الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

نحن تصف العملية باستخدام الليزر التقاط microdissection لعزل واستخلاص الحمض النووي الريبي من السكان خلية واحدة متجانسة ، العصبونات الهرمية ، في الثالث من طبقة التلفيف الصدغي العلوي في العقول بعد الوفاة الإنسان. نحن في وقت لاحق تضخيم خطي (T7 على أساس) مرنا ، ويهجن العينة إلى ميكروأري Affymetrix X3P الإنسان.

يبدأ هذا الإجراء بتقسيم ثمانية كتل من الأنسجة المجمدة ببخار النيتروجين السائل على ناظم البرد عند 17 درجة مئوية تحت الصفر على شرائح زجاجية عادية غير مشحونة. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأقسام بمجموعة تلطيخ الجينات الهيستو. بعد تحديد الخلايا العصبية الهرمية ، يتم التقاط الخلايا التي يبلغ عددها حوالي 500 خلية بالليزر على غطاء التقاط HS.

يتم وضع الغطاء الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 50 ميكرولترا من محلول الاستخراج المقلوب رأسا على عقب ويوضع في أنبوب فالكون الذي تم وضعه سابقا في العراق ، جالسا في حمام مائي تم ضبطه على 42 درجة مئوية. بعد خطوة طرد مركزي قصيرة ، تتم إزالة الغطاء. ثم يكون الحل المتبقي جاهزا لعزل الحمض النووي الريبي.

مرحبا ، أنا شارمين بيترسون من مختبر ويلسون وو في قسم علم الأعصاب الهيكلي والجزيئي في مستشفى ماكلين. سنعرض لكم اليوم إجراء لالتقاط الخلايا العصبية شبه المعدنية بالليزر من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التعبير الجيني التفاضلي في الرؤساء والتلفيف الضعيف لمرضى الفصام باستخدام تقنية المصفوفات الدقيقة.

لذلك دعونا نبدأ. تم الحصول على أنسجة المخ من مركز موارد أنسجة المخ بجامعة هارفارد ككتل مجمدة لبخار النيتروجين السائل قبل تقطيع الأنسجة. من المهم تقليل تلوث الحمض النووي الريبي ، تتم معالجة جميع الأسطح ، بما في ذلك منطقة العمل وشفرة التقسيم والشرائح بمحلول إزالة تلوث الحمض النووي الريبي ، مثل RNA SAP ويتم مسحها باستخدام 100٪ من الإيثانول.

يبدأ هذا الإجراء بتقسيم كتل الأنسجة المجمدة ببخار النيتروجين السائل على ناظم البرد الذي تم ضبطه عند 17 درجة مئوية تحت الصفر على شرائح زجاجية عادية غير مشحونة. أقسام الأنسجة جاهزة الآن لتحديد الخلايا العصبية الهرمية باستخدام مجموعة تلطيخ الجين الهيستو. قم بإعداد سلسلة تجفيف الإيثانول بمقدار 25 مل من تركيزات الإيثانول المناسبة والماء الخالي من الحمض النووي الريبي في برطمانات التلوين المزودة بمجموعة الجينات الهيستو.

ضع جميع البرطمانات في دلو ثلج باستثناء جرة إيثانول واحدة بنسبة 75٪. ضع 75٪ من الإيثانول في الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التلوين عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من مثبطات الحمض النووي الريبي لكل 100 ميكرولتر من محلول التلوين.

نظرا لأننا سنقوم بتلوين أربعة أقسام للأنسجة على شريحتين ، تتم إضافة أربعة ميكرولترات من مثبطات الحمض النووي الريبي إلى 400 ميكرولتر من محلول التلوين في أنبوب طرد مركزي صغير. احتفظ بمحلول التلوين على الثلج. تحت غطاء الدخان.

أضف المناخل الجزيئية في وعاء الزيلين لإزالة الماء الزائد ، مما قد يضر برفع الأنسجة. قم بتشغيل الحمام المائي مع ضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية وضع أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر مدعوما برف في الحمام المائي. قم بإزالة شريحتين من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج عليهما على مناديل كيم.

