سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد

سنقوم في هذا الفيديو بتوضيح فعالية بروتوكول صبغ كوماسي مُعدّل للكشف عن عدة نانوغرامات من البروتين في هلامات بولي أكريلاميد. وباستخدام مثال على الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد قبل عملية الفصل في البعد الأول، يتم إعادة ترطيب شرائح تدرج الـ pH المثبتة في ظروف من محلول منظم يعمل على تغيير الطبيعة.

بعد إعادة ترطيب الشرائط طوال الليل، يتم تحميل عينات البروتين عبر التحميل في الكوب الأنودي. وخلال عملية التركيز، تُفصل البروتينات وفقاً لنقاط التعادل الكهربائي الخاصة بها. ثم يتم إجراء الفصل في البعد الثاني بواسطة SDS page.

يُنقل الجل بعد ذلك إلى وعاء تلوين ويتم الكشف عن البروتينات عن طريق التلوين بصبغة الكوماسي الغروية. مرحباً، أنا نادين دي بالا من مختبر سابينا ميكا في مركز الأبحاث الطبية البيولوجية بجامعة أولور. سأوجه انتباهكم اليوم إلى إجراء غير شائع على نطاق واسع وفقاً للزملاء كانجان، حيث تعد صبغة Cy Brilliant Blue صبغة مستخدمة بشكل شائع لتصوير البروتينات بعد الفصل الكهربائي، ولكن غالباً ما يُفترض أنها أقل قابلية للتطبيق في دراسات البروتوميات المقارنة.

ومع ذلك، يوفر صبغ كولوديون (colloidal) ميزات فائقة فيما يتعلق بالحساسية والتكلفة والعملية. نحن نستخدم بروتوكول صبغ كولوديون في مختبرنا لمعظم تطبيقات الفصل الكهربائي للهلام (gel)، وبشكل خاص في التحليل البروتيني لتحديد التغيرات في تعبير بروتينات عضلة القلب. سأقوم بتوضيح استخدام هذه الطريقة للكشف عن بروتينات عضلة القلب في نطاق الأس الهيدروجيني (pH) القلوي لهلام الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد.

لنبدأ الآن. حسناً، البُعد الأول في الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد هو التركيز المتساوي الكهربائية أو IEF، وتُستخدم شرائح تدرج الأس الهيدروجيني المثبتة أو شرائح IPG لهذا التحليل.

قبل إجراء التركيز الكهربائي المتساوي (IEF)، يتم إعادة ترطيب أربعة من شرائط IPG بشكل فردي في 125 microliters من محلول إعادة الترطيب باستخدام صينية IM Mobilly لتورم الشرائط الجافة لمدة 10 ساعات على الأقل، حتى تصبح شرائط IPG مرطبة وجاهزة لتحميل عينات البروتين. يتم إذابة عينات البروتين المرسبة بـ TCA من أربعة تحضيرات قلب مختلفة في محلول منظم لعينات IEF ليصل التركيز إلى 100 micrograms من البروتين لكل 100 microliters. وتستغرق عملية إذابة عينات البروتين 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز الـ vortex.

في هذه الأثناء، قم بتحضير المكونات الإضافية من طقم شرائط IM Molene الجافة لإجراء الفصل الكهربائي متساوي التكهرب (IEF) في وحدة الفصل الكهربائي multi four. أولاً، اضبط درجة حرارة وحدة التبريد على 20 °C، ثم اسحب ثلاث إلى أربع milliliters من سائل التغطية وضعها على لوحة التبريد، وضع صينية شرائط Immobilien الجافة فوقها بحيث تكون وصلة القطب الحمراء متجهة نحو المصعد (anode). صب حوالي 10 milliliters من زيت التغطية في صينية شرائط Immobilien الجافة، ثم ضع محاذي شرائط Immobilien الجافة بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على الأخدود للأعلى فوق الصينية المغطاة بالزيت.

بعد ذلك، قم بإزالة الشريط الذي تمت إعادة ترطيبه من صينية إعادة الانتفاخ وانقله بحيث يكون جانب الهلام للأعلى إلى أخاديد أداة المحاذاة. يجب أن يكون الطرف الحمضي للشريط مواجهاً للمصعد. في النهاية، يجب أن تكون جميع الشرائط محاذية من جهة حوافها المصعدية.

