Name: تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: تعلم تنقية الميتوكوندريا من خميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام التحلل المائي والطرد المركزي الكثيف. تضمن هذه الطريقة عزلاً نقياً للميتوكوندريا مع الحفاظ على سلامتها البنيوية والوظيفية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من CIHR NSERC وكندا. فيتامين هو محقق جديد CIHR وكرسي أبحاث جامعة كونكورديا في علم الجينوم ، بيولوجيا الخلية والشيخوخة.

المواد والأساليب سلالات الخميرة وظروف النمو كانت تزرع سلالة من النوع البري BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) في المتوسط ​​YEPD الغنية (1 ٪ خلاصة الخميرة ، ببتون 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪). والخلايا المستزرعة في 30 درجة مئوية مع الهز التناوب في 200 دورة في الدقيقة في قوارير مخروطي في نسبة &quot;قارورة حجم / متوسطة الحجم&quot; ل05:01. كسر عزلة الميتوكوندريا الخام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 لتر تنمو ثقافة BY4742 سلالة من النوع البري لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ثقافة في 500 مل من أنابيب الطرد المركزي Nalgene. تحقيق التوازن في تحميل وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب مكعبات الخلايا وطاف resuspend في 250 مل من dH2O. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب مكعبات الخلايا وطاف resuspend في 250 مل من dH2O. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الوزن الرطب للبيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة DTT [2 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق نقل الخلية إلى 50 مل أنابيب بلاستيكية من طراز فالكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير أنابيب في 70 دورة في الدقيقة في شاكر لمدة 20 دقيقة حتى 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة Zymolyase دون [7 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز] Zymolyase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة Zymolyase دون [7 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز] Zymolyase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق نقل الخلية إلى قارورة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مسحوق Zymolyase - 100T [1 ملغ من الخلايا (الوزن الرطب) Zymolyase - 100T / ز] إلى تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير القارورة مع تعليق خلية في الدقيقة 70 في شاكر لمدة 30 دقيقة حتى 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شكلت spheroplasts نقل نظرا لهضم جدار الخلية مع Zymolyase - 100T إلى 50 ميلي أنابيب الطرد المركزي من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه spheroplasts بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في XG 2200 في 4 درجات مئوية. </li></ol> وينبغي القيام ** جميع الخطوات اللاحقة بها في 4 درجات مئوية أو على الجليد. وينبغي التعامل مع تعليق من spheroplasts بلطف باستخدام ماصات مع نصائح لتجنب خفض كسر العضيات **. <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts مكعبات الثلج في تجانس العازلة الباردة [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه spheroplasts بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في XG 2200 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts مكعبات الثلج في تجانس العازلة الباردة [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى ما قبل المبردة على الثلج الزجاج الخالط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مدقة ضيقة ، التجانس الخلايا السكتات الدماغية عن طريق جعل 15 في مدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 العازلة تجانس حجم الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل spheroplasts المتجانس إلى 50 ميلي أنابيب الطرد المركزي من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا دون انقطاع ، نوى ، والحطام الكبيرة التي الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطاف الطرد المركزي الناتجة عن 5 دقائق في 3000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطاف الطرد المركزي الناجمة عن 15 دقيقة في XG 12000 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وطاف بيليه resuspend في الجليد الباردة العازلة التجانس [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطاف الطرد المركزي الناجمة عن 15 دقيقة في XG 12000 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وطاف بيليه resuspend في 3 مل من العازلة SEM الجليد الباردة. </li></ol> ** على الرغم من أن هذا التعليق المخصب في الميتوكوندريا ، كما أنه يحتوي على عضيات أخرى مثل شبكية هيولي باطني (microsomes) ، غولجي ، والفجوات. للحصول على الميتوكوندريا نقية ، يمكن إخضاع هذا الكسر الخام الميتوكوندريا إلى مزيد من التجزئة ، كما هو موضح أدناه **. تنقية الميتوكوندريا خالية من التلوث العضيات الأخرى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 1.5 مل من 60 ٪ من الجليد الباردة (ث / ت) السكروز في EM العازلة في جهاز للطرد المركزي بيكمان أنبوب فائقة الوضوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب 60 ٪ (W / V) السكروز مع 4 مل من 32 ٪ ، و 1.5 مل من 23 ٪ ، و 1.5 مل من 15 ٪ سكروز (جميع عازلة بالوزن / V في EM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 مل من مكان الكسر في الميتوكوندريا الخام في SEM العازلة على أعلى من 15 ٪ (W / V) السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الدوار SW41 بيكمان الدلو المتأرجح تي في : 1 ح 134000 XG (33000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شكل فرقة موسيقية سليمة الميتوكوندريا البني في 60 ٪ / واجهة السكروز 32 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية السكروز حتى تصل الفرقة الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفرقة الميتوكوندريا باستخدام ماصة مع طرف قطع ووضعها في أنبوب الطرد المركزي لبيكمان الدوار MLS - 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الأنبوب مع العازلة SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الميتوكوندريا النقي عن طريق الطرد المركزي في الدوار MLS - 5 لمدة 30 دقيقة في XG 10000 (31000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف بهماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الميتوكوندريا نقية للتحليل وظائف الميتوكوندريا ، والميتوكوندريا بروتيوم lipidome ، والحمض النووي. </li></ol> الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DTT العازلة [100 ملي Tris/H2SO4 (الرقم الهيدروجيني 9.4) ، 10 ملي dithiothreitol] (15 مل) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 مل من 1 العازلة Tris/H2SO4 M (الرقم الهيدروجيني 9.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 ميكرولتر من DTT M 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى حجم 15 مل </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zymolyase العازلة [البوتاسيوم 20 ملي الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) ، 1.2 M السوربيتول] (100 مل) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مل من 1 M البوتاسيوم العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 مل من 2 M السوربيتول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجم 100 مل </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التجانس [10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة) ، و 0.6 M السوربيتول ، 1 ملم EDTA ، 0.2 ٪ (ث / ت) BSA] (250 مل] <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 مل من تريس M 1 / العازلة حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 مل من 2 M السوربيتول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 غرام من جيش صرب البوسنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجم 250 مل </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SEM العازلة [10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (7.2 درجة الحموضة) ، و 250 السكروز ملم ، 1 ملم EDTA] (250 مل) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 مل من اجتماعات الأطراف M 1 / KOH العازلة (درجة الحموضة 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 مل من السكروز م 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجم 250 مل </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EM العازلة [10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (7.2 درجة الحموضة) ، 1 ملم EDTA] (250 مل) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 مل من اجتماعات الأطراف M 1 / KOH العازلة (درجة الحموضة 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجم 250 مل </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