لمدة 30 ثانية تقريبا أو حتى تبدأ زوايا الشرائح في تذويب الجليد ، قم بتثبيت الأنسجة لفترة وجيزة في 75٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية في الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر. ثم باستخدام ملقط خال من الحمض النووي الريبي ، انقل الشرائح إلى الماء الخالي من النوكلياز للغسيل 32 بعد غسل الشرائح ، حدد الخطوط العريضة للأقسام بقلم حاجز PAP لتركيز محلول التلوين على القسم ، وصمة عار الأقسام الأربعة بمحلول تلطيخ الجين الهيستو لمدة 20 ثانية. مع 97 ميكرولترا من مثبطات الحمض النووي الريبي المائل للبقع لكل قسم ، تجفف الأقسام الموجودة في الإيثانول المعد مسبقا على الجليد لمدة 30 ثانية لكل خطوة.

يجب تمديد خطوة الإيثانول الأخيرة بنسبة 100٪ إلى ثلاث دقائق لتحقيق الجفاف الكافي لرفع الأنسجة بشكل مناسب. أخيرا ، اغمر الشرائح في الزيلين لمدة خمس دقائق ، مما يسمح للشرائح بالجفاف تماما في الهواء قبل الشروع في التقاط التشريح الدقيق بالليزر ، ويجب إزالة الخلايا العصبية الهرمية على الفور بعد تلطيخ إجراء التقاط الليزر أحادي الخلية. يتطلب التشريح المجهري أو المضاعف المشترك الأصغر حماما مائيا بدرجة حرارة 42 درجة مئوية يحتوي على أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر مدعوما ب a ، والذي تم إعداده مسبقا.

يتم إنجاز المضاعف المشترك الأصغر أحادي الخلية باستخدام نظام وبرنامج الالتقاط بالليزر ARCTURUS XT. لبدء هذا الإجراء ، قم بتحميل الشرائح والأغطية على جهاز arcturus XT. استخدم أغطية HS الالتقاط ، ولكن احتفظ بإعداد البرنامج على الماكرو.

انقر فوق المربع تحميل مع نظرة عامة للحصول على صورة نظرة عامة على كل شريحة. اضبط تركيز السطوع عند تكبير اثنين x لتحديد القسم الأمثل لالتقاط الليزر. تجنب أقسام المناديل ذات الطي المفرط ، ولكن اختر أقساما سليمة وناعمة وملطخة.

ضع حكما فوق المنطقة العامة التي ستلتقطها ، مع التأكد من تضمين المنطقة المراد التقاطها في حالتنا. الطبقة الثالثة من القشرة. تأكد من أن قضبان الغطاء لا تستقر على أي طيات لأن ذلك سيؤدي إلى إمالة الغطاء مما يؤدي إلى أحجام موضعية متغيرة.

بعد ذلك ، قم بتأكيد موقع بقعة ليزر الأشعة تحت الحمراء يدويا عند التكبير 40 ×. يجب أن يتمركز الصليب الأزرق داخل بقعة ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط موقعه عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الفور وتحديد بقعة الأشعة تحت الحمراء الموجودة.

عند تكبير 40 × ، حدد الخلايا العصبية الهرمية وفقا للمعايير التالية ، واحدة من خلايا هرمنا في الشكل والثانية ، يمكن التعرف على الجزء القريب من التشعبات القمية و / أو القاعدية. احفظ موضع الحد الأقصى بالنقر فوق علامة الجمع في وظيفة الموقف. بهذه الطريقة ، إذا تم تحريك الغطاء ، فسيعود دائما إلى نفس المكان الذي قمت بتعديل حجم البقعة له.

أدخل هذه القيم في مربع التحكم 70 في الطاقة و 16 في المدة. نظرا لأن هذه المعلمات خاصة بأنسجتنا ، فإننا نوصيك باختبار هذه المتغيرات والتكيف معها وفقا لعينة الأنسجة المحددة قبل البدء. باستخدام التقاط الخلايا المفردة بالليزر ، قم بإلغاء النقر فوق خيار مرحلة الحركة التلقائية وتأكد من ارتباط رمز الحجم الصحيح بالرمز الموجود على اللوحة على اليمين.

حدد خيار الدائرة في أسفل اليمين لتحديد الخلايا العصبية التي ترغب في اختبار التقاطها. وبعد محاذاة الصليب الأزرق مع الدائرة ، قم بتنشيط الليزر بالنقر فوق بقعة الأشعة تحت الحمراء للاختبار. يجب أن تحتوي البقعة التي يصنعها الليزر أولا على حلقة داكنة واضحة حول الكائن الذي تم التقاطه.

تأكد من أن الحلقة كبيرة بما يكفي لتشمل الخلية، ولكنها صغيرة بما يكفي بحيث لا تحتوي على أنسجة أو خلايا أخرى غير مرغوب فيها. إذا كانت هذه الحلقة خفيفة جدا ، فلن يتم التقاط الخلية. إذا كانت هناك بقعة داكنة في منتصف الحلقة المظلمة ، فإن مدة قطع قوة الليزر تكون كبيرة جدا.

