الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

تبدأ هذه العملية بصف أجنة سمك الزبرا في مرحلة الخلية الواحدة داخل لوحة حقن مجهري. يتم حقن محلول ديكسترين فلوري في المح. وتكون الأجنة المحقونة الموجودة أسفل الخلية مباشرة هي الجهات المانحة لعملية الزرع.

قم بطلاء أجنة المانح والمضيف وتركتها لتنمو حتى مرحلة الدرع (shield stage)، ثم ضع جنينين محقونين بالدكسترين ومطليين بـ DEC جنباً إلى جنب في بئر واحدة من طبق الزرع. كرر هذه العملية لكل زوج من المانحين أدناه. أضف جنيناً مضيفاً واحداً في كل بئر لتوجيه الخلايا المزروعة نحو الدماغ الأمامي (di encephalon) المستقبلي؛ انقل الخلايا من وإلى الخط المتوسط.

في منتصف المسافة بين القطب الحيواني والدرع. انقل الخلايا من غازا المانحة إلى غازا المضيفة. اتركها تنمو حتى 30 ساعة ثم قم بالتثبيت.

قم بإجراء الكيمياء المناعية إذا لزم الأمر، ثم قم بالتثبيت والتصوير. بدلاً من ذلك، قم بتثبيت المضيف وهو حي وأجرِ تصويراً بفاصل زمني. مرحباً، اسمي إليزابيث دي شين من مختبر الدكتور مايكل إي سي في قسم العلوم البيولوجية في كلية سميث في نورثامبتون، ماساتشوستس.

وأنا الباحث الرئيسي في المختبر، الدكتور مايكل بيسي. سنوضح لكم اليوم كيفية إنشاء أجنة خيمرية (chimeric embryos) عن طريق إجراء عمليات نقل للخلايا في المرحلة المعدية باستخدام نظام نموذج سمك الزيبرا. نستخدم هذا الإجراء في مختبري لدراسة وظائف جينات محددة في تطور صوار الدماغ الأمامي، بالإضافة إلى عملية التفاعلات بين المحاور العصبية والدبق أثناء تكوين الصوار.

لنبدا الآن. لبدء العمل، قم بتجهيز قوالب المزاريب لصفائح الحقن المجهري عن طريق كسر ثلاث شعيرات دقيقة غير خيطية، بقطر 1 mm وطول 4 بوصة، إلى نصفين بعناية. وباستخدام الغراء القوي، قم بلصق نصفين من الشعيرات جنباً إلى جنب على سطح مستوٍ.

ضع الأنبوب الشعري الثالث فوق هذين الأنبوبين، بحيث يستقر في الأخدود ليشكل شكلاً هرمياً. ومع وجود الأنابيب الشعرية الثلاثة، اترك القالب ليجف. يجب تجهيز ما بين ثلاثة إلى خمسة قوالب لكل لوحة حقن.

بعد ذلك، قم بتحضير أطباق الحقن عن طريق صب 20 إلى 25 milliliters من وسط aros بنسبة 1.5% المصهور والمخصص للأجنة في طبق Petri dish بقطر 100 millimeter. ضع على الفور ثلاثة إلى خمسة من قوالب الميزاب المحضرة في قاع الطبق، مع التأكد من أن الجانب المسطح للقالب يلامس قاع Petri dish ومغطى تماماً بـ aros. وعندما يتصلب aros، قم بإزالة قوالب الميزاب عن طريق قطع مربع كبير من aros يحتوي عليها.

قم بإزالة الآجار برفق من محيط المربع المقطوع وتخلص منه. اقلب قطعة الآجار المربعة، وباستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة قوالب القنوات تماماً. صب الآجار المنصهر في طبق بتري حول المربع لتثبيت الآبار التي تم تشكيلها حديثاً في مكانها.

اتركها لتتصلب. يمكن إغلاق الأطباق بإحكام باستخدام مادة البارافورم (paraform) وتخزينها لعدة أسابيع عند درجة حرارة 4 °C. ويجب التخلص منها في حال ظهور أي علامات نمو في الآغار.

