الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

يبدأ هذا الإجراء بتبطين أجنة أسماك الزرد أحادية الخلية في لوحة الحقن المجهري. حقن دقيق محلول دكسترين الفلورسنت في صفار البيض. يوجد المتبرعون بالزرع.

قم بتغطية الأجنة المانحة والمضيفة وتنمو إلى مرحلة الدرع قم بتحميل اثنين من الأجنة المحقونة من الدكسترين المطلي ب DEC جنبا إلى جنب في بئر واحد من لوحة الزرع. كرر أسفل كل زوج من المتبرعين. أضف جنينا مضيفا واحدا لكل بئر لاستهداف الخلايا المزروعة في المستقبل من خلايا زرع الدماغ الأمامي من وإلى خط الوسط.

في منتصف الطريق بين عمود والدرع. زرع الخلايا من المتبرع gasa إلى المضيف غاسا. تنمو إلى 30 ساعة إصلاح.

قم بإجراء الكيمياء المناعية إذا لزم الأمر ، قم بالتركيب والصورة. بدلا من ذلك ، قم بتركيب المضيف مباشرة وقم بإجراء تصوير الفاصل الزمني. مرحبا ، اسمي إليزابيث دي شين من مختبر الدكتور مايكل ESI في قسم العلوم البيولوجية في كلية سميث في نورثهامبتون ، ماساتشوستس.

وأنا الباحث الرئيسي في المختبر ، الدكتور مايكل بيسي. سنوضح لك اليوم كيفية إنشاء أجنة خيميرية عن طريق إجراء عمليات زرع خلايا في مرحلة المعدة باستخدام نظام نموذج سمك الزرد. نستخدم هذا الإجراء في مختبري لدراسة وظيفة جينات معينة على تطور لجنة الدماغ الأمامي بالإضافة إلى عملية التفاعلات الدبقية العصبية أثناء تكوين المضطرب.

لذلك دعونا نبدأ. للبدء في إعداد قوالب الحوض الصغير لألواح الحقن الدقيق عن طريق كسر ثلاثة بعناية واحدة ملليمتر, أربع بوصات الشعيرات الدموية غير خيوط في النصف. باستخدام الغراء الفائق ، قم بلصق نصفين من الشعيرات الدموية جنبا إلى جنب على غراء سطح مستو.

الشعيرات الدموية الثالثة فوق هذين الاثنين تقع في الأخدود لإنشاء شكل هرمي. مع الشعيرات الدموية الثلاثة ، اترك القالب يجف. يجب أن تصنع حوالي ثلاثة إلى خمسة قوالب لكل لوحة حقن.

بعد ذلك ، قم بإعداد ألواح الحقن عن طريق صب 20 إلى 25 مل من 1.5٪ من المذهورة في وسط الجنين في طبق بتري 100 ملم. ضع على الفور ثلاثة إلى خمسة من قوالب الحوض الصغير المحضرة في قاع اللوحة ، مع التأكد من أن الجانب المسطح من القالب يلامس قاع طبق بتري ومغطى بالكامل بالحمض. عندما تصلب الأروس ، قم بإزالة قوالب الحوض الصغير عن طريق قطع مربع أروس كبير يحتوي عليها.

بإزاحة الأجار برفق على محيط المربع المقطوع وتخلص منه. اقلب قطعة الأجار المربعة وباستخدام ملقط ناعم تماما ، وقم بإزالة قوالب الحوض الصغير. صب الصخور المنصهرة في طبق بتري حول الساحة لتثبيت الآبار المصبوبة حديثا في مكانها.

دعها تضبط. يمكن إغلاق الألواح وتخزينها لأسابيع عند أربع درجات مئوية. يجب التخلص منها إذا كانت هناك أي علامات على النمو في أجار.

أخيرا ، لتحضير إبر الحقن ، استخدم مجتذب شعري ماصة صغيرة لإخراج الإبر من شعيرات دموية زجاجية بحجم أربعة بوصات بحجم ملم واحد مع خيوط داخلية مع لوحة الحقن الدقيقة والإبر المحضرة. دعونا نلقي نظرة على جمع الأجنة وإعداد جهاز الحقن المجهري. يتم جمع البويضات المخصبة فور وضعها وحفظها في طبق بتري مملوء بوسط الجنين.

باستخدام ماصة زجاجية عريضة ، طرد الأجنة في آبار الغرفة. لوحة حقن درجة الحرارة مملوءة بوسط الجنين. استخدم ملقطا حادا مشدودا لتثبيت الأجنة برفق في قاع الأحواض ، ويجب التخلص من الأجنة التي تعرضت كوريان أو صفار البيض للخطر.