هذه الطريقة تمكن من عزل عالية الغلة من الميتوكوندريا نقية من خلايا الخميرة. الميتوكوندريا يطهر هذا الأسلوب أساسا خالية من التلوث وغيرها من العضيات المحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية الخاصة بهم بعد تنقيتها. عائدات الطريقة الموصوفة الميتوكوندريا التي هي مناسبة لإعادة تشكيل خلية خالية من العمليات الأساسية الميتوكوندريا. ويمكن أيضا هذه الميتوكوندريا نقية للغاية أن تستخدم لتحليل بنية الميتوكوندريا ووظائفها ، والميتوكوندريا بروتيوم lipidome ، والحمض النووي.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

الميتوكوندريا هي الموقع الرئيسي لإنتاج ATP أثناء عملية التمثيل الغذائي في الخلايا الهوائية غير حقيقية النواة الضوئي<sup&gt; 1</sup&gt;. هذه العضيات معقدة تلعب أيضا دورا أساسيا في موت الخلايا أفكارك<sup&gt; 2</sup&gt; بقاء الخلية ،<sup&gt; 3</sup&gt; والتنمية الثدييات<sup&gt; 4</sup&gt; ، وتطوير الخلايا العصبية وظيفة<sup&gt; 4</sup&gt; ، مما يشير إلى داخل الخلايا<sup&gt; 5</sup&gt; ، وطول العمر التنظيم<sup&gt; 6</sup&gt;. فهمنا لهذه العمليات البيولوجية المعقدة التي تسيطر عليها الميتوكوندريا تعتمد على أساليب قوية لتقييم التشكل من البروتين ، وتكوين الدهون وسلامة عينات من الحمض النووي ، وظائفها الحيوية العديدة. الخميرة في مهدها<em&gt; السكيراء الجعوية</em&gt; وراثيا وكيميائيا حقيقي النواة وحيدة الخلية تلاعب مع الجينوم بروتيوم المشروح ومحددة جيدا ، هو نموذجا قيما لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة الوظائف البيولوجية الأساسية للالميتوكوندريا. لهذه الأنواع من الدراسات ، من الأهمية بمكان أن يكون الميتوكوندريا نقية للغاية. هنا نقدم وصفا مفصلا لطريقة سريعة وفعالة لتنقية الخميرة الميتوكوندريا. هذه الطريقة تمكن من عزل الميتوكوندريا عالية نقية خالية من التلوث أساسا العضيات الأخرى والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية الخاصة بهم بعد تنقيتها. الميتوكوندريا تنقيته بواسطة هذه الطريقة هي مناسبة لإعادة تشكيل خلية خالية من العمليات الأساسية الميتوكوندريا ، ويمكن استخدامها لتحليل بنية الميتوكوندريا ووظائفها ، وlipidome بروتيوم الميتوكوندريا ، والحمض النووي.

نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لتنقية الميتوكوندريا من الخميرة<em&gt; السكيراء الجعوية</em&gt;. هذه الطريقة تمكن من عزل عالية الغلة من الميتوكوندريا نقية خالية من التلوث أساسا العضيات الأخرى والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية الخاصة بهم بعد تنقيتها.

تُعد الميتوكوندريا الموقع الرئيسي لإنتاج ATP أثناء الأيض الهوائي في الخلايا حقيقية النواة غير الضوئية1. كما تلعب هذه العضيات المعقدة...

يبدأ هذا البروتوكول بتحويل خلايا الخميرة إلى كرويات (Spheroplasts) عن طريق هضم جدار الخلية باستخدام إنزيم zymolyase، ثم يتم تجنيس الكرويات باستخدام مجنس زجاجي مطلي بالتفلون. ويخضع التجنيس الناتج لعمليتي طرد مركزي لترسيب الخلايا غير المتكسرة، والنوى، والحطام الخلوي الكبير. بعد ذلك، يتم طرد السائل الطافي الناتج مركزياً لمدة 15 minutes عند 12,000 Gs لترسيب الميتوكوندريا.أخيرًا، يتم إخضاع الجزء الميتوكوندري الخام الذي لا يزال يحتوي على عضيات أخرى للطرد المركزي لمدة 60 دقيقة عند 134, 000 Gs في تدرج كثافة السكروز، حيث يتم استعادة الميتوكوندريا النقية الخالية من التلوث بالعضيات الأخرى عند الواجهة الفاصلة بين السكروز بتركيز 60% weight per volume و32% weight per volume. مرحبًا، أنا الدكتور Christopher Greg من مختبر الدكتور Vladimir tko في قسم الأحياء بجامعة Concordia. سأوضح لكم اليوم كيفية عزل الميتوكوندريا من خميرة *Saccharomyces cerevisiae*.نقوم بذلك لدراسة الديناميكيات والتغيرات المرتبطة بالعمر التي تحدث في الميتوكوندريا. ومع تقدم عمر الخلايا، سنقوم بدراسة التغيرات في البروتوم، والليبيدوم، والحمض النووي DNA الخاص بالميتوكوندريا. لذا، فلنبدأ.ابدأ هذا البروتوكول بتنمية سلالة الخميرة في عشر دوارق سعة 250 milliliter. يحتوي كل منها على 50 milliliters من وسط YP عند درجة حرارة 30 °C مع الرج الدوراني لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، صب المزرعة في أنابيب طرد مركزي Nalgene سعة 500 milliliter.قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا المترسبة في 250 milliliters من الماء المقطر، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة، ثم أعد تعليق الخلايا المترسبة في 250 milliliters من الماء المقطر وقم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق.عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، قم بوزن كتلة الخلايا الرطبة الناتجة، ثم أعد تعليق الخلايا المترسبة في منظم DTT وانقل معلق الخلايا إلى دورق سعة 250 milliliter. قم بتدوير الدورق بسرعة 70 RPMs عند درجة حرارة 30 degrees Celsius لمدة 20 دقيقة. بعد مرور الـ 20 دقيقة، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الخلايا المترسبة في منظم Xs بدون Xs وقم بإجراء الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.عند 3000 Gs في درجة حرارة الغرفة، أعد تعليق الخلايا المترسبة في منظم Zy بدون Xs مرة أخرى وانقل معلق الخلايا إلى دورق زجاجي. أضف مسحوق zy liase 100 T إلى معلق الخلايا وقم بتدويره بسرعة 70 RPMs في هزاز عند درجة حرارة 30 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة؛ حيث سيعمل Zy liase 100 T على هضم جدران الخلايا لتكوين Sphero plats. يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة لعملية هضم X الموضحة سابقاً عند درجة حرارة four degrees Celsius أو على الثلج.يجب التعامل مع معلقات الـ splats برفق باستخدام ماصات ذات رؤوس مقصوصة لتجنب تحطم العضيات. عند الانتهاء من عملية الهضم بواسطة XMO لمدة 30 دقيقة، تُنقل الـ Sphero plats إلى أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 50 milliliter، ثم تُطرد مركزياً لمدة ثماني دقائق عند 2200 Gs وبدرجة حرارة أربعة درجات Celsius، ثم يُعاد تعليق الـ S splats المترسبة في محلول منظم للتجانس بارد جداً (ice cold)، وتُطرد الـ S splats مركزياً لمدة ثماني دقائق عند 2200 Gs وبدرجة حرارة أربعة درجات Celsius.أعد تعليق السفيروبلاست المترسب في محلول منظم للتجانس مبرد بالثلج، وانقل الخلايا إلى مجانس زجاجي مبرد مسبقاً. وباستخدام مدقة محكمة، قم بتجانس الخلايا عن طريق تحريك المدقة 15 مرة.