الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

تبدأ هذه الإجراءات بتقطيع كتل نسيجية مجمدة ببخار النيتروجين السائل بسمك 8 ميكرومتر باستخدام جهاز المجهر البريدي (cryostat) مضبوط على درجة حرارة -17 درجة مئوية على شرائح زجاجية عادية غير مشحونة. بعد ذلك، يتم صبغ المقاطع باستخدام طقم صبغ histo gene. وبعد تحديد العصبونات الهرمية، يتم التقاط حوالي 500 خلية بواسطة الليزر على غطاء التقاط HS.

يوضع الغطاء الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 50 µL من محلول استخلاص منظم، ثم يُقلب ويُوضع في أنبوب Falcon كان قد وُضع مسبقاً في حامل، ثم يُوضع في حمام مائي مضبوط على درجة حرارة 42 °C. بعد خطوة طرد مركزي قصيرة، يُزال الغطاء. ويكون المحلول المتبقي حينها جاهزاً لعزل RNA.

أهلاً بكم، أنا شارمين بيترسون من مختبر ويلسون وو في قسم العلوم العصبية البنيوية والجزيئية في مستشفى مكلين. سنعرض لكم اليوم إجراءً للاقتناص الليزري للخلايا العصبية في القشرة من أنسجة دماغ بشرية بعد الوفاة. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التعبير الجيني التفاضلي في التلافيف العلوية والسفلية لدى المصابين بالفصام باستخدام تقنية المصفوفات الدقيقة.

لنبدأ الآن. تم الحصول على أنسجة الدماغ من مركز موارد أنسجة الدماغ في جامعة هارفارد على شكل كتل مجمدة ببخار النيتروجين السائل قبل إجراء تقطيع الأنسجة. ومن المهم الحد من تلوث الحمض النووي الريبوزي (RNA)، لذا يتم معالجة جميع الأسطح، بما في ذلك منطقة العمل وشفرة التقطيع والشرائح، بمحلول لإزالة تلوث RNA، مثل RNA SAP، ثم تُمسح بـ 100% ethanol.

تبدأ هذه العملية بتقطيع كتل الأنسجة المجمدة ببخار النيتروجين السائل باستخدام جهاز الميكروتوم التجميدي (cryostat) المضبوط على درجة حرارة 17- درجة مئوية، ووضعها على شرائح زجاجية عادية غير مشحونة. وتصبح قطاعات الأنسجة الآن جاهزة لتحديد العصبونات الهرمية باستخدام طقم صبغ histo gene السريع. قم بتحضير سلسلة تجفيف الإيثانول عن طريق سكب 25 milliliters من تركيزات الإيثانول المناسبة والماء الخالي من RNA في أوعية الصبغ المرفقة مع طقم histo gene.

ضع جميع الجرار في دلو ثلج باستثناء جرة واحدة من الـ 75%ethanol. ضع جرة الـ 75%ethanol تلك في مجمد بدرجة حرارة -20 °C. بعد ذلك، قم بتحضير محلول التلوين بإضافة 1 µL من RNAs inhibitor لكل 100 µL من محلول التلوين.

بما أننا سنقوم بصبغ أربعة مقاطع نسيجية على شريحتين، يتم إضافة 4 µL من مثبط RNAs إلى 400 µL من محلول الصبغ في أنبوب طرد مركزي صغير. يُحفظ محلول الصبغ على الثلج، وذلك تحت غطاء محرك الدخان.

أضف المناخل الجزيئية إلى جرة الزيلين لإزالة الماء الزائد، والذي قد يؤثر سلباً على رفع النسيج. قم بتشغيل الحمام المائي مع ضبط درجة الحرارة على 42 °C ووضع أنبوب Falcon سعة 50 milliliter مدعوماً بحامل في الحمام المائي. أخرج شريحتين من المجمد عند درجة حرارة -80 °C وقم بإذابة الجليد عنهما على منديل Kim wipe.

لمدة 30 ثانية تقريبًا أو حتى تبدأ زوايا الشرائح في الذوبان، قم بتثبيت الأنسجة لفترة وجيزة في الإيثانول بتركيز 75% لمدة 30 ثانية في المجمد عند درجة حرارة -20 °C. بعد ذلك، وباستخدام ملقط خالٍ من RNA، انقل الشرائح إلى ماء خالٍ من النوكلييز لغسلها لمدة 30 ثانية. بعد غسل الشرائح، قم بتحديد المقاطع باستخدام قلم حاجز PAP لتركيز محلول التلوين على المقطع، ثم لوّن المقاطع الأربعة باستخدام محلول تلوين histo gene لمدة 20 ثانية. وبكمية 97 µL من الصبغة/مثبط RNA لكل مقطع، قم بإزالة الماء من المقاطع في الإيثانول المحضر مسبقًا على الثلج لمدة 30 ثانية لكل خطوة.