بعد ذلك ، قم بتحميل إبرة الحقن بميكرولتر إلى ميكرولتر من محلول الدكسترين الفلوري المخفف Alexa 5 9 4. اسمح للدكسترين بالانتقال إلى طرف إبرة الحقن عن طريق العمل الشعري. قم بتوصيل إبرة الحقن بحامل الشعيرات الدموية للمناور الصغير التجسيمي واضبط الضغط على جهاز الحاقن الصغير لتبدأ.

40 إلى 50 رطل لكل بوصة مربعة ومدة نبضة 500 مللي ثانية. استخدم الملقط لرعي أو قص طرف إبرة الحقن برفق لكسر الختم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون القطر من 0.05 إلى 0.15 ملم.

لمعايرة الإبرة ، استخدم مجهر استريو وطرد الدكسترين على ميكرومتر بالزيت المعدني فوقه. قم بتعديل حجم البلعة عن طريق ضبط ضغط الهواء ومدة النبضة وحجم الإبرة. بقشيش. يجب الحفاظ على حجم بلعة يعادل حجم 0.8 إلى نانولتر واحد طوال فترة الحقن.

يمكننا الآن البدء في الحقن المجهري للدكسترين باستخدام تكبير حوالي 3.2 × على مجهر مجسم. ابدأ حقن الأجنة من أحد طرفي الحوض الصغير عن طريق ثقب سلسة التاج وغشاء الخلية للأجنة للدخول إلى صفار البيض. حقن محلول الدكسترين أسفل الخلية مباشرة.

تأكد من إزالة إبرة الحقن بنفس الحركة السلسة المستخدمة لدخول الجنين. حرك طبق بتري لوضع الجنين التالي في الخط واستمر في الحقن بطول الحوض الصغير. تحقق من الضغط وحجم البلعة بشكل دوري.

استخدم الآن الملقط لدفع الأجنة برفق خارج الأحواض. انقلها إلى طبق بتري مليء بجنين المضادات الحيوية. متوسط. احتضان الأجنة عند 28.5 درجة مئوية وراقبها بحثا عن البويضات غير المخصبة أو الموت.

الأجنة جاهزة الآن لعمليات الزرع المستقبلية. قبل الانتهاء من بولي أثناء حصة الغاز ، تظل أجزاء من صفار البيض مكشوفة. صفار البيض هش للغاية وسوف يلتصق بسهولة ويمزق بسهولة على بلاستيك طبق بتري.

لذلك ، يجب طلاء الأجنة على ألواح مغلفة قبل يوم واحد من إجراء عمليات الزرع. اصنع لوحات الديكور هذه عن طريق صب خمسة إلى 10 ملليلتر من الصخور المنصهرة في طبق بتري 100 ملم. هناك حاجة فقط إلى طبقة رقيقة من aros حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات لتوسيد الأجنة أثناء الزخرفة.

دع الأطباق تبرد. بعد ذلك ، قم بعمل ألواح زرع منفصلة عن طريق صب 30 مل من محلول 1.5٪ aros في طبق بتري 100 ملم وإدخال قالب بئر الزرع. يجب أن يحتوي القالب على 104 فتحات مثلثة ، يتكون كل منها من ثلاثة جوانب بزاوية 90 درجة و 1 جانب بزاوية 45 درجة.

تم تصميم الآبار لحمل جنينين جنبا إلى جنب. احرص على عدم حبس فقاعات الهواء تحت القالب واترك الأغروس تصلب. تكشف إزالة القالب عن منطقة غارقة تحتوي على الآبار المربعة ذات الحافة المائلة.

لإعداد الأجنة المضيفة والمتبرعة للزرع ، يجب مراقبة نموها للحفاظ على أزواج قريبة من العمر. للقيام بذلك ، يمكن رفع الأجنة في درجات حرارة متفاوتة من 23 إلى 31 درجة مئوية لإبطاء أو تسريع النمو. يجب طلاء كل من الأجنة المضيفة والمتبرعة يدويا على صفيحة طلاء مطلية قبل ساعة واحدة من العمر المطلوب.

في حالة عمليات زرع مرحلة الجهاز الهضمي ، يجب إكمال ذلك بخمس ساعات بعد الإخصاب أو HPF قبل مرحلة الدرع عند 5.5 HPF. استخدم ماصة زجاجية لتحميل المضيف وأجنة المتبرع في صفيحة زرع مملوءة بوسط جنين مضاد حيوي. هنا يمتلئ الصف الأول بأجنة متبرعة بها جنينان لكل بئر ، ويتم ملء الصفين التاليين بجنين مضيف واحد لكل بئر.

