طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

يتم تشغيل زلات الغطاء المستخدمة في هذا الاختبار باستخدام الدكسترين ثم دمجها في خلايا تدفق الموائع الدقيقة. بعد ذلك ، يتم تحضين كل خلية تدفق بتعليق من الجسيمات الشحمية ، والتي تندمج لتشكيل طبقة ثنائية دهنية فوق الدكسترين الرطب. تحت المجهر الفلوري ، تتم إضافة الفيروس المسمى بالفلورو الرابع والفلورسين المسمى ستربتافيدين ويسمح للفيروس بالالتحام بالطبقة الثنائية.

تدفق المخزن المؤقت الحمضي إلى بدء الاندماج الفيروسي مع الطبقة الثنائية وتسجل الكاميرا الرقمية التغيرات في التألق في جميع أنحاء الفحص. مرحبا ، أنا دانيال فلويد وأنا في مختبر أنين فانيان في قسم الكيمياء البيولوجية وعلم الأدوية الجزيئية بجامعة هارفارد. سأريكم اليوم طريقة لتصور حركية الاندماج الفيروسي على مستوى الجسيم الفردي.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة الطريقة التي يصل بها الفيروس إلى الخلايا المضيفة. لذلك دعونا نبدأ. ابدأ هذا البروتوكول بإعداد قسيمات غطاء الدكسترين الوظيفية.

تتمثل الخطوة الأولى في صوتنة زلات الغطاء في محاليل من المنظفات بنسبة 10٪ ، وهيدروكسيد البوتاسيوم المولي أسيتون ، و 100٪ سونيكات الإيثانول لمدة 30 دقيقة لكل محلول. واشطفها بالماء منزوع الأيونات بين الأيونات. بعد الصوتنة الأخيرة ، اشطف زلات الغطاء في الماء ، ثم جففها في حاضنة 80 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء في أداة تجرية بلازما الأكسجين لمدة ثلاث دقائق. تعمل هذه الخطوة على أكسدة سطح الشرائح ، مما يجعل الزجاج محبا للماء بشكل موحد وتفاعلا في خطوات العزلة التالية. بعد ذلك ، اغمر زلات الغطاء في محلول جديد من 0.2٪ gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy في الأيزوبروبانول واحتضانه لمدة خمس دقائق.

ثم شطف زلات الغطاء عدة مرات مع الأيزوبروبانول. ضع زلات الغطاء المطلي بسلان على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لعلاج هذه الخطوة يسمح للشرطة بالارتباط تساهميا بالزجاج.

بعد المعالجة ، رتب زلات الغطاء بشكل مسطح داخل صندوق الفريزر البلاستيكي. قم بتغطية السطح العلوي لكل زلة غطاء بحوالي ملليلتر واحد من محلول الدكسترين. 30٪ الوزن لكل حجم في الماء.

أغلق صندوق الفريزر واترك الغطاء ينزلق في مكان هادئ لمدة 24 إلى 36 ساعة. في اليوم التالي ، اسكب الدكسترين الزائد ، وامسك زلات الغطاء بالملقط البلاستيكي وأعدها إلى الرف الخزفي. اشطفها بالماء عدة مرات واتركها تنقع في الماء لمدة 48 ساعة.

يمكن تحريك الحاوية برفق على جهاز دوار على سطح الطاولة ، وتجفيف الغطاء ، وينزلق في فرن ، على درجة حرارة 80 درجة مئوية ، ويخزن في فراغ ، وتجفف حتى تصبح جاهزا للخطوة التالية. ينزلق طلاء الغطاء بمزيج من الجسيمات الشحمية لتشكيل طبقة ثنائية المسوي. الخطوة التالية هي تحضير الجسيمات الشحمية لتشكيل طبقة ثنائية الدهون في الغطاء ، ودمج جميع الدهون المذابة في الكلوروفورم في أنبوب اختبار زجاجي.

تشتمل تركيبة الجسيمات الشحمية على جانب dia ganglia ، الذي يربط جزيئات الفيروس والدهون البيوتينيل ، والتي تربط مؤشر الأس الهيدروجيني المترافق مع الستربتافيدين فلورسين. بعد ذلك ، قم بتبخير المذيب تحت تيار من غاز الأرجون أو النيتروجين. وقم بإزالة المذيب المتبقي عن طريق ترك أنبوب الاختبار في فراغ مجفف لمدة ساعتين.