يجب تمديد الخطوة الأخيرة باستخدام ethanol بنسبة 100% إلى ثلاث دقائق لتحقيق تجفيف كافٍ لرفع الأنسجة بشكل مناسب. وأخيرًا، تُغمر الشرائح في xylene لمدة خمس دقائق، مع ترك الشرائح لتجف تمامًا في الهواء قبل الانتقال إلى عملية التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري؛ إذ يجب إزالة العصبونات الهرمية فورًا بعد إجراء صبغ عملية الالتقاط الليزري للخلية الواحدة. يتطلب التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري أو LCM حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة Celsius يحتوي على أنبوب Falcon سعة 50 milliliter مدعوم بمسند، والذي تم إعداده مسبقًا.

يتم إجراء التقاط الليزر للخلايا المنفردة (Single cell LCM) باستخدام نظام وبرمجيات ARCTURUS XT للالتقاط بالليزر. لبدء هذا الإجراء، قم بتحميل الشرائح والأغطية على جهاز arcturus XT. استخدم أغطية capture HS، مع الإبقاء على إعداد البرنامج على وضع macro.

انقر فوق مربع التحميل الخاص بالنظرة العامة للحصول على صورة عامة لكل شريحة. اضبط سطوع التركيز عند تكبير بمقدار 2x لتحديد المقطع الأمثل للاقتناص بالليزر. تجنب المقاطع النسيجية التي تحتوي على طيات مفرطة، واختَر المقاطع السليمة والملساء والمصبوغة.

سنضع غطاءً فوق المنطقة العامة التي سيتم التصوير منها، مع التأكد من تضمين المنطقة المراد التقاطها، وفي حالتنا هذه تكون الطبقة الثالثة من القشرة المخية. تأكد من أن قضبان الغطاء لا ترتكز على أي ثنيات، لأن ذلك سيؤدي إلى إمالة الغطاء، مما سينتج عنه أحجام بقع متفاوتة.

بعد ذلك، قم بتأكيد موقع بقعة ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR laser spot) يدويًا عند تكبير 40x. يجب أن يكون الصليب الأزرق متمركزًا داخل بقعة ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يكن كذلك، فقم بتعديل موقعه عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على البقعة واختيار "located IR spot".

باستخدام تكبير 40x، حدد العصبونات الهرمية وفقًا للمعايير التالية: أولاً، أن تكون الخلايا هرمية الشكل، وثانياً، أن يكون الجزء القريب من التغصنات القمية و/أو القاعدية قابلاً للتحديد. احفظ موضع الغطاء بالضغط على علامة الزائد في وظيفة الموضع. بهذه الطريقة، إذا تم تحريك الغطاء، فسيعود دائماً بدقة إلى نفس النقطة التي ضبطت عندها حجم البقعة.

أدخل هذه القيم في صندوق التحكم: 70 في الطاقة (power) و16 في المدة (duration). وبما أن هذه المعلمات محددة لنسيجنا، فإننا نوصي باختبار هذه المتغيرات وتعديلها وفقاً لعينة النسيج الخاصة بك قبل البدء. عند التقاط الخلايا المفردة بالليزر، قم بإلغاء تحديد خيار التحريك التلقائي للمنصة (auto move stage) وتأكد من أن رمز الحجم الصحيح يتوافق مع الرمز الموجود في اللوحة على اليمين.

اختر خيار الدائرة في أسفل اليمين لتحديد العصبون الذي ترغب في اختبار التقاطه. وبعد محاذاة الصليب الأزرق مع الدائرة، قم بتنشيط الليزر بالنقر فوق test IR spot. يجب أن تظهر البقعة الناتجة عن الليزر في البداية على شكل حلقة داكنة حادة حول الجسم الملتقط.

تأكد من أن الحلقة كبيرة بما يكفي لتشمل الخلية، ولكن صغيرة بما يكفي بحيث لا تتضمن أنسجة غير مرغوب فيها أو خلايا أخرى. إذا كانت هذه الحلقة فاتحة اللون للغاية، فهذا يعني أن الخلية لم يتم التقاطها. أما إذا كانت هناك بقعة داكنة في منتصف الحلقة الداكنة، فإن قوة الليزر/مدته تكون زائدة عن الحد.

