سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد

في هذا الفيديو ، سنوضح قوة بروتوكول تلطيخ كوماسي المعدل للكشف عن عدة نانوجرامات من البروتين في المواد الهلامية بولي أكريلاميد. باستخدام مثال الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد قبل فصل البعد الأول. يتم إعادة ترطيب شرائط تدرج الأس الهيدروجيني غير الجمودة في ظروف المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة.

بعد إعادة تورم الشرائط بين عشية وضحاها ، يتم تطبيق عينات البروتين عن طريق تحميل الكوب الأنوديك. أثناء عملية التركيز ، يتم فصل البروتينات وفقا لنقاطها متساوية الكهرب. يتم تنفيذ فصل البعد الثاني بواسطة صفحة SDS.

ثم يتم نقل الجل إلى طبق تلطيخ ويتم الكشف عن البروتينات عن طريق تلطيخ الكوماسي الغروي. مرحبا ، أنا نادين دي بالا من مختبر سابينا ميكا في مركز البحوث الطبية البيولوجية بجامعة أولور. اليوم سألفت انتباهكم إلى إجراء غير مشهور على نطاق واسع وفقا لزملاء Kangan ، Cy Brilliant Blue هو سد شائع الاستخدام لتصور البروتينات بعد الفصل الكهربائي ، ولكن غالبا ما يفترض أنه أقل قابلية للتطبيق على البروتينات المقارنة.

ومع ذلك ، فإن التلوين الغروي يوفر ميزات فائقة فيما يتعلق بتكاليف الحساسية والتطبيق العملي. نستخدم بروتوكول تلطيخ K في مختبرنا للتطبيق القائم على الهلام تقريبا ، ولكن بشكل خاص في البروتينات التحليلية لتحديد تغيرات تعبير بروتين عضلة القلب. سأوضح استخدام هذه الطريقة للكشف عن بروتينات عضلة القلب في نطاق الأس الهيدروجيني القلوي للهلام ثنائية الأبعاد للرحلان الكهربائي.

لذلك دعونا نبدأ. فهمت ذلك. البعد الأول للرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد هو التركيز المتساوي الكهربي أو IEF ويتم استخدام شرائط تدرج الأس الهيدروجيني الثابتة أو شرائط IPG لهذا التحليل.

قبل IEF ، يتم إعادة ترطيب أربعة شرائط IPG بشكل فردي في 125 ميكرولتر من محلول الجفاف باستخدام صينية تورم الشريط الجاف IM Mobilly لمدة 10 ساعات على الأقل عندما يتم إعادة ترطيب شرائط IPG وتكون جاهزة لتطبيق عينة البروتين. يتم إذابة عينات البروتين المترسبة TCA من أربعة مستحضرات مختلفة للقلب في المخزن المؤقت لعينة IEF بتركيز 100 ميكروغرام من البروتين لكل 100 ميكرولتر. سيستغرق إذابة عينات البروتين 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة على دوامة.

في غضون ذلك ، قم بإعداد المكونات الإضافية لمجموعة الشريط الجاف IM Molene لإجراء IEF في وحدة الرحلان الكهربائي المتعددة الأربعة. اضبط درجة حرارة وحدة التبريد أولا على 20 درجة مئوية، ثم ضع الماصة من ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من سائل الغطاء على لوحة التبريد ووضع صينية الشريط الجاف Immobilien عليها مع وصلة القطب الأحمر باتجاه الأنود. صب حوالي 10 مل من زيت الغطاء في صينية الشريط الجاف Immobilien وضع محاذاة الشريط الجاف Immobilien مع جانب الأخدود لأعلى على الدرج المغطى بالزيت.

بعد ذلك ، قم بإزالة الشريط المعاد ترطيبه من صينية إعادة التورم وانقله مع وجود جانب جل لأعلى إلى أخاديد التقويم. يجب أن يكون الطرف الحمضي للشريط متجها نحو الأنود. في النهاية ، يجب محاذاة جميع الشرائط مع حوافها الأنوديكية.