بالنسبة لعمليات الزرع ، نستخدم مجهر ستيريو فلورسنت Zeiss luer الذي يحتوي على عصا التحكم الآلية بالكامل من خلال التكبير / التصغير والتركيز الكهربائي. في حين أن هذا المجهر الآلي ليس ضروريا ، إلا أنه يزيد بشكل كبير من سهولة وكفاءة عمليات الزرع الجراحية الدقيقة هذه ، خاصة عندما يكون هناك عدد كبير من عمليات الزرع مطلوبا. لإعداد جهاز الزرع ، اضبط الترام الجوي einor على الموقع الأوسط لمقياسه ، وقم بتوصيل أنبوب الترام الهوائي بحامل الشعيرات الدموية وقم بتأمين الحامل بمعالج einor الآلي الصغير مع إعداد الأجنة وجهاز الزرع ، يمكننا الآن الانتقال إلى عمليات زرع الخلايا في مرحلة الجهاز الهضمي.

المهارة الأكثر أهمية في إكمال عمليات زرع الخلايا في مرحلة الجهاز الهضمي هي القدرة على التعرف على التشريح الخلوي للشفة APO للانفجارات الظهرية ، والمعروفة أيضا باسم الدرع في أسماك الزرد. نقدم هنا فيلما تسلسليا للمعدة من وجهات نظر مختلفة ونسلط الضوء على مكان وجود الدرع في هذا المنظر الجانبي. يقع الدرع أو الجانب الظهري على اليمين في المخطط الأحمر لاستهداف الخلايا إلى خلايا زرع الدماغ الأمامي من وإلى خط الوسط.

في منتصف الطريق بالضبط بين عمود والدرع ، سنبدأ في تدوير الجنين أولا نحوك لعرض عمود ، مع تسليط الضوء على الدرع وموقع الزرع على طول الطريق. بعد ذلك ، يدور الجنين على محوره لوضع الدرع في الأسفل. يدور الجهاز المعدي الآن مرة أخرى ، مما يوفر لك رؤية ظهرية مباشرة.

يتم الآن تدوير الجنين مرة أخرى بالتسلسل إلى عرض جانبي عند ستة HPF. باستخدام المناور الصغير ، قم برعي الجنين برفق بطرف الشعيرات الدموية لتدويره في وضع لاستخراج الخلايا بحيث يكون خط الوسط والدرع مرئيين ويعارضان طرف الأجنة المانحة الشعرية ، يمكن التحقق بسهولة من خلال التبديل من إضاءة الحقل الساطع إلى الإضاءة الفلورية. هنا تستنشق خلايا اللون الأحمر المعدة الفلوري كمية صغيرة من وسط الجنين في الشعيرات الدموية للقضاء على أي فرصة لتلامس الخلايا لواجهة الهواء والماء التي من شأنها إتلافها.

اخترق الأديم الظاهر للجنين المتبرع برفق عند خط الوسط بالضبط بين عمود والدرع. لم يكن هناك سوى ما يقرب من 20 ميكرومترا من الخلايا بين الأديم الظاهر السطحي وصفار البيض الأساسي في الغاز. لذا احرص على عدم خدق صفار البيض لأن هذا غالبا ما يؤدي إلى الموت في غضون ساعات.

باستخدام الترام الهوائي ، استنشق الخلايا ببطء في الشعيرات الدموية. حافظ دائما على رؤية خط الماء الذي يحرك الطرف قليلا. أثناء وجوده داخل المتبرع سيساعد على تخفيف ملامسات الخلية إلى الخلية.

يجب استخراج ما يقرب من 10 إلى 50 خلية من الجنين المتبرع. بعد ذلك ، قم بإزالة الشعيرات الدموية من المتبرع. وبالمثل ، قم بتوجيه المضيف وثقب الخلايا وطردها إلى نفس الموقع بالضبط في الجنين المضيف ، يكشف التحول من الإضاءة الساطعة إلى الإضاءة الفلورية عن حركة الخلايا المسماة ب dextrin في الإبرة الشعرية إلى الجنين المضيف.

أخيرا ، بعد الزرع ، قم بإزالة الأجنة المانحة والمضيفة من الآبار. افصلهما وضعهما برفق على طبق بتري مغطى بجنين المضادات الحيوية. يحتضن المتوسط الأجنة عند 28.5 درجة مئوية مع اكتمال عمليات الزرع.

لنبدأ في التصور والتصوير. تبدأ الأجنة بتثبيت الأجنة في المرحلة المناسبة للتصوير في مادة حافظة تم التحقق منها من قبل الكيمياء المناعية. في حالتنا ، سيكون هذا في 4٪ فورمالديهايد لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية تدور.

اتبع ذلك عن طريق شطف الأجنة الثابتة مرتين ثم غسلها لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. في 0.1 مولي pb. قم بإجراء وضع العلامات المناعية المناسبة إذا لزم الأمر.

ضع الأجنة في 75٪ من الجلسرين ، واغرقها في درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد شريحة لتركيب جنينين عن طريق إنشاء مخططين مربعين من الفازلين على شريحة تتطابقان مع القطر الداخلي للمربع. قم بتغطية زلة التالي de yoan الجنين وقم بإجراء أي تشريح ضروري لتحقيق رؤية أمامية للدماغ الأمامي.