ضع شرائط الأقطاب الكهربائية المشبعة بالماء المقطر بشكل عرضي عبر نهايات شرائط الهلام، مع التأكد من تلامس شرائط الأقطاب الكهربائية جزئياً على الأقل مع سطح الهلام. أخيراً، ضع الأقطاب الكهربائية على شرائط الأقطاب بحيث تكون العلامة الملونة موجهة نحو التلامس الإلكتروني المقابل. ضع قضيب أكواب العينات بالقرب من المصعد (anode) في صينية الشرائط الجافة (immobilien dry strip tray)، ثم ضع كوب عينة فوق كل شريط IPG.

اضغط برفق على أكواب العينات لضمان التلامس الجيد مع شريط IPG. صب من 70 إلى 80 milliliters من زيت التغطية في الحوض لتغطية شرائط IPG. يجب ألا يتسرب أي زيت إلى أكواب العينات.

إذا تسرب الزيت إلى الكوب، قم بإزالته باستخدام ماصة وأعد ضبط الأكواب مرة أخرى. أخيرًا، أضف حوالي 150 milliliters من زيت التغطية لتغطية أكواب العينات بالكامل. الآن، قم بوضع عينات البروتين في أكواب العينات عن طريق الماصة أسفل سطح سائل التغطية.

تبلغ سعة الكأس 100 µL. بمجرد وضع جميع عينات البروتين، قم بتوصيل جميع الأسلاك. صِل وحدة multi four بمصدر الطاقة وأجرِ عملية التركيز متساوي التكهرب لمدة 11.1 kVh في وضع التدرج؛ وبعد عملية IEF، تُوضع شرائط IPG في صينية بحيث يكون جانب الهلام للأعلى، ثم تخضع لعمليتي الاختزال والألكلة أثناء مرحلة التوازن.

لعملية الاختزال، استخدم 2.5 milliliters من محلول موازنة 1%DTT لكل شريط. بعد ذلك، قم بالرج لمدة 15 minutes، ثم استبدل محلول DTT بالكامل وقم بعملية الألكلة للشرائط في محلول موازنة 2.5%iodoacetamide مع الرج لمدة 15 minutes أخرى. اشطف الشرائط الموازنة مرة واحدة في بيكر مملوء بالماء وجففها باستخدام ورق ترشيح لإزالة فائض محلول الموازنة.

بعد ذلك، انقل الشرائط إلى محلول XSDS running buffer واحد. أصبحت البروتينات الموجودة في الشرائط الآن جاهزة للبعد الثاني من الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2D gel electrophoresis). يتم تنفيذ البعد الثاني عن طريق SDS page باستخدام نظام فصل كهربائي رأسي.

يتم صب عدد مناسب من هلامات الأكريلاميد بتركيز 12% وبسُمك 1 ملم قبل يوم واحد من الاستخدام، وتُحفظ مغطاة بورق مبلل. وفي درجة حرارة الغرفة، توضع شرائح IPG التي تم موازنتها فوق هلامات الفصل وتُثبت بمحلول agar ساخن، ثم تُفصل البروتينات لمدة 2.5 ساعة، بدءاً بجهد 80 فولت لمدة 15 دقيقة، يليه 120 فولت حتى تصل جبهة الصبغة إلى أسفل كاسيت الهلام.

بينما يتم فصل البروتينات بواسطة تقنية SDS page، قم بتحضير المحاليل الخاصة بصبغة colloidal kumasi للجل. عند تحضير محلول الصبغ، من المهم جداً الالتزام بالترتيب التسلسلي لإضافة المكونات وفقاً للتسلسل التالي. أولاً، أذب 100 grams من كبريتات الألومنيوم وحوالي 1.5 liters من milli cube water في دورق مخبري مع التحريك. بعد ذوبان كبريتات الألومنيوم، اخلط 200 milliliters من الإيثانول وأضف 0.4 grams من CBG two 50 إلى المحلول.