أعد تعليق فيلم الدهون المجفف في 400 ميكرولتر عازلة HNE. ثم انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي صغير. قم بتجميد المعلق في حمام نيتروجين سائل وقم بإذابة الثلج في حمام ماء دافئ.

كرر دورة ذوبان الجليد هذه أربع مرات بعد دورات ذوبان الجليد. استخدم آلة بثق الدهون المزودة بفلتر غشائي 100 نانومتر لبثق معلق الدهون. بعد 25 مرة من البثق ، يجب أن يبدو التعليق أكثر شفافية.

قم بتخزين الجسيمات الشحمية في درجة حرارة الغرفة واستخدم يوم التحضير. الآن بعد أن أصبحت الدهون جاهزة للذهاب ، قم بإعداد خلية تدفق الموائع الدقيقة. أولا ، خذ شريحة كوارتز مقاس 20 × 20 × ثلاثة ملم واستخدم لدغ ماسي لحفر فتحتين بحجم ملليمتر واحد على جانبي نقيض.

قطع مربع 20 ملم من ورقة من شريط لاصق مزدوج وباستخدام شفرة حلاقة. اقطع قسما مقاس 15 × ملليمترين من المركز. انزع جانبا واحدا من دعامة الشريط وألصق الشريط بشريحة الملعب.

قم بلصق الجانب الآخر بزلة غطاء وظيفية مقطوعة الآن إلى أطوال 20 سم من أنابيب البولي إيثيلين وأدخلها في الفتحات الموجودة في شريحة الكوارتز. أخيرا ، أغلق خلية التدفق بغراء إيبوكسي لمدة خمس دقائق. انشر الغراء حول جوانب شريحة الكوارتز لربطها بقلة الغطاء.

استخدم قطرتين أخريين من الغراء لإغلاق الاتصال بين الأنبوب وشريحة الكوارتز. عندما يتم علاج الغراء ، قم بتجهيز خلية التدفق والأنابيب باستخدام عازلة HNE. بعد ذلك لإنشاء طبقة الدهون الثنائية المدعومة ، خذ تعليق الجسيم الشحمي المبثوق واسحب حوالي 80 ميكرولترا في القنوات في اليوم السابق لتجربة الاندماج.

ابدأ في تسمية جزيئات الفيروس لتسمية الجزء الداخلي الفيروسي باللون الأحمر. يمزج 20 ميكرولترا من الكبريت الطازج أو محلول SRB مع 10 ميكرولتر من المعلق الفيروسي ويترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق تمرير تعليق الفيروس عبر عمود تحلية PD 10 وتخفيفه ب 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت HNE.

يجب أن يحتوي العمود على شريط ملون واضح يحتوي على الفيروس المسمى. اجمع هذا الجزء خلال الخطوة الإليلوسية بعد ذلك ، قم بتسمية الغلاف الفيروسي باللون الأخضر عن طريق إضافة 13 ميكرولترا من ملصق ثماني الأسنان أو RUMINE واحد 10 أو RH واحد 10 C 18 إلى المعلق الفيروسي المسمى SRB. حرك التعليق عن طريق ربط الأنبوب بدوار المختبر واتركه لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك ، قم بإزالة الرطوبة النسبية الزائدة 10 C 18 باستخدام عمود تحلية المياه PD 10. كما كان من قبل ، أصبح الفيروس جاهزا لمقايسة الاندماج. قم بإجراء مقايسة حركية الاندماج باستخدام مجهر مضان مزود بهدف غمر الزيت بفتحة عددية عالية.

يثير ليزر الكريبتون Argonne أربعة الفلورو في الغشاء الفيروسي والداخل. ثم تقوم مرآة ثنائية اللون بتقسيم انبعاثات التألق الأحمر والأخضر وتركز الصور بشكل مستقل على نصفين منفصلين من الإلكترون الذي يضاعف CCD أو كاميرا الجهاز المقترنة بالشحن. قم بتركيب زلة الغطاء على مرحلة المجهر وقم بتوصيل أنبوب المخرج بمضخة حقنة مضبوطة لتتدفق بسرعة 100 ميكرولتر في الدقيقة.

