Name: تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: تعلم تقنية الترحيل الكهربائي لبولي أكريلاميد اليوريا الكاشفة لفصل الحمض النووي أحادي السلسلة أو الرنا في الأحياء الجزيئية. هذه الطريقة تتيح تحليل الأوليغونيوكليوتيدات المُصنّعة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل مجلس سنغافورة البحوث الأكاديمية (ARC) [منح عدد 90/07]. نشكر Radiodurans للدعم.

النص الكامل للبروتوكول ومفصلة عن هذا الإجراء التجريبي يتوفر في البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئية. ويمكن العثور مفصلة خطوة بخطوة تعليمات لتجميع وهلام ساندويتش لجهاز الجل على موقع BioRad 3. المعدات المطلوبة : ألواح الزجاج (الداخلي والخارجي) 10 خلية الطول : 10.1 X 7.3 سم (لوحة داخلية) ، 10.1 X 8.2 سم (لوحة الخارجي) ، BioRad 20 خلية الطول : 20 × 20 سم (لوحة داخلية) ، 20 × 22.3 سم (لوحة الخارجي) ، BioRad 0،5-1،5 مم المشط جل والفواصل صب جل الوقوف هلام مع غطاء الجهاز والكابلات ارتفاع امدادات الطاقة الفولطية كتلة تدفئة أو ماء الحمام ماصات المصلية والمساعدات الماصة ماصة ونصائح الماصة مجفف هلام أو الماسح الضوئي الكواشف والحلول : اليوريا (عالى النقاء) حل 40 ٪ بولي أكريلاميد (29:1) 10 × TBE الحل (تريس ، البورات ، EDTA العازلة) منزوع الأيونات والماء المقطر TEMED 30 ٪ (W / V) الأمونيوم حل بيرسلفات 0.5 X حل TBE Formamide EDTA الزيلين cyanol برومفينول الزرقاء الميثانول الإيثانول <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حجم </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 مل </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 مل </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 مل </td></tr><tr><td> تركيز مادة الأكريلاميد </td><td> 10 ٪ </td><td> 12.5 ٪ </td><td> 15 ٪ </td><td> 10 ٪ </td><td> 12.5 ٪ </td><td> 15 ٪ </td><td> 10 ٪ </td><td> 12.5 ٪ </td><td> 15 ٪ </td></tr><tr><td> ز اليوريا </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td> مل الاكريليك 40 ٪ (29:1) </td><td> 12.5 </td><td> 15.625 </td><td> 18.75 </td><td> 15 </td><td> 18.75 </td><td> 22.5 </td><td> 2.5 </td><td> 3،125 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> المجاهدين الجزائرية 30 ٪ </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> UL TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 × TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> تملأ حجم بالماء المقطر منزوع الأيونات </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1 : الكواشف والحلول اللازمة لتركيزات مختلفة وأحجام الأكريلاميد لتسوية [أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل واحد هلام التجمع ساندويتش وإعداد جيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جل وفقا للمصنعين وصفا وإصلاح هلام في هلام غرفة الصب 3. استخدام الفواصل سميكة 0،5-1،5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد الحل المناسب بولي أكريلاميد وفقا لبروتوكولات الحالية في مجال البيولوجيا الجزيئية أو كما هو موضح في الجدول رقم 1. لتغيير طبيعة هلام الأكريلاميد من 20 سم x 22 سم x 1.5 ملم ، و 60 مل من محلول هلام وعن 10.1 سم X 8.2 مم × 1 هلام هلام مل محلول 5 كافية. وتستخدم المواد الهلامية أكبر عندما المنتجات المتوقعة / نطاقات ضمن نطاق من قواعد قليلة ، فسوف أطول جل حل العصابات مع فارق واحد من النوكليوتيدات. إذا كانت العصابات المتوقع تختلف في أكثر من 10 النيوكليوتيدات ، وسوف تكون مناسبة أصغر المواد الهلامية لحل شظايا. اختر النسبة المئوية للبولي أكريلاميد التي تناسب متطلبات الفصل الخاص ، سوف تركيزات أعلى بولي أكريلاميد حل شظايا انخفاض الوزن الجزيئي. استخدام اليوريا عالى النقاء والاختلاط مع المبلغ المطلوب من مادة الأكريلاميد. إضافة العازلة TBE إلى مزيج هلام للحصول على التركيز النهائي للTBE س 0،5-1 وتملأ حجم بالماء المقطر منزوع الأيونات. الحل الحرارة لمدة 20 ثانية في الميكروويف ومزجها برفق. لأحجام أكبر هلام كرر هذه الخطوة حتى الحل هو دافئ اليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب جل فورا باستخدام ماصة المصلية ومساعدات ماصة التلقائي بين لوحات من الزجاج اثنين. تجنب إدخال فقاعات الهواء. إدراج المشط ، والسماح للهلام تتبلمر عن 30-60 دقيقة. </li></ol> إعداد الجهاز الكهربائي وprerun الجل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترجل الجل من غرفة الصب والتجميع على جهاز جل وفقا لتعليمات بتصنيع 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة السفلى العازلة العازلة الطرافة تشغيل (0.5-1 TBE س) أن لوحات زجاجية سيتم الفرعيةاندمجت 2-3 سم مع العازلة. ملء الغرفة العازلة العلوي يصل إلى الجزء العلوي من هلام مع تشغيل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية المشط وشطف تشغيل الآبار مع العازلة باستخدام ماصة وهلام تحميل النصائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق غطاء للنظام الجل وتوصيل كابلات لامدادات الطاقة العالية الجهد. قبل أن تتمكن من تحميل العينات الخاصة بك لديك لprerun جل ما لا يقل عن 30 دقيقة لتصل الحرارة الجل واليوريا لإزالة ما تبقى من هلام. يجب أن تكون درجة الحرارة المثلى بين 45-55 درجة مئوية. تجنب ارتفاع درجات الحرارة من 60 درجة مئوية ويمكن ان العصابات أو تشويه لوحات زجاجية يمكن خرقها. اختيار واط المستمر لprerun (15-25 واط لكل هلام). </li></ol> نموذج إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك إعداد العينات الخاصة بك. لذلك ، إضافة كمية مناسبة من هلام 2 × مزيج التحميل لعينتك. وعادة ما تحتوي على مزيج تحميل formamide 90 ٪ ، و 0.5 ٪ EDTA ، cyanol الزيلين 0.1 ٪ و 0.1 ٪ برومفينول الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يتم تحميل العينات في الجل ، يجب أن تكون حرارة العينات التشويه والتحريف عن طريق تسخين العينات بين 70-90 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. </li></ol> تحميل وتشغيل الجل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من prerun ، إزالة الغطاء وشطف جيوب بدقة كما هو موضح كما كان من قبل قد ترشح اليوريا في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق العينات بعناية من أسفل الجيب. تجنب إدخال فقاعات الهواء. تحميل العازلة يجب أن تطبق على جيوب فارغة للحفاظ على ظروف متساوية أثناء التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع وتشغيل الغطاء هلام في واط مستمرة للحفاظ على درجة حرارة 55 درجة من هلام مشابهة لما prerun C. مراقبة الهجرة من الأصباغ العلامة حتى الجبهة صبغ بلغ أدