حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

تبدأ عملية تصنيع جهاز المزارع المشتركة للخلايا العصبية المعتمد على الموائع الدقيقة متعدد المقصورات بتحديد الخزانات على كتلة PMMA باستخدام آلة تفريز، يليه الكبس الحراري لمصفوفات القنوات الدقيقة التي تربط بين المقصورات. وبمجرد تحضير قالب A-P-M-M-A، يتم استنساخ قالب A-P-D-M-S الرئيسي من قالب PMMA ويُطلى بمادة ثلاثي كلورو إيثيلين. يتم استنساخ الجهاز النهائي من قالب PDMS الرئيسي وتجميعه على طبق زراعة مطلي بـ PDL.

يتم بعد ذلك تحميل عصبونات جرذان أولية من المرحلة الجنينية E 16 إلى 18 في حجرة الجسم الخلوي وتنميتها لمدة أسبوعين قبل إضافة خلايا قليلة التغصن من جرذان في المرحلة العمرية P 1 إلى 2 فوق الطبقات المحورية داخل حجرة GGL المحورية من أجل الزراعة المشتركة. مرحباً، أنا جي بار من مختبر النظم النانوية الحيوية في قسم الهندسة الكهربائية وهندسة الحاسوب بجامعة تكساس إيه آند إم. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصنيع منصة زراعة مشتركة للعصبونات بنظام الموائع الدقيقة متعددة الحجرات.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعل بين العصبونات والخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي في المختبر. لذا، فلنبدأ. لبدء هذا الإجراء، استخدم آلة تفريز دقيقة لعمل مقصورات بعمق 3.5 millimeter.

في كتلة A-P-M-M-A، حدد حجرة واحدة لسومـا (جسم الخلية) وست حجرات ggl للمحوار. بعد تحضير الحجرات، استخدم الموجات فوق الصوتية وكحول الإيزوبروبانول لمدة 10 دقائق لإزالة الشوائب، ثم اصنع هياكل ذات حواف دقيقة على الشريحة الزجاجية باستخدام عملية الطباعة الحجرية الضوئية التقليدية والetching الرطب، ثم قم بنقل أنماط الحواف الدقيقة من الزجاج عن طريق الكبس الحراري. قم بتمرير الشريحة على قالب PMMA الرئيسي أولاً، ثم قم بمحاذاة قالب PMMA الرئيسي والركيزة الزجاجية يدوياً.

ثم ارفع درجة الحرارة إلى 115 °C باستخدام مكبس حراري. وبمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة، طبق حمولة تبلغ 0.5 tons لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، برد العينة حتى 40 °C ثم حرر الضغط.

ابدأ الآن في تحضير قالب الـ PDMS الرئيسي. اخلط بوليمر PDMS الأولي مع عامل المعالجة الخاص به بنسبة 10 إلى 1 من حيث الوزن، وقطع قالب PMMA الرئيسي إلى كتل بحجم 50 millimeter في 50 millimeter. باستخدام منشار منحني، ضع القالب داخل وعاء وصب خليط PDMS فوق قالب PMMA، ثم ضع الوعاء في مجفف متصل بمضخة تفريغ و DGAs لمدة 15 minutes.

لإزالة الفقاعات الناتجة أثناء عملية خلط PDMS. وبمجرد إزالة جميع الفقاعات، ضع الوعاء في فرن موازن عند درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإتمام عملية البلمرة. وبعد أن يتصلب PDMS تمامًا، قم بنزع قالب PDMS الرئيسي عن قالب PMMA الرئيسي، ثم قم بطلاء قالب PDMS الرئيسي بالبخار عن طريق وضعه داخل مجفف مع نقطتين إلى ثلاث نقاط من trichlorethylene وتطبيق تفريغ هوائي لمدة 15 دقيقة.

يسهل طلاء قالب PDMS الرئيسي عملية تحرير جهاز الزراعة المشتركة للخلايا العصبية المصنوع من PDMS من قالب PDMS الرئيسي. وبعد الطلاء، يُشطف قالب PDMS الرئيسي سريعاً باستخدام isopropyl alcohol لإزالة trichlorethylene الزائد، ثم يُجفف باستخدام غاز النيتروجين. إن عملية تصنيع جهاز الزراعة المشتركة للخلايا العصبية من بوليمر PDMS تشبه عملية تحضير قالب PDMS الرئيسي الموصوفة في القسم السابق. ابدأ بخلط pre polymer الخاص بـ PDMS مع عامل التصلب بنسبة 10 إلى 1 من حيث الوزن، ثم اسكب خليط PDMS فوق قالب PDMS الرئيسي. ومن المهم عدم سكب كمية كبيرة من PDMS لضمان عدم غمر هيكل PDMS الذي يبلغ ارتفاعه 3.5 millimeter على القالب بالكامل.

وضع الـ DGAs داخل مجفف متصل بمضخة تفريغ لمدة 15 دقيقة. وعند إزالة جميع الفقاعات، يُوضع الـ PDMS داخل فرن مُسوى عند درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإتمام عملية البلمرة؛ وفي نهاية الساعة، يُخرج الـ PDMS من الفرن ويُترك في درجة حرارة الغرفة ليبرد. بعد ذلك، تُنزع أجهزة زراعة الخلايا العصبية المصنوعة من الـ PDMS برفق من قالب الـ PDMS الرئيسي.