أضف حجماً مساوياً من محلول التجانُس المنظم المبرد بالثلج إلى عينات الـ S المتجانسة، ثم انقلها إلى أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 50 milliliter. قم بطرد العينات المتجانسة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 1500 Gs في درجة حرارة أربع درجات Celsius لترسيب الخلايا غير المكسورة والنوى والحطام الكبير. صب السائل الطافي الناتج في أنابيب جديدة وقم بطرده مركزياً لمدة خمس دقائق.عند 3000 Gs وبدرجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك، يتم طرد السائل الطافي الناتج مركزياً لمدة 15 دقيقة عند 12,000 Gs وبدرجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم يُسكب السائل الطافي ويُعاد تعليق الراسب في محلول منظم للتجانس بارد وموضع على الثلج.يتم إعادة تعليق الراسب لمدة خمس دقائق عند 3000 Gs في درجة حرارة أربع درجات مئوية. وأخيرًا، يتم طرد السائل الطافي الناتج مركزيًا لمدة 15 دقيقة عند 12,000 Gs في درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم يُسكب السائل الطافي ويُعاد تعليق الراسب في ثلاثة ملليلتر من محلول مبرد بالثلج.محلول SEM المنظم. يمثل هذا المعلق الجزء الميتوكوندري الخام. وبالرغم من كونه غنيًا بالميتوكوندريا، إلا أنه يحتوي أيضًا على عضيات أخرى مثل الشبكة الإندوبلازمية أو الجسيمات الدقيقة GOGI وVAs للحصول على ميتوكوندريا نقية.سيخضع المعلق لمزيد من التجزئة كما هو موضح في القسم التالي. لبدء تجزئة معلق الميتوكوندريا الخام للحصول على ميتوكوندريا نقية، ضع 1.5 milliliters من محلول السكروز بتركيز 60%weight per volume في منظم em، المبرد في الثلج، داخل أنبوب طرد مركزي من نوع Beckman UltraClear.بعد ذلك، قم بإضافة أربعة مليلتر من 32%sucrose، و1.5 مليلتر من 23%sucrose، و1.5 مليلتر من 15%sucrose برفق فوق طبقة 60%sucrose، وكلها بتركيز وزن/حجم في محلول em. Buffer، ثم ضع ثلاثة مليلتر من كسر الميتوكوندريا الخام في محلول SEM buffer فوق طبقة 15%weight per volume. Sucrose، وقم بإجراء عملية الطرد المركزي في جهاز Beckman SW 41 TI ذو الدوار ذي السلال المتأرجحة لمدة ساعة واحدة عند 134, 000 Gs أو 33, 000 RPMs عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.بعد عملية الطرد المركزي، ستشكل الميتوكوندريا السليمة حزمة بنية عند السطح الفاصل بين تركيز السكروز 60% و32%. قم بإزالة السكروز بعناية حتى الوصول إلى حزمة الميتوكوندريا باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع، ثم اسحب حزمة الميتوكوندريا وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي من نوع Beckman. بالنسبة لجهاز الطرد المركزي MLS five rotor، املأ الأنبوب بمحلول SEM buffer، وقم بترسيب الميتوكوندريا النقية عن طريق الطرد المركزي في MLS five rotor عند 10,000 GS أو 31,000 RPM لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم تخلص من السائل الطافي.يمكن الآن استخدام هذه الميتوكوندريا النقية لتحليلات وظائف الميتوكوندريا، والبروتيوم الميتوكوندري، والليبيدات، والحمض النووي الميتوكوندري. خضع الجزء الميتوكوندري الخام في المسارات اليسرى والميتوكوندريا المنقاة عن طريق الطرد المركزي في تدرج كثافة السكروز في المسارات اليمنى لتقنية SDS page واللطخة المناعية باستخدام أجسام مضادة لعلامات بروتينية لعضيات مختلفة. تم تأكيد وجود الميتوكوندريا في كلا التحضيرين من خلال التفاعلية المناعية لـ PO one P و COX one p، وأشارت اللطخة المناعية إلى وجود DP M1 P و FO 13 p و VPS 10 P، والتي تمثل بروتينات الشبكة الإندوبلازمية، والجزيئات الحبيبية، وجهاز جولجي على التوالي في الجزء الميتوكوندري الخام.وفي المقابل، لم يتم الكشف عن بروتينات العلامات هذه في الميتوكوندريا المنقاة، مما يؤكد أن البروتوكول قد أنتج ميتوكوندريا خالية من التلوث بالعضيات الأخرى. وبذلك نكون قد أوضحنا لكم كيفية عزل الميتوكوندريا من خميرة sace visier. فقط تذكر عند إجراء هذه التجربة عدم ترك الخلايا تحضن في zy lies 100 T لفترة تزيد عن نصف ساعة، لأن ذلك قد يعرض بروتينات الغشاء أو بروتينات العضيات التي قد تكون موجودة في الخلايا لخطر التحلل.قد يعود ذلك إلى وجود البروتياز في الكاشف. أيضاً، عندما تكون على وشك عزل الميتوكوندريا وتدرج السكروز، يمكنك تجميد هذه الميتوكوندريا عند -20 °C قبل القيام بذلك، ثم إذابتها عندما تصبح مستعداً لإجراء خطوة الطرد المركزي فعلياً. هذا كل شيء.بالتوفيق في تجاربكم.

