع درجات مئوية.
من هذه النقطة فصاعدا ، يجب تنفيذ خطوات تحضير الأنسجة في الظلام لتجنب تبييض أي عوامل تباين أو بروتينات فلورية مطبقة على الأنسجة. عند اكتمال التثبيت ، اغسل PFA بشطف لمدة 15 دقيقة في PBS ، ثم يتم تضمين القلب الذي تم تنظيفه في مجموعة من 0.8٪ aros. بمجرد أن يجف الحروس ، يتم قطع الاغاروز حول الأنسجة لعمل شكل كتلة.
بعد ذلك ، قم بتجفيف القلب المشفر من خلال سلسلة من خمس خطوات من النقع الأول في 20٪ من الإيثانول ، ثم تركيزات أعلى تدريجيا من الإيثانول ، وأخيرا الإيثانول النقي. يساعد إجراء التجفيف هذا في تجنب أي انكماش غير متماثل للعينة. يجب إجراء الحمامات الأربعة الأولى في الإيثانول المخفف لمدة ساعة ويجب إجراء الحمام النهائي في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 ساعات على الأقل.
بمجرد اكتمال علاجات الإيثانول ، ضع العينة في محلول موراي الشفاف حتى تختفي العينة ، والتي تتراوح من بضع ساعات إلى عدة أيام. يحاكي محلول المقاصة هذا الماء الخلوي ويطابق الفهرس أغشية الخلايا ، مما يجعل الأنسجة شفافة. يمكن أن يكون الإيثانول في الحد الأدنى من الآثار موجودا في نهاية عملية المقاصة ، مما يؤدي إلى ظهور العديد من القطع الأثرية في عمليات إعادة البناء بسبب الحركة الحرارية للكحول داخل محلول المقاصة نفسه.
لتجنب هذه المشكلة ، يوصى بدورة مقاصة ثانية. يجب ألا يستغرق هذا أكثر من أربع ساعات. بمجرد الانتهاء ، تكون العينة جاهزة للعرض البصري.
التصوير المقطعي بمساعدة جهاز كمبيوتر. يمكن الحصول على إعادة بناء الامتصاص البصري في حالة عدم تشتت الضوء باستخدام خوارزمية إسقاط ظهر الرادون المصفاة الشائعة. هذه العملية مماثلة للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية ثنائي الأبعاد.
ضع كتلة الأقواء في غرفة التصوير الشفافة المملوءة بمحلول المقاصة. الآن قم بتركيب الغرفة على المسرح ، وقم بإضاءة العينة بشعاع مجمع لكل من قياسات الإثارة والإرسال. يعتمد اختيار مصدر الإثارة على البروتين الفلوري المختار أو عامل تباين التصوير الجزيئي.
من الملائم محاذاة المحور الرأسي للعينة بالتوازي مع عمود وحدات البكسل في CCD. قم بتدوير العينة على 360 إسقاطا باستخدام زيادات زاوية بدرجة واحدة ، واحصل على صور في كل زاوية في الإضاءة العابرة في كل من الأطوال الموجية للامتصاص والفلورة. يتحكم البرنامج الذي يقوم بتشغيل عملية الاستحواذ تلقائيا في الغالق الموجود على مصدر الضوء الأساسي لتجنب الإضاءة المستمرة وتقليل تبييض العينة.
الغالق مهم بشكل خاص عندما تكون أوقات التكامل الطويلة مطلوبة لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من بيانات الامتصاص. ما عليك سوى استخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي للرادون المصفاة لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد من صور الفلورسنت. يجب أن تؤخذ مساهمات الاستيعاب الأخرى في الاعتبار ، والتي تم وصفها في مقطع الفيديو التالي.
بعد الانتهاء من الخطوات المطلوبة لإعادة بناء الامتصاص ، هناك بضع خطوات أخرى لإكمال إعادة بناء الفلورسنت. يمكن الحصول على إعادة بناء خريطة بصرية في حالة عدم وجود تشتت ضوئي باستخدام خوارزمية إسقاط ظهر الرادون المصفاة الشائعة. هذه العملية مماثلة للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية ثنائي الأبعاد.
عند إعادة بناء توزيع الفلورة. يؤدي الامتصاص المتغير المعتمد على المكان إلى عدم صحة استخدام الرادون العكسي للظهر ، مما يؤدي إلى إسقاط الصور الفلورية التي تؤثر بشدة على توزيعات البروتين الفلوري أو المسبار الجزيئي الفلوري وقدرته على القياس الكمي. يتم تخفيف كل شعاع عند الطول الموجي للإثارة Lambda X المنبعث من موضع مصدر تعسفي Xs بشكل كبير أثناء مروره عبر الكائن المصور.
بعد الإثارة ، يتم ترشيح الإشعاع عند الطول الموجي للانبعاث وتجميعه بواسطة بكسل CCDs الموجود في الموضع XD باستخدام نظام عدسة التصوير Teleric. على الرغم من أن التألق المنبعث لا يتبع نفس مسار شعاع الإثارة ، إلا أن الشدة المسجلة عند كل بكسل تقترب من إسقاط جميع الفلوروكرومات المثارة على طول المنطقة البؤرية بأكملها المقابلة لشعاع الإثارة هذا. نظرا لمركزية النظام عن بعد العالية ، يتم بعد ذلك تدوير الكائن المصور 360 درجة ويتم الحصول على قياسات كاشف متعدد المصادر ، UX عند الطول الموجي للإثارة و UFL عند الطول الموجي للانبعاث باستخدام كاميرا CCD.