كرر هذه العملية على أجزاء مختلفة من الأنسجة داخل الطبقة التي ترغب في التقاطها. للتحقق من أن حجم البقعة لا يختلف حسب الموقع ، اضبط وفقا لذلك. تحديد الخلايا العصبية الهرمية لالتقاط ما يقرب من 500 خلية.

اضغط على زر الالتقاط بالليزر لالتقاط الخلايا. انقل الغطاء إلى محطة مراقبة الجودة. تأكد من إزالة 90٪ على الأقل من الخلايا العصبية.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالتقاط المزيد من الخلايا في المنطقة التي تم فيها التقاط معظم الخلايا. ضع الغطاء في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج. تم تصميم الغطاء ليناسب تماما لمنع تسرب المخزن المؤقت.

اقلب المجموعة رأسا على عقب ، وتأكد من أن المخزن المؤقت للاستخراج يغطي الغطاء بالكامل وضعه في الجزء السفلي من أنبوب فالكون سعة 50 مليلتر في الحمام المائي المضبوض على 42 درجة مئوية. احتضان الخلايا العصبية لمدة 30 دقيقة لإزالة الأنسجة من الغطاء بعد الحضانة ، والطرد المركزي للأنبوب ومجموعة الغطاء لمدة دقيقتين عند 800 جرام. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الغطاء.

إذا كان عزل الحمض النووي الريبي لن يتم إجراؤه إلا في وقت لاحق. قم بتخزين مستخلص الخلية المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بخلاف ذلك ، استمر في عزل الحمض النووي الريبي عن مستخلص الخلية كما هو موضح في القسم التالي ، يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة العزل النقي PICO ، والتي تم تصميمها لعزل أعداد صغيرة من الخلايا من عينات المضاعف المشترك الأصغر والاحتفاظ بالحمض النووي الريبي المرسال منخفض الوفرة.

لبدء هذا الإجراء ، أضف 70٪ من الإيثانول المزود مع المجموعة إلى مستخلص الخلية وجهاز الطرد المركزي على عمود تنقية مشروط مسبقا. من أجل ربط الحمض النووي الريبي بمرشح العمود بعد الغسيل ، عالج الحمض النووي الريبي ب D Ns للتخلص من خطر تداخل الحمض النووي. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص في تطبيقات المصب مثل R-T-P-C-R في الوقت الفعلي.

بعد هضم الحمض النووي ، أضف 40 ميكرولتر من مخزن الغسيل الأول وقم بالطرد المركزي لعمود التنقية لمدة 15 ثانية عند 8 ، 000 Gs ، وبعد ذلك ، تابع عمليات الغسيل وفقا للبروتوكول المقدم مع المجموعة ، ولكن قم بتمديد خطوة الغسيل النهائية مع مخزن الغسيل الثاني من دقيقتين إلى دقيقتين ونصف لضمان عدم وجود مخزن مؤقت للغسيل في العمود ، والتي يمكن أن تقلل من إنتاجية الحمض النووي الريبي الخاص بك. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي صغير آخر. أضف المخزن المؤقت elucian واحتضن على المرشح في العمود لمدة دقيقة واحدة ، وقم بالطرد المركزي للعمود لمسح الحمض النووي الريبي.

أخيرا ، تحقق من جودة الحمض النووي الريبي المستخرج عن طريق تشغيل شريحة مختبر Experian High Sense ، والتي توفر هلام افتراضي وماصة كهربية 1.3 ميكرولتر من العينة في أنبوب سعة 0.5 ملليلتر. لاختبار مراقبة الجودة ، قم بتجميد باقي العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بمجرد التحقق من جودة الحمض النووي الريبي ، يمكن تضخيمه وتصنيفه وتهجينه.

لتحليل التنميط للتعبير الجيني ، سيتم إجراء جولتين من التضخيم الخطي باستخدام مجموعة ribo amp HS plus ، والتي يجب أن تؤدي إلى ما يقرب من 50 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي المضخم بما يكفي لأداء كل من تجارب المصفوفة الدقيقة و Q-R-T-P-C-R. يتم استخدام مجموعة وضع العلامات على البيوتين التوربيني ووضع العلامات من الأجهزة الجزيئية لتسمية الحمض النووي الريبي المضخم. أخيرا ، سيتم إجراء التنميط الجيني باستخدام القبعة الاحترافية لشريحة الجينات X three P من الأذين.