بمجرد ذوبان CBB G two 50 تماماً، أضف 47 milliliters من حمض ortho phosphoric. تسمح هذه الخطوة لجزيئات kamasi بالتجمع في حالتها الغروية. وأخيراً، أضف milli Q water حتى يصل الحجم النهائي إلى two liters.

سيحتوي المحلول النهائي الراكد على جسيمات تسبح بداخله. لا تقم بترشيح هذا المحلول. يمكن أيضاً تحضير محلول الصبغ مسبقاً وتخزينه في الظلام حتى وقت الاستخدام.

عند اكتمال هلام SDS، قم بإزالة الهلام بعناية من الصفائح الزجاجية وانقله إلى وعاء صبغ مملوء بماء Milli Q. ضع الوعاء الذي يحتوي على الهلام على هزاز أفقي وقم بهزه لمدة 10 دقائق.

كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق تقريباً باستخدام مياه milli cube نقية؛ ومن المهم غسل الهلام جيداً لأن بقايا SDS على الهلام يمكن أن تعيق ارتباط الصبغة بالبروتين وتؤدي إلى ضعف الحساسية. وفي نهاية الغسلة الثالثة، قم بتفريغ المياه من الطبق.

أصبح الهلام الآن جاهزاً للتصبيغ. أولاً، قم برج محلول Kumasi لتوزيع الجسيمات الغروية بشكل متساوٍ. ثم أضف كمية كافية من المحلول لتغطية الهلام.

ضع الطبق الذي يحتوي على محلول Kumasi مغطى. ضع الهلام على جهاز هزاز وقم برجّه لمدة تتراوح من ساعتين إلى 12 ساعة. بعد 10 دقائق، ستلاحظ ظهور أولى بقع البروتين.

يمكن إتمام ما يتراوح بين 80 إلى مائة بالمائة من عملية التصبيغ خلال ساعتين من الحضن. ولكننا نوصي بالحضن طوال الليل لتحقيق نسبة تصبيغ تقترب من 100%. عند اكتمال التصبيغ، قم بإزالة محلول Kamasi واغسل الهلام مرتين بماء Milli Q.

بعد شطف الهلام، قم بإزالة جزيئات الصبغة العالقة من وعاء التلوين باستخدام منشفة ورقية خالية من الوبر. أضف محلول إزالة التلوين إلى الهلام واتركه لإزالة اللون لمدة تتراوح من 10 إلى 60 دقيقة على جهاز الهزاز. وفي النهاية، اشطف الهلام مرتين باستخدام Milli Q water.

سيعود الهلام إلى سمكه الأصلي، كما ستزداد كثافة لون صبغة الكوماسي. إذا اتبعت هذا البروتوكول، يجب أن يكون الهلام ثنائي الأبعاد (2D gel) مفصولاً بوضوح ومصبوغاً جيداً ببقع بروتينية زرقاء داكنة. وتعتبر نتيجة صبغ الهلام ثنائي الأبعاد بصبغة الكوماسي مماثلة لنتائج الصبغ بالفضة.

وفقاً لبروتوكول Chenko et al، والذي أفيد بأنه يتميز بحساسية عالية وتوافق مع مطيافية الكتلة. وباستخدام مثال الفصل الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد، قد أوضحنا لكم للتو مدى سرعة وبساطة وحساسية صبغ kangs cooma. وللكشف عن البروتينات في هلام po acrylamide، يمكن إتمام عملية الصبغ في غضون ساعتين.

لا يتطلب الإجراء نفسه جهداً كبيراً. وأخيراً وليس آخراً، قد تتمكن من الكشف عن كمية ضئيلة من البروتين تصل إلى 1 ng. لذا، فإن هذا البروتوكول يمثل بالتأكيد بديلاً جيداً لطرق البروتوميات غير الموصومة القائمة على الجل.

عند استخدام إجراء التلوين، من المهم تذكر استخدام مواد كيميائية بدرجة تحليلية ومياه بأعلى درجات النقاء. علاوة على ذلك، تعد الإضافة المتسلسلة للمكونات إلى محلول التلوين خطوة حاسمة في عملية التحضير. وأخيراً، لا تنسَ غسل بقايا SDES بكفاءة من الهلامات بعد الفصل الكهربائي.

وإلا، فلن تظهر أي نتائج على الهلام (gels). هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.