ثم يتم دمجها تحت الحقل الطبيعي المولود UB المعرف على أنه نسبة الاثنين. يمكن تسهيل إعادة بناء توزيع الكروم الفلوري عن طريق كتابة النموذج الأمامي لكل من الإثارة وانتشار ضوء الانبعاث ، وهي وظيفة الخضر التي تصف الإثارة. يتبع انتشار الشعاع قانون لامبرت البيرة البسيط حيث moo A هو توزيع الامتصاص البصري المحدد مسبقا.
يمكن كتابة UX لشدة الضوء المنبعثة من المصدر عند الموضع الزائد ويقاس بواسطة الكاشف في الموضع XD على CC ، D كناتج للوظيفة الخضراء بثابت B يعتمد على النظام. يمكن بعد ذلك حساب التوزيع الدقيق لشدة ضوء الإثارة GX على طول كل مسار شعاع. تأخذ شدة التألق UFL المكتشفة في الكاشف XD الذي يتم تحفيزه بواسطة الضوء المنبعث من المصدر Xs في الاعتبار مساهمة جميع الثيرون الذين تم إثارتهم على طول مسار الشعاع من X إلى xd.
يمكن بعد ذلك كتابة النموذج الأمامي لمشكلة التصوير لدينا ك ub ub ، حيث يشتمل ألفا على الثوابت غير المعروفة التي تعتمد على النظام. ثم يتم تمييز النموذج الأمامي على الشبكة المفترضة ويتم إجراء انعكاس لاستخراج توزيع الفلوروكروم ، والحصول على كل من إشارة الإرسال والفلورسنت واستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي التقليدية لإعادة بناء العينة. هنا ، يتم عرض إعادة بناء التصوير المقطعي بالإسقاط البصري الفلوري التقليدي والإرسال.
تظهر إعادة بناء مستوى واحد من القلب في كل من الامتصاص والتألق. يتم تقديم إعادة بناء المولود الطبيعية وتظهر الفرق في توزيع الصبغة داخل القلب. بعد التطبيع ، أوضحنا لك للتو كيفية إعداد التصوير المقطعي البصري وكيفية إزالة القطع الأثرية بسبب الامتصاص البصري في عمليات إعادة بناء التصوير المقطعي الفلوري.
في الواقع ، من المهم جدا أن تضع في اعتبارك مسح العينة من أجل إزالة مساهمة الضوء المتناثر ، ولكن في نفس الوقت ، من المهم أيضا موازنة عملية المقاصة من أجل الحفاظ على أكبر قدر ممكن من مساهمة التألق. شيء آخر مهم جدا يجب تذكره عند استخدام هذا النهج هو حساب نسبة العظام الطبيعية التي يتم الحصول عليها عن طريق قسمة صور التألق على صور الامتصاص. هذا كل شيء.
شكرا لانضمامك إلى تجربتنا المرئية ونتمنى لك السعادة في تجاربك الخاصة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة نهجًا معتمدًا على Born لتصوير الإسقاط البصري (BnOPT) الذي يعزز دقة إعادة الإعمار الطبوغرافي الفلوري عن طريق مراعاة خصائص امتصاص العينات. يتم تطبيق الطريقة لإعادة بناء توزيع الكواشف الفلورينية الجزيئية في أعضاء الحيوانات الصغيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التصوير البصري
- تصوير الفلورة الطبوغرافي
- التصوير الطبي الحيوي
الخلفية
- تصوير الإسقاط البصري هو تقنية مستخدمة لتصوير العينات البيولوجية.
- قد لا تأخذ الطرق التقليدية في الاعتبار خصائص الامتصاص، مما يؤدي إلى عدم الدقة.
- الكواشف الفلورينية الجزيئية ضرورية لتصور العمليات البيولوجية.
- تحسين طرق إعادة الإعمار يمكن أن يعزز فهم وظائف الأعضاء.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة تعيد بناء توزيعات الفلورة بدقة.
- لمراعاة خصائص امتصاص العينات البيولوجية.
- لتحسين موثوقية تصوير أعضاء الحيوانات الصغيرة.
الطرق المستخدمة
- يتم تثبيت العينات وتضمينها في أسطوانة من الأوجير.
- يتم تدوير العينات وإضاءتها بطول موجي للإثارة.
- يتم قياس الإشارات الفلورينية في وضع الإضاءة العابرة.
- يتم حساب نسبة Born الطبيعية للمساعدة في إعادة الإعمار.
النتائج الرئيسية
- توفر طريقة BnOPT المقترحة إعادة بناء دقيقة للفلورة.
- تأخذ بشكل فعال في الاعتبار خصائص امتصاص العينات.
- نجحت الطريقة في تصور توزيع الكواشف في أعضاء الحيوانات الصغيرة.
- تظهر النتائج جودة تصوير محسنة مقارنة بالطرق التقليدية.
الاستنتاجات
- يعزز نهج BnOPT دقة تصوير الفلورة الطبوغرافي.
- يوفر طريقة موثوقة لدراسة العينات البيولوجية في الجسم الحي.
- يمكن لهذه التقنية أن تتقدم في مجال التصوير الطبي الحيوي وتحليل وظائف الأعضاء.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