أخيراً، لتحضير إبر الحقن، استخدم جهاز سحب الشعيرات الشعرية للماصات الدقيقة (micro pipette capillary puller) لصنع الإبر من شعيرات زجاجية بطول أربع بوصات وقطر واحد مليمتر تحتوي على خيوط داخلية، مع تحضير لوحة الحقن الدقيق والإبر. لننتقل الآن إلى جمع الأجنة وإعداد جهاز الحقن الدقيق. تُجمع البيوض المخصبة فور وضعها وتُحفظ في طبق بتري مملوء بوسط جنيني.

باستخدام ماصة زجاجية ذات طرف عريض، يتم تفريغ الأجنة في آبار لوحة حقن في درجة حرارة الغرفة مملوءة بوسط جنيني. استخدم ملقطاً غير مدبب وممسكاً لتثبيت الأجنة برفق في قاع الأخاديد، مع التخلص من الأجنة التي تعرض الغشاء الكوريوني أو المح يحتوي على تلف.

بعد ذلك، قم بتعبئة إبرة الحقن من واحد إلى اثنين µL من محلول Alexa 594 dextrin الفلوري المخفف. اترك الدكستران ينتقل إلى طرف إبرة الحقن عن طريق الخاصية الشعرية. قم بتثبيت إبرة الحقن في حامل الشعيرات الخاص بالمتحكم الدقيق في التوجيه المجسم (stereotactic micro manipulator) واضبط الضغط في جهاز الحقن الدقيق للبدء.

من 40 إلى 50 PSI ومدة نبضة تبلغ 500 milliseconds. استخدم الملاقط لكشط أو قص طرف إبرة الحقن برفق لكسر الختم. ويُفضل أن يتراوح القطر بين 0.05 إلى 0.15 millimeters.

لمعايرة الإبرة، استخدم مجهراً ستيريو وقم بطرد الدكسترين على ميكرومتر مغطى بالزيت المعدني. قم بتعديل حجم الجرعة (bolus) عن طريق ضبط مدة ضغط الهواء للنبضة وحجم الإبرة. نصيحة: يجب الحفاظ على حجم جرعة يعادل حجماً يتراوح من 0.8 إلى 1 نانوليتر طوال فترة الحقن.

يمكننا الآن البدء في الحقن المجهري للدكسترين باستخدام تكبير يبلغ حوالي 3.2x على مجهر ستيريو. ابدأ بحقن الأجنة من أحد طرفي الحوض عبر اختراق الغشاء الكوريوني والغشاء الخلوي للأجنة بسلاسة للدخول إلى المح، ثم احقن محلول الدكسترين أسفل الخلية مباشرة.

تأكد من إزالة إبرة الحقن بنفس الحركة السلسة التي استُخدمت لإدخالها في الجنين. حرك طبق بيتري لوضع الجنين التالي في الصف، واستمر في عملية الحقن على طول الميزاب. تحقق من الضغط وحجم الجرعة المحقونة بشكل دوري.

استخدم الآن الملاقط لدفع الأجنة برفق خارج القنوات. انقلها إلى طبق بتري مملوء بوسط أجنة مضاد للمضادات الحيوية. قم بتحضين الأجنة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية وراقبها للكشف عن البويضات غير المخصبة أو الوفيات.

أصبحت الأجنة الآن جاهزة لعمليات الزرع المستقبلية. قبل إتمام عملية التبليغ أثناء مرحلة التغذية بالغاز، تظل أجزاء من المحّ مكشوفة. ويتميز المحّ بكونه هشاً للغاية، وسوف يلتصق بـبلاستيك أطباق بتري ويتمزق بسهولة.

لذلك، يجب تغطية الأجنة على أطباق مطلية قبل يوم واحد من إجراء عمليات الزرع. يتم تحضير أطباق التغطية هذه عن طريق صب 5 إلى 10 مللي لتر من مادة aros المنصهرة في طبق بتري بقطر 100 ملم. يلزم وجود طبقة رقيقة من مادة aros بسمك يتراوح بين 2 إلى 3 ملم فقط لتوفير وسادة للأجنة أثناء عملية التغطية.