تشريح الدماغ الأمامي عن طريق القطع بشكل عمودي عبر الدماغ المتوسط. ضع هذا النسيج مع الحد الأدنى من الجلسرين داخل البترول. قم بتوجيه الأنسجة جيدا إلى الموضع المناسب وضع غطاء على العينة.

بدلا من ذلك ، بالنسبة للأجنة الحية ، قم بتركيبها في محلول زراعي بنسبة 0.75٪ على الزجاج. أطباق الثقافة السفلية قبل أن تصلب الزراعة ، استخدم إبرة التنغستن لمعالجة الجنين في الاتجاه المناسب للتصوير. يتم تصوير كل من المضيفين الثابتين والمباشرين.

باستخدام المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر الخمسة Leica SP ، يتم الحصول على مداخن ZS ويتم إجراء معالجة الصور ثلاثية أو رباعية الأبعاد باستخدام برنامج السرعة لتوليد أجنة خيمرية يختلف فيها جزء من مجموعة الخلايا الدبقية الفلكية داخل الجنين حسب النمط الجيني أو النمط الظاهري. استخدمنا نهجا متعدد الأوجه يجمع بين استخدام الأجنة المعدلة وراثيا GFP ، والتي تصنف الخلايا النضمية باستخدام زرع الخلايا المعدة لاستهداف المستنسخة على وجه التحديد إلى الرأس. استخدمنا خريطة مصير معدي الزرد لاستخراج الخلايا بشكل انتقائي عند خط الوسط على مسافة متساوية من قطب والدرع.

ثم تم زرع هذه الخلايا المستخرجة في نفس الموقع في غاسا مضيف من النوع البري ، والذي تم رفعه بعد ذلك إلى 30 HPF وتم تصنيفه مناعيا لجميع المحاور كمعالم مرجعية في تشريح الدماغ. في المثال الموضح هنا ، يكشف التصوير متحد البؤر لجنين مضيف واحد عن خلايا إيجابية GFP معزولة في جميع أنحاء الرأس والسيفالون. يمكن ملاحظة التشكل الكامل لهذه الخلايا الإيجابية GFP في هذا الفحص النسيلي الذي يكشف أن معظم هذه الخلايا تأخذ التشكل الدبقي الشعاعي المميز حيث يقع سوما بجوار المنطقة البطينية وتنهي القدم الطرفية الكبيرة عملية شعاعية على سطح التقشير.

العرض ثلاثي الأبعاد ل Zack لهذه الشرائح البصرية المجمعة بوضوح موضع هذه الخلايا فيما يتعلق بالمحاور المصنفة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام لتصور الخلايا المزروعة وهي الحقن الدقيق في البداية صبغة سلالة خلية فلورية في صفار نوع بري من خلية واحدة أو جنين معدل وراثيا GFP. في هذا المثال ، قمنا بحقن Alexa 5 94 dextrin في أجنة النوع البري.

في مرحلة الخلية الواحدة ، سمحنا لهم بالتطور لحماية المرحلة غاسا ثم أجرينا أربع عمليات زرع مستهدفة للدماغ كما هو مذكور أعلاه. ولكن بدلا من ذلك ، قمنا بزرع تصوير المعدة المضيف المعدل وراثيا للرأس الظهري عن طريق المسح بالليزر. كشف الفحص المجهري متحد البؤر عن مجموعات حمراء فلورية من الخلايا المانحة بين نوى GFP الإيجابية داخل الدماغ الأمامي.

قمنا بتحليل هذا المضيف بشكل أكبر عن طريق جمع Zacks كل ثلاث دقائق على مدار ساعتين باستخدام كونفوكال المسح بالليزر. يظهر العرض رباعي الأبعاد لهذا الفاصل الزمني باستخدام برنامج السرعة بواسطة توفير IMP حركات خلوية ديناميكية لأغشية خلايا قضيب الدومين والنوى الموجبة ل GFP. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير جميع الأجهزة والكواشف اللازمة لزرع الخلايا في أجنة الزرد.

على وجه التحديد ، أظهرنا هذه التقنية في مرحلة جاسو. ومع ذلك ، فإنه ينطبق أيضا على عمليات زرع مرحلة الأريمة. عند استخدام هذا الإجراء ، من المهم ربط الموقع النهائي المطلوب للخلايا المزروعة بدقة بموقع خريطة المصير السابق لهذه الخلايا في استشارة الغاز ، دراسة الدكتور سكوت فرايزر التفصيلية لخرائط مصير أسماك الزرد من عام 1995 بعنوان خرائط مصير جنين الزرد لمزيد من الإرشادات.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.