كرر هذه العملية على أجزاء مختلفة من النسيج ضمن الطبقة التي ترغب في التقاطها. للتأكد من أن حجم البقعة لا يختلف باختلاف الموقع، قم بالتعديل وفقاً لذلك. حدد الخلايا العصبية الهرمية المراد التقاطها، وبعدد يصل إلى 500 خلية تقريباً.

اضغط على زر الالتقاط بالليزر لالتقاط الخلايا. انقل الغطاء إلى محطة مراقبة الجودة (QC). تأكد من إزالة 90% على الأقل من العصبونات.

إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بالتقاط المزيد من الخلايا في المنطقة التي تم فيها التقاط معظم الخلايا. ضع الغطاء في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 milliliter يحتوي على 50 microliters من محلول الاستخلاص المنظم. لقد تم تصميم الغطاء ليكون محكماً تماماً لمنع تسرب المحلول المنظم.

اقلب التجميعة رأساً على عقب، مع التأكد من أن محلول الاستخلاص يغطي الغطاء بالكامل، ثم ضعها في قاع أنبوب فالكون سعة 50 milliliter في الحمام المائي المضبوط على 42 درجة Celsius. يتم تحضين العصبونات لمدة 30 دقيقة لإزالة النسيج من الغطاء، وبعد انتهاء التحضين، يتم طرد التجميعة المكونة من الأنبوب والغطاء مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 800 gs. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الغطاء.

إذا كان عزل الـ RNA سيتم في وقت لاحق، فقم بتخزين مستخلص الخلايا المتبقي عند درجة حرارة -80 °C. خلاف ذلك، استمر في عزل الـ RNA من مستخلص الخلايا كما هو موضح في القسم التالي؛ حيث يتم إجراء عزل الـ RNA باستخدام طقم PICO pure isolation kit، المصمم لعزل أعداد صغيرة من الخلايا من عينات LCM والاحتفاظ بـ mRNA منخفض الوفرة.

لبدء هذا الإجراء، أضف 70% ethanol المرفق مع الطقم إلى مستخلص الخلايا وقم بالطرد المركزي باستخدام عمود تنقية مهيأ مسبقاً. ومن أجل ربط الـ RNA بمرشح العمود بعد الغسيل، عالج الـ RNA باستخدام DNase للتخلص من خطر تداخل الـ DNA. وتعد هذه الخطوة مهمة بشكل خاص في التطبيقات اللاحقة مثل real-time R-T-P-C-R.

بعد هضم DNA، أضف 40 µL من محلول الغسيل الأول (wash buffer one) وقم بطرد مركزي لعمود التنقية لمدة 15 ثانية عند 8,000 Gs. بعد ذلك، استمر في عمليات الغسيل وفقاً للبروتوكول المرفق مع الطقم، ولكن قم بتمديد خطوة الغسيل النهائية باستخدام محلول الغسيل الثاني (wash buffer two) من دقيقتين إلى دقيقتين ونصف لضمان عدم بقاء أي من محلول الغسيل في العمود، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تقليل حصيلة RNA. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر. أضف محلول الاستخلاص (elucian buffer) واتركه فترة تحضين على المرشح الموجود في العمود لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بطرد العمود مركزياً لاستخلاص RNA.

أخيرًا، تحقق من جودة الـ RNA المستخلص عن طريق تشغيل شريحة مختبر Experian High Sense، والتي توفر هلامًا افتراضيًا ومخططًا كهربائيًا؛ قم بنقل 1.3 µL من العينة باستخدام الماصة إلى أنبوب سعة 0.5 mL. وبالنسبة لاختبار مراقبة الجودة، قم بتجميد بقية العينة عند -80 °C. وبمجرد التحقق من جودة الـ RNA، يمكن تضخيمه ووسمه وتهجينه.

لإجراء تحليل تحديد ملامح التعبير الجيني، سيتم تنفيذ جولتين من التضخيم الخطي باستخدام طقم ribo amp HS plus، وهو ما يجب أن ينتج عنه حوالي 50 micrograms من الـ RNA المضخم، وهي كمية كافية لإجراء تجارب المصفوفات الدقيقة (microarray) وتجارب Q-R-T-P-C-R. ويُستخدم طقم turbo biotin labeling و labeling من شركة molecular devices لوسم الـ RNA المضخم. وأخيرًا، سيتم إجراء تحديد ملامح التعبير الجيني باستخدام شريحة الجينات البشرية human X three P gene chip pro beret من شركة atrix.