اترك الأطباق حتى تبرد. بعد ذلك، قم بإعداد أطباق نقل منفصلة عن طريق صب 30 milliliters من محلول 1.5%aros في طبق بتري مقاس 100 millimeter وأدخل قالب بئر النقل. يجب أن يحتوي القالب على 104 تجويف مثلث الشكل، يتكون كل منها من ثلاثة أضلاع بزاوية 90 degree وضلع واحد بزاوية 45 degree.

صُممت الآبار لاستيعاب جنينين جنبًا إلى جنب. يجب الحرص على عدم حبس فقاعات هواء تحت القالب وترك مادة الأجار لتتصلب. يكشف إزالة القالب عن منطقة غائرة تحتوي على آبار مربعة ذات حواف منحدرة.

لتحضير أجنة المضيف والمناحلة لعملية النقل، يجب مراقبة تطورها للحفاظ على أزواج متطابقة تقريباً من حيث العمر. ولتحقيق ذلك، يمكن تربية الأجنة في درجات حرارة تتراوح من 23 إلى 31 درجة مئوية لإبطاء أو تسريع عملية التطور. يجب طلاء كل من أجنة المضيف والمناحلة يدوياً على طبق طلاء مطلي قبل ساعة واحدة من العمر المطلوب.

في حالة عمليات الزرع في المرحلة المعدية (gastro stage)، يجب إكمال هذه الخطوة بحلول خمس ساعات بعد الإخصاب أو HPF، وقبل مرحلة الدرع (shield stage) عند 5.5 HPF. استخدم ماصة زجاجية لنقل الأجنة المضيفة والمجيرة إلى طبق زرع مملوء بوسط أجنة مضاد للمضادات الحيوية. هنا، يتم ملء الصف الأول بالأجنة المانحة بمعدل جنينين في كل بئر، بينما يتم ملء الصفين التاليين بجنين مضيف واحد في كل بئر.

بالنسبة لعمليات الزرع، نستخدم مجهر ستيريو فلوري من نوع Zeiss luer يتميز بالتحكم الآلي الكامل في التكبير والتركيز عبر عصا تحكم. ورغم أن هذا المجهر الآلي ليس ضرورياً، إلا أنه يزيد بشكل كبير من سهولة وكفاءة عمليات الزرع الجراحية الدقيقة هذه، خاصة عند الرغبة في إجراء عدد كبير من عمليات الزرع. لإعداد جهاز الزرع، يتم ضبط مسار الهواء einor على الموقع الأوسط من مقياسه، وتوصيل أنابيب مسار الهواء بحامل الشعيرات، ثم تثبيت الحامل في الميكرو-مناور einor الآلي. وبعد تجهيز الأجنة وجهاز الزرع، يمكننا الآن الانتقال إلى عمليات زرع الخلايا في المرحلة المعدية.

تتمثل المهارة الأكثر أهمية في إتمام عمليات زرع الخلايا في مرحلة الجاسترولا في القدرة على تمييز التشريح الخلوي للـ dorsal blasts APO lip، المعروف أيضاً باسم الدرع (shield) في أسماك الزيبرفيش. نقدم هنا مقطع فيديو متسلسلاً للجاسترولا من وجهات نظر مختلفة، ونبرز موقع الدرع في هذا العرض الجانبي. يقع الدرع أو الجانب الظهري إلى اليمين ضمن الإطار الأحمر لتحديد الخلايا المستهدفة لزرع خلايا الدماغ الأمامي من وإلى الخط الناصف.

في منتصف المسافة تماماً بين القطب الحيواني والدرع، سنبدأ بتدوير الجنين أولاً باتجاهك لعرض القطب الحيواني، مع تسليط الضوء على الدرع وموقع الزرع أثناء ذلك. بعد ذلك، يدور الجنين حول محوره لوضع الدرع في الأسفل. ثم تدور الجاسترولا الآن للأعلى مرة أخرى، لتمنحك رؤية ظهرية مباشرة.