ضع شرائط القطب المشبعة بالماء المقطر بشكل جانبي عبر نهايات شرائح الهلام ، مع التأكد من أن شرائط القطب الكهربائي تلامس سطح الهلام جزئيا على الأقل. أخيرا ، ضع الأقطاب الكهربائية على شرائط القطب بحيث يتم توجيه العلامة الملونة نحو جهة الاتصال الإلكترونية المقابلة. ضع قضيب كوب العينة بالقرب من الأنود في صينية الشريط الجاف immobilien وضع كوب عينة فوق كل شريط IPG.

اضغط برفق على أكواب العينة لأسفل لضمان ملامسة جيدة لشريط IPG. صب 70 إلى 80 مل من زيت الغطاء في الصينية لتغطية شرائح IPG. يجب ألا يتسرب الزيت إلى أكواب العينة.

إذا تسرب الزيت إلى الكوب ، أخرجه بماصة واضبط الأكواب مرة أخرى. أخيرا ، أضف حوالي 150 مل من زيت الغطاء لتغطية أكواب العينة بالكامل. الآن ضع عينات البروتين في أكواب العينة عن طريق سحب العينة تحت سطح سائل الغطاء.

حجم الكوب 100 ميكرولتر. بمجرد تطبيق جميع عينات البروتين ، قم بتوصيل جميع العملاء المحتملين. قم بتوصيل الوحدات الأربعة المتعددة بمصدر الطاقة وقم بإجراء تركيز متساوي الكهرباء لمدة 11.1 كيلو فولت ساعة في وضع التدرج بعد IEF ، يتم وضع شرائط IPG في صينية مع جانب الجل لأعلى وتخضع للاختزال والألكلة أثناء التوازن.

للتخفيض ، استخدم 2.5 مل من 1٪ DI ثلاثة وجميع محلول التوازن لكل شريط. بعد ذلك رج لمدة 15 دقيقة ثم استبدل محلول DTT تماما وألكل الشرائط في 2.5٪ I محلول توازن أسيتاميد oto مع الرج لمدة 15 دقيقة أخرى. اشطف شرائط التوازن مرة واحدة في دورق مملوء بالماء وامسحها على ورق الترشيح لإزالة المخزن المؤقت الزائد للتوازن.

بعد ذلك ، انقل الشرائط في مخزن مؤقت واحد يعمل على XSDS. البروتينات الموجودة في الشرائط جاهزة الآن للبعد الثاني من الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. يتم تنفيذ البعد الثاني بواسطة صفحة SDS على نظام الرحلان الكهربائي العمودي.

عدد مناسب من سمك ملليمتر واحد. يتم صب 12٪ من المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد قبل يوم واحد من الاستخدام وتبقى مغطاة بورق مبلل. في درجة حرارة الغرفة ، يتم وضع شرائط IPG المتوازنة في الجزء العلوي من المواد الهلامية المنفصلة وتثبيتها بمحلول زراعي ساخن لكل بروتينات يتم فصلها لمدة 2.5 ساعة ، بدءا من 80 فولت لمدة 15 دقيقة ، متبوعة ب 120 فولت حتى تصل مقدمة الصبغة إلى قاع كاسيت الجل.

أثناء فصل البروتينات بواسطة صفحة SDS ، قم بإعداد المحاليل لتلوين الكوماسي الغروي في الجل. عند صنع محلول التلوين ، من المهم جدا الحفاظ على الإضافة المتسلسلة للمكونات بالترتيب التالي. أولا ، قم بإذابة 100 جرام من كبريتات الألومنيوم وحوالي 1.5 لتر من الماء المكعب في دورق وحرك بعد إذابة كبريتات الألومنيوم ، قم بخلط 200 مل من الإيثانول وأضف 0.4 جرام CBG اثنين 50 إلى المحلول.