قم بتنظيف قنوات التدفق من الجسيمات الشحمية الزائدة عن طريق التدفق في 300 ميكرولتر من HNE. ركز المجهر واضبط طاقة الليزر لإضاءة السطح ب 350 واط لكل سنتيمتر مربع من 488 نانومتر ضوء لإثارة النباتات الحمراء ، أربعة و 70 واط لكل سنتيمتر مربع من 568 نانومتر ضوء لإثارة النباتات الخضراء. أربعة. الآن بعد أن أصبح المجهر جاهزا ، تم تخفيف المضخة المسمى الفيروس من واحد إلى مائة في خلية التدفق.

عندما ينتشر الفيروس على السطح السفلي لقناة التدفق ، تبدأ جزيئات الالتحام. التمسك بجانب العقد DIA ، مدمج في زلات الغطاء ، طبقة ثنائية مستوية. عندما تصل كثافة الجسيمات الراسية إلى حوالي عدة مئات من الجسيمات لكل مجال رؤية ، ابدأ في التدفق في محلول ميكروغرام لكل مليلتر.

الفلوريسين المسمى الستيربتافيدين العقدية ، وهو فلوروفور حساس للأس الهيدروجيني حيث يرتبط الستربتافيدين المسمى بجزيئات الدهون المقترنة بالبيوتين في الطبقة الثنائية. تظهر خلفية خضراء خافتة مرة أخرى ، اغسل قناة التدفق ب 300 ميكرولتر من HNE. الآن بعد أن رست الفيروسات وسطح الطبقة الثنائية مغطى بالفلورسين ، فقد حان الوقت لبدء الفحص.

اختر منطقة تصوير ، وركز على المجهر وقم بإعداد كاميرا CCD للحصول على الصور المنقضية بمرور الوقت. اضبط وقت التعريض الضوئي على 100 مللي ثانية واجمع الإطارات بمعدل 10 هرتز. ابدأ اندماج غشاء الفيروس عن طريق التدفق في مخزن مؤقت لسترات الصوديوم الحمضية.

عندما ينخفض الرقم الهيدروجيني ، يخفت مضان الفلورسين ، مما يشير إلى وقت التحمض. تسجل كاميرا CCD البيانات في جميع أنحاء الفحص ، والتي يمكن للمرء استخدامها لتحديد وقت اندماج النصف وضعف التكوين كما هو موثق بواسطة كاميرا CCD. بعد انخفاض الأس الهيدروجيني ، هناك رشقات نارية من التألق الأخضر حيث تندمج الأغشية الفيروسية والمسوية ، وتختلط الدهون ويتم تخفيف الصبغة الخضراء في الغلاف الفيروسي في الغشاء المستوي.

في المقابل ، هناك تسوس في التألق الأحمر بعد انخفاض الأس الهيدروجيني حيث تشكل الأغشية الفيروسية والدهون مسامما تسمح للصبغة الحمراء من الداخل الفيروسي بالهروب إلى المساحة المائية أسفل الطبقة الثنائية المستوية وبعيدا عن الأنظار ، ويمكن أيضا تصور هذه الاتجاهات من خلال لقطات الفلورسنت قبل وأثناء الاندماج. قم أيضا برسم بياني لمسارات شدة التألق لكل جسيم كما هو موضح في هذا المثال ، يتم تعريف اندماج النصف على أنه النقطة التي يكون عندها منحدر شدة التألق الأخضر في أكثر حدة تكوينه للمسام كنقطة يحدث عندها اضمحلال التألق الأحمر. البيانات المجمعة من تجارب متعددة لإنشاء الرسوم البيانية لاندماج النصف وأوقات تأخر تكوين المسام كما هو موضح هنا ، باستخدام وقت انخفاض الأس الهيدروجيني حيث t يساوي صفرا لمزامنة البيانات من تجارب مختلفة.

لقد أوضحت لكم للتو طريقة لقياس حركية الاندماج الفيروسي على مستوى الجسيم الفردي. عند القيام بهذا الإجراء. تأكد من استخدام زلات غطاء نظيفة بحيث يكون لديك طبقة ثنائية متجانسة وسلسة.

أيضا تقليل كمية الضوء التي تستخدمها أثناء التصوير الفلوري حتى تتمكن من تقليل تلف الصورة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.