يتم الآن تدوير الجنين بالتسلسل للعودة إلى العرض الجانبي عند 6 HPF. باستخدام الملاعب الدقيق، قم بلمس الجنين بلطف بطرف الشعيرية لتدويره إلى وضعية تسمح باستخلاص الخلايا بحيث يكون الخط المتوسط والدرع مرئيين ومقابلين لطرف الشعيرية؛ ويمكن التحقق من الأجنة المانحة بسهولة عن طريق التبديل من الإضاءة ذات المجال الساطع إلى الإضاءة الفلورية. هنا، تظهر خلايا الـ gastro بفلورة حمراء. قم بسحب كمية صغيرة من وسط الجنين إلى داخل الشعيرية للقضاء على أي احتمال لملامسة الخلايا للسطح الفاصل بين الهواء والماء، مما قد يؤدي إلى تلفها.

قم بثقب الأديم الظاهر للجنين المانح برفق عند الخط الناصف، تحديداً بين القطب الحيواني والدرع. كانت هناك طبقة من الخلايا يبلغ سمكها حوالي 20 micrometers فقط بين الأديم الظاهر السطحي والمح يقع تحته في منطقة gasa. لذا، كن حذراً من ثقب المح، لأن ذلك غالباً ما يؤدي إلى الوفاة في غضون ساعات.

استخدم جهاز سحب الهواء لشفط الخلايا ببطء إلى داخل الشعيرة. حافظ دائماً على رؤية خط الماء مع تحريك الطرف تحريكاً خفيفاً. سيساعد التواجد بالداخل على إرخاء الاتصالات بين الخلايا.

يجب استخراج ما يقرب من 10 إلى 50 خلية من الجنين المانح. بعد ذلك، قم بإزالة الشعيرة من المانح. قم بتوجيه الجنين المضيف بشكل مماثل، ثم ثقبه واطرد الخلايا في الموقع ذاته تماماً في الجنين المضيف؛ حيث يكشف الانتقال من الإضاءة ذات المجال الساطع إلى الإضاءة الفلورية عن حركة الخلايا المحددة بالديكسترين داخل إبرة الشعيرة أثناء دخولها إلى الجنين المضيف.

أخيراً، وبعد عملية النقل، أخرج أجنة المانح والمستقبل من الآبار. افصلهما وضعهما برفق في طبق بتري مغطى بطبقة A ومملوء بوسط أجنة يحتوي على مضاد حيوي. قم بحضن الأجنة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية وبذلك تكتمل عملية النقل.

لنبدأ الآن في عملية التصوير والتصور. تبدأ العملية بتثبيت الأجنة في المرحلة المناسبة للتصوير باستخدام مادة حافظة مُتحقق منها كيميائيًا مناعيًا. في حالتنا هذه، يكون التثبيت في 4%formaldehyde لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع التدوير.

اتبع ذلك بشطف الأجنة المثبتة مرتين، ثم غسلها لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق في 0.1 molar pb. قم بإجراء عملية الوسم المناعي المناسبة إذا لزم الأمر.

ضع الأجنة في 75% glycerol، واتركها لتنغمر في درجة حرارة الغرفة ثم خزنها عند أربع درجات Celsius. جهز شريحة لتثبيت جنينين عن طريق رسم مخططين مربعين من الهلام البترولي على الشريحة بحيث يتطابقان مع القطر الداخلي للمربع. ضع غطاء الشريحة بجانب الجنين وأجرِ أي عمليات تشريح ضرورية للحصول على منظر أمامي للدماغ الأمامي.

قم بتشريح الدماغ الأمامي عن طريق القطع بشكل عمودي عبر الدماغ المتوسط. ضع هذا النسيج مع كمية قليلة من الجلسرول داخل البتروليوم. وجِّه النسيج بدقة إلى الوضع المناسب وضع غطاء شريحة فوق العينة.

وبدلاً من ذلك، بالنسبة للأجنة الحية، يتم تثبيتها في محلول agro بنسبة 0.75% على أطباق زراعة زجاجية ذات قاع مسطح. وقبل أن يتصلب agro، استخدم إبرة تنجستن لتوجيه الجنين إلى الوضعية المناسبة للتصوير. يتم تصوير كل من المضيفات المثبتة والحية.