بمجرد إذابة CBB G two 50 تماما ، أضف 47 مل من حمض الفوسفوريك الأورثو. تسمح هذه الخطوة لجزيئات الكاماسي بالتجمع في حالتها الغروية. أخيرا ، أضف ملي Q الماء إلى الحجم النهائي البالغ لترين.

للحل الدائم النهائي جزيئات تسبح حولها. لا تقم بتصفية هذا المحلول. يمكن أيضا تحضير محلول التلوين مسبقا وتخزينه في الظلام حتى الاستخدام.

عند اكتمال جل SDS. قم بإزالة الجل بعناية من الألواح الزجاجية وانقله إلى طبق تلطيخ مملوء بماء Milli Q. ضع الطبق مع الجل على شاكر أفقي ورجه لمدة 10 دقائق.

كرر الغسيل مرتين أخريين لمدة خمس إلى 10 دقائق. باستخدام ماء مكعب ملي طازج ، من المهم غسل الجل جيدا لأن بقاء SDS على الجل يمكن أن يعطل ارتباط الصبغة بالبروتين ويسبب ضعف الحساسية. في نهاية الغسيل الثالث ، اسكب الماء من الطبق.

الجل جاهز الآن للتلطيخ. أولا ، رج محلول Kumasi لتفريق الجسيمات الغروية بالتساوي. ثم أضف محلول كاف لتغطية الجل.

ضع الطبق مع تغطية محلول كوماسي. جل على شاكر وحرك لمدة ساعتين إلى 12 ساعة. بعد 10 دقائق ، سترى ظهور بقع البروتين الأولى.

يمكن تحقيق 80 إلى مائة بالمائة من التلوين في غضون ساعتين من الحضانة. لكننا نوصي بحضانة ليلية لتحقيق ما يقرب من 100٪ تلطيخ. عند اكتمال التلوين ، قم بإزالة محلول Kamasi واشطف الجل مرتين بماء Milli Q.

بعد شطف الجل ، قم بإزالة جزيئات الصبغة الشائكة من طبق التلوين بمنشفة ورقية خالية من النسالة. أضف محلول تلطيخ إلى الجل واحتفظ به لمدة 10 إلى 60 دقيقة على شاكر. أخيرا ، اشطف الجل مرتين بماء Milli Q.

سيستأنف الجل سمكه الأصلي وسيتم أيضا تحسين كثافة لون صبغة كوماسي. إذا اتبعت هذا البروتوكول ، فيجب حل الجل ثنائي الأبعاد بشكل واضح وتلطيخه جيدا ببقع البروتين الزرقاء الداكنة. نتيجة تلطيخ كوماسي للمواد الهلامية ثنائية الأبعاد قابلة للمقارنة مع تلطيخ الفضة.

وفقا لبروتوكول الشيف تشينكو وآخرون ، والذي يقال إنه ذو حساسية عالية وتوافق مع قياس الطيف الكتلي. باستخدام مثال الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، أوضحنا لك للتو مدى سرعة وبساطة وحساسية رما كانغ. للكشف عن البروتينات في المواد الهلامية po acrylamide يمكن الانتهاء من الحفاظ عليها في غضون ساعتين.

الإجراء نفسه يتطلب القليل من العمالة. وأخيرا وليس آخرا ، قد تتمكن من اكتشاف أقل من نانوجرام واحد من البروتين. لذا فإن هذا البروتوكول هو بالتأكيد بديل جيد لطرق إلغاء التسمية للبروتينات القائمة على السجن.

عند استخدام إجراء الاستدامة ، من المهم أن تتذكر استخدام المواد الكيميائية التحليلية والمياه ذات النقاء الأعلى. علاوة على ذلك ، فإن الإضافة المتسلسلة للمكونات إلى محلول التلوين هي خطوة حاسمة في التحضير. أخيرا ، لا تنس غسل SDES المتبقية بكفاءة من المواد الهلامية بعد الفصل الكهربائي.

خلاف ذلك ، لن ترى أي شيء على المواد الهلامية الخاصة بك. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.