يجب أن ينتج عن تقسيم الأنسجة شريحتين بقسمين لكل شريحة ، وأربعة أقسام في المجموع لكل حالة. يجب أن يكون كل قسم سلسا مع الحد الأدنى من التمزق أو التكسير أو الطي. يجب أن تكون الخلايا العصبية الهرمية ملطخة بشكل داكن بحجم حوالي 20 إلى 25 ميكرومتر مع شكل هرمي وتشعبات قمية مرئية.

أثناء المضاعف المشترك الطويل ، بعد أن ينبض الليزر عبر فيلم اللدائن الحرارية ، تلتصق الخلايا بالغطاء وبالتالي لم تعد على الشريحة تاركة الأنسجة المحيطة. خلف ما يقرب من 85 إلى 100٪ من الخلايا العصبية يجب أن تلتصق بالغطاء مع أغطية HS الالتقاط في إعدادات الماكرو والضبط الصحيح لقوة الليزر وقوته. لكل قسم ، يجب أن تحصل على حوالي 500 إلى 700 خلية لكل قسم مما ينتج عنه ما لا يقل عن 500 بيكوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل حالة.

بعد عزل الحمض النووي الريبي الكلي ، يتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي عن طريق مخطط كهربية وهلام افتراضي عبر BioRad Experian. في مخطط الكهربية ، يجب أن ترى قمتين متميزتين تقابلان وحدات الحمض النووي الريبي الريبوزومي 18 ثانية و 20 ثانية مع أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك ، ليس هذا هو الحال دائما حيث قد تتحلل الأنسجة بسبب عوامل قبل التقطيع.

سترى عادة نتوءا كبيرا يشير إلى التدهور مع ذروة كبيرة حوالي 18 ثانية وذروة أصغر 28 ثانية كما هو موضح في الأسهم الحمراء. في المقابل ، سيتم الإشارة إلى الحمض النووي الريبي ذو الجودة الرديئة مع الكثير من التدهور بواسطة مخطط كهربية بمساحة كبيرة تحت منحنىه. بالإضافة إلى خفض التحول في موقع الانتشار لاختبار جودة mRNA بعد جولتين من التضخيم الخطي ، نستخدم كلا من شريحة مختبر BioRad Experian القياسية Sense ومقياس الطيف الضوئي NanoDrop.

تتطلب تقنية المصفوفات الدقيقة التقليدية من Atrics أن يكون انتشار نسخة mRNA 600 نيوكليوتيد على الأقل حتى يتم اكتشافها باستخدام هذا البروتوكول. وصل انتشار mRNA إلى نطاق 1000 نيوكليوتيدات كما هو موضح في مخطط الكهربية مع قمم كبيرة تنحدر ببطء كدالة للوقت. يتم تأكيد هذه النتيجة أيضا من خلال الجل الافتراضي.

إذا كانت أطوال النسخ أقصر من 600 نيوكليوتيد ، فلا ينبغي تضمين العينة للتهجين ، أشارت قراءات NanoDrop إلى متوسط اثنين 60 على نسبة 80 أو نقاء 2.5 عبر العينات. كان متوسط التركيز 1.7 ميكروغرام لكل ميكرولتر ، مما أدى إلى ما يقرب من 50 ميكروغراما من الرنا المرسال لكل عينة ، وهو ما يكفي لكل من تحليل المصفوفات الدقيقة والتحقق اللاحق ، والذي يتطلب ما بين 15 إلى 20 ميكروغراما من الرنا المرسال والتحقق اللاحق من النتائج باستخدام QR TPCR. تشير نتائجنا إلى أنه باستخدام هذا البروتوكول ، تكون كمية ونوعية الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه جيدة بما يكفي للتحقيق في اختلافات التعبير الجيني عبر شريحة الأذين البشرية X three P.

بعد التهجين إلى شريحة Atrics Human X three P ، حققنا نسبة مئوية من المكالمات بمتوسط 26.6٪ مما يشير إلى التهجين الكافي وشدة المسبار. لقد أوضحنا لك للتو كيفية التقاط الخلايا العصبية شبه المعدنية بالليزر من أنسجة المخ البشري بعد الوفاة من أجل استخدام الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من هذه الخلايا. بالنسبة لدراسات التنميط الدقيقة G عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم تنفيذ جميع الخطوات في بيئة خالية من الحمض النووي الريبي وإكمال الخطوات في الوقت المناسب من أجل الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.