يجب أن يؤدي تقطيع الأنسجة إلى الحصول على شريحتين تحتوي كل منهما على مقطعين، ليكون المجموع أربعة مقاطع لكل حالة. كما يجب أن يكون كل مقطع أملس مع حد أدنى من التمزق أو التشقق أو الطي. ويجب أن تظهر العصبونات الهرمية مصبوغة بلون داكن وبحجم يتراوح بين 20 إلى 25 ميكرومتر، وبشكل هرمي مع بروز الزوائد الشجرية القمية.

خلال عملية المجهر الليزري لالتقاط الخلايا (LCM)، وبعد نبض الليزر عبر الفيلم اللدن بالحرارة، تلتصق الخلايا بالغطاء وبالتالي لا تعود موجودة على الشريحة، مما يترك الأنسجة المحيطة. يجب أن تلتصق ما يقرب من 85 إلى 100% من العصبونات بالغطاء عند استخدام أغطية التقاط HS مع الإعدادات الكلية والضبط الصحيح لقوة وشدة الليزر. بالنسبة لكل مقطع، يجب أن تحصل على حوالي 500 إلى 700 خلية لكل مقطع، مما ينتج عنه ما لا يقل عن 500 picograms من إجمالي RNA لكل حالة.

بعد عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي، يتم تقييم جودة الـ RNA عن طريق مخطط الرحلان الكهربائي وهلام افتراضي باستخدام جهاز BioRad Experian. يجب أن يظهر في مخطط الرحلان الكهربائي قمتان متميزتان تقابلان وحدات الـ RNA الريبوزومي 18 s و20 a s في الأنسجة التي تم جمعها بعد الوفاة. ومع ذلك، قد لا يكون هذا هو الحال دائماً، حيث قد تتحلل الأنسجة بسبب عوامل سابقة لعملية التقطيع.

ستلاحظ عادةً نتوءًا كبيرًا يشير إلى التحلل مع ظهور قمة كبيرة حول 18 s وقمة أصغر عند 28 s كما تشير الأسهم الحمراء. وفي المقابل، سيظهر الحمض النووي الريبوزي (RNA) رديء الجودة الذي يعاني من تحلل مفرط في شكل مخطط كهربائي (electropherogram) ذي مساحة كبيرة تحت المنحنى. وبالإضافة إلى الإزاحة نحو الأسفل في موقع الانتشار لاختبار جودة mRNA بعد جولتين من التضخيم الخطي، فإننا نستخدم كلًا من شريحة BioRad Experian standard Sense lab والمطياف الضوئي NanoDrop.

تتطلب تقنية مصفوفات Atrics الدقيقة التقليدية أن يكون نطاق توزيع نسخ mRNA بطول 600 نوكليوتيدات على الأقل حتى يمكن اكتشافها باستخدام هذا البروتوكول. وقد وصل نطاق توزيع mRNA إلى حدود 1000 نوكليوتيدة، كما هو موضح في مخطط الرحلان الكهربائي (electropherogram) حيث تظهر قمم كبيرة تتناقص تدريجياً مع مرور الوقت. كما تم تأكيد هذه النتيجة بواسطة الجل الافتراضي.

إذا كانت أطوال النسخ أقصر من 600 نوكليوتيد، فلا ينبغي إدراج العينة. وبالنسبة للتهجين، أشارت قراءات NanoDrop إلى متوسط نسبة 260 إلى 280 أو نقاء قدره 2.5 عبر العينات. وكان متوسط التركيز 1.7 micrograms per microliter، مما أدى إلى الحصول على 50 micrograms تقريبًا من mRNA لكل عينة، وهي كمية كافية لتحليل المصفوفات الدقيقة والتحقق اللاحق، والذي يتطلب ما بين 15 إلى 20 micrograms من mRNA والتحقق اللاحق من النتائج باستخدام QR TPCR. وتشير نتائجنا إلى أنه باستخدام هذا البروتوكول، تكون كل من كمية وجودة RNA التي تم الحصول عليها جيدة بما يكفي لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني عبر شريحة atrix human X three P.

بعد التهجين باستخدام شريحة Atrics Human X three P، حققنا متوسط نسب استدعاء بلغ 26.6%، مما يشير إلى كفاءة التهجين وشدة السبر. لقد عرضنا لكم للتو كيفية استخدام الالتقاط بالليزر لعزل العصبونات المجاورة للمحور من أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة، وذلك من أجل استخدام الـ RNA المستخلص من هذه الخلايا. وبالنسبة لدراسات التنميط الجيني باستخدام المصفوفات الدقيقة عند إجراء هذا البروتوكول، فمن الضروري تنفيذ جميع الخطوات في بيئة خالية من الـ RNase وإتمام الخطوات في الوقت المناسب للحفاظ على سلامة الـ RNA.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.