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تلوث استعدادات حقيقية النواة ريبوسوم تنقيته بواسطة الطرق التقليدية التي شاركت في تنقية nucleases البروتياز ويؤثر سلبا على مجرى النهر التحاليل البيوكيميائية والهيكلية. ويتم استخدام أسلوب بسيط وسريع لتنقية الكروماتوغرافي لحل هذه المشكلة باستخدام الخميرة ريبوسوم كنظام النموذج.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ظروف متنوعة من أجل الكشف عن آليات مرنا التعريب والترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا.

عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن، وجعل، وتنقية عدة بورات التوكسينات الناقلين بالتماثل للأسرة الناقل SLC4 باستخدام الخميرة. كما يصف لنا مقايسة cross-linking كيميائية لتقييم البروتينات هوموميريك المنقي للجمعية مولتيميريك. هذه البروتوكولات يمكن تكييفها للبروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

نقدم بروتوكولا من خطوتين لعزل الميتوكوندريا عالي الجودة متوافق مع اكتشاف البروتين وقياسه على نطاق البروتين. لا يتطلب بروتوكولنا هندسة وراثية وبالتالي فهو مناسب لدراسة الميتوكوندريا من أي خلايا وأنسجة أولية.

عزل الميتوكوندريا بخطوتين بدون علامات لتحسين اكتشاف البروتين وقياسه

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

يشرح هذا العمل كيفية تحويل ميتوكوندريا الخميرة باستخدام طريقة بيولوجية. نوضح أيضا كيفية اختيار وتنقية المحولات وكيفية إدخال الطفرة المطلوبة في الموضع المستهدف داخل جينوم الميتوكوندريا.

تحول الميتوكوندريا في بيكر

يعد تنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الكاملة مؤشرا قيما للطاقة الحيوية للخلية. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد هذا النمط الظاهري الذي ينطبق على أنواع الخميرة المختلفة.

القياس الكمي لتنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الكاملة

تظهر الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe كنموذج جذاب لدراسة الميتوكوندريا. هنا ، نصف بروتوكولا لتحليل وفرة وتجميع مجمعات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في S. pombe. يتيح ذلك توصيف الوظائف الجديدة للجينات المحفوظة في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.

تحليل التعبير والمجمعات لبروتينات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في الخميرة الانشطارية Schizosaccharomyces pombe

تعلم تنقية الميتوكوندريا من خميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام التحلل المائي والطرد المركزي الكثيف. تضمن هذه الطريقة عزلاً نقياً للميتوكوندريا مع الحفاظ على سلامتها البنيوية والوظيفية.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

استكشف المزيد من الفيديوهات