باستخدام المجهر البؤري الماسح بـخمسة ليزرات من طراز Leica SP، يتم الحصول على مجموعات ZS وإجراء معالجة للصور ثلاثية أو رباعية الأبعاد باستخدام برنامج velocity لإنشاء أجنة خيمرية يكون فيها جزء من مجموعة الخلايا النجمية الدبقية داخل الجنين مختلفاً من حيث النمط الجيني أو النمط الظاهري. لقد استخدمنا نهجاً متعدد الأوجه يجمع بين استخدام أجنة معدلة وراثياً ببروتين GFP، والتي تعمل على وسم الخلايا النجمية الدبقية، مع استخدام زراعة الخلايا في مراحل التكوين الجنيني (gastro staged) لاستهداف مستعمراتنا تحديداً في الرأس (cephalon). وقد اعتمدنا على خريطة مصير التكوين الجنيني لسمك الزيبرا لاستخراج الخلايا بشكل انتقائي من الخط المتوسط على مسافة متساوية من القطب الحيواني والدرع (shield).

تم بعد ذلك نقل هذه الخلايا المستخلصة إلى الموقع نفسه في مضيف من النوع البري (wild type) من نوع gasa، والذي رُبي لاحقاً حتى 30 HPF وتم وسمه مناعياً لجميع المحاور العصبية كعلامات مرجعية لتشريح الدماغ الأمامي. وفي المثال الموضح هنا، يكشف التصوير البؤري لجنين مضيف واحد عن خلايا منفردة موجبة لبروتين GFP في جميع أنحاء الرأس (cephalon) والرأس. ويمكن ملاحظة المورفولوجيا الكاملة لهذه الخلايا الموجبة لبروتين GFP في هذا المقايسة النسلية، مما يكشف أن معظم هذه الخلايا تتخذ المورفولوجيا المميزة للخلايا الدبقية الشعاعية، حيث يقع جسم الخلية بجوار المنطقة البطينية وتنتهي عملية شعاعية بقدم طرفية كبيرة عند سطح القشرة.

يظهر التصوير ثلاثي الأبعاد للمجموعة من هذه المقاطع الضوئية المجمعة بوضوح موقع هذه الخلايا بالنسبة للمحاور العصبية المصبوغة. وهناك نهج آخر يُستخدم عادةً لتصوير الخلايا المزروعة وهو الحقن المجهري الأولي لصبغة فلورية لتتبع السلالة الخلوية في مح هذه جنين بري في مرحلة الخلية الواحدة أو جنين معدل وراثياً بـ GFP. في هذا المثال، قمنا بحقن Alexa 5 94 dextrin في أجنة برية.

في مرحلة الخلية الواحدة، تركناها تتطور حتى مرحلة الدرع، ثم أجرينا أربع عمليات زرع استهدفت الدماغ كما ذكرنا سابقاً. ولكن بدلاً من ذلك، قمنا بالزرع في مضيف معدل وراثياً، مع تصوير الجزء الظهري من الرأس في مرحلة الجاسترولا باستخدام المسح الليزري. وقد كشف المجهر البؤري عن تجمعات حمراء فلورية من الخلايا المانحة بين النوى الموجبة لـ GFP داخل الدماغ الأمامي.

قمنا بتحليل هذا المضيف بشكل أكبر عن طريق جمع لقطات Z-stacks كل ثلاث دقائق على مدار ساعتين باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر. يُظهر التصوير رباعي الأبعاد لهذا المقطع الزمني باستخدام برنامج velocity المقدم من IMP تحركات خلوية ديناميكية لأغشية خلايا rod domine والنوى الموجبة لـ GFP. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير جميع الأجهزة والكواشف اللازمة لعمليات نقل الخلايا في أجنة zebrafish.

على وجه التحديد، قمنا بتوضيح هذه التقنية في المرحلة الجاسترولية (gaso stage). ومع ذلك، فهي قابلة للتطبيق أيضاً على عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا (blastula stage). عند استخدام هذا الإجراء، من المهم الربط بدقة بين الموقع النهائي المطلوب للخلايا المزروعة وموقع هذه الخلايا السابق في خريطة المصير خلال مرحلة الجاسترول؛ وللحصول على مزيد من الإرشادات، يمكن مراجعة دراسة الدكتور سكوت فريزر المفصلة حول خرائط مصير جنين سمكة الزيبرا الصادرة عام 1995 بعنوان Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.