غلف أجهزة PDMS بالبارافورم لحمايتها من الغبار أو الشوائب. وأخيراً، قم بقص قطع PDMS الملفوفة بالبارافورم إلى قطع فردية باستخدام مثقاب كهربائي مجهز بشفرة؛ وبذلك تصبح أجهزة PDMS الخاصة بالمستنبتات المشتركة للخلايا العصبية جاهزة تقريباً للاستخدام في أطباق زراعة الخلايا. وقبل وضع جهاز PDMS الخاص بالمستنبتات المشتركة للخلايا العصبية في طبق زراعة الخلايا، ضع الجهاز داخل منظف البلازما وعرّضه لبلازما الهواء لمدة 90 ثانية لجعل السطح محباً للماء.

سوف تسهل هذه المعالجة ملء القنوات الدقيقة بأوساط الزرع بعد التجميع على ألواح مغلفة بـ poly de lycine. ومن أجل تعقيم الجهاز المعالج بالبلازما، اغمره في ethanol بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة وانقل الحاوية إلى غطاء السلامة البيولوجي المعقم. بعد مرور 30 دقيقة، أخرج الجهاز وجففه باستخدام غاز النيتروجين المفلتر عبر مرشح millipore بمسامية 0.2 micron.

ضع بعد ذلك الأجهزة المجففة فوق طبق زراعة بوليسترين سداسي الفجوات مطلى بـ poly D lysine، واضغط برفق لضمان إحكام الغلق بين سطح طبق الزراعة وجليد الجهاز. الآن، املأ حجرة soma بالوسط الزراعي. انتظر لمدة دقيقة أو دقيقتين للتأكد من عدم وجود فقاعات محتبسة داخل القنوات الدقيقة.

بعد ذلك، املأ حجيرات دباق المحاور الست. وأخيرًا، قم بتحضين الأجهزة المملوءة بأوساط الزرع في حاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius طوال الليل لإزالة أي حطام محتمل أو بقايا سامة. وبعد التحضين طوال الليل، يمكن البدء في الزرع استعدادًا لتحميل الخلايا في الجهاز.

استخدم ماصة لسحب وسط الزرع من حجرتي الجسم الخلوي (Soma) والمحور العصبي (Axon). بعد ذلك، قم بتحميل 40 microliters من خلايا العصبونات الأولية للمخ الأمامي من جرذان في اليوم الجنيني 16 إلى 18 في حجرة الجسم الخلوي حول مداخل القناة الدقيقة بكثافة مساحية تبلغ 500 خلية لكل square millimeter. ومن المهم عدم لمس جهاز PDMS أثناء تحميل الخلايا لأن ذلك قد يؤدي إلى كسر الختم بين الجهاز وطبق زرع الخلايا.

تُظهر هذه الصور المجهرية خلايا عصبونية مصبغة بصبغة calcium am. داخل حجرة جسم الخلية (soma)، تم تحميل الخلايا بشكل متجانس وموضعها بالقرب من القنوات الموائعية الدقيقة. يتم تحضين الأجهزة المحملة بالخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لتعزيز التصاق الخلايا بالركيزة.

بعد هذه الحضانة، املأ جميع المقصورات بالوسط الزرعي. حافظ على نمو الخلايا في الجهاز عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5%CO2 مع استبدال نصف الوسط الزرعي فقط كل ثلاثة أو أربعة أيام. يجب أن تتكون شبكة محوربونية كثيفة داخل مقصورات Axon glia.

بعد أسبوعين من الزرع، تضاف خلايا CLIA العصبونية الأولية في المختبر؛ وقبل تحميل الخلايا، يتم سحب ما يقرب من 60% من وسط الزرع من المقصورات. تم استئصال الخلايا الدبقية قليلة التغصن (oligodendrocytes) من نصفي الكرة المخية لجرذان Sprague Dawley في اليوم الأول أو الثاني بعد الولادة. أضف 5 µL من خلايا oligodendrocytes إلى كل مقصورة axon glia بكثافة عددية تبلغ 1000 خلية لكل mm². يجب توخي الحذر لعدم لمس الركيزة السفلية باستخدام الماصة أثناء التحميل، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الشبكة المحورية المتكونة على الركيزة. بعد إضافة oligodendrocytes، تُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C ثم تملأ المقصورات.

باستخدام أوساط استنبات، استمر في استنبات العصبونات كما كان الحال قبل إضافة CLIA، مع تغيير نصف أوساط الاستنبات فقط كل ثلاثة أو أربعة أيام لمدة أسبوعين إضافيين أثناء دراسة التفاعل بين المحاور والمنسوجات الدبقية في الجهاز العصبي المركزي للثدييات عند تنفيذ التجارب بشكل صحيح. تتركز الخلايا العصبية المحملة في حجرة الجسم الخلوي بالقرب من مداخل القنوات الدقيقة، وتبدأ طبقة محورية في التشكل داخل حجرات Axon Ggl.

بعد أسبوع واحد من الاستزراع، يمكن أن تكون علامات تكتل الخلايا العصبية داخل حجرة السوما مؤشراً على أن الخلايا ليست سليمة عند تحميل الخلايا الدبقية قليلة التغصن. وبعد أسبوعين من استزراع الخلايا العصبية، يجب أن تكون حجرات المحاور العصبية مغطاة بطبقة كثيفة من المحاور، ويجب تحميل الخلايا الدبقية قليلة التغصن فوق طبقة المحاور العصبية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصنيع منصة استزراع مشترك عصبي متعددة الحجرات وكيفية استخدامها لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المركزي في المختبر (in vitro).

عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر حماية الأجهزة من الغبار وعدم تعقيمها بالإيثانول لفترة طويلة جداً لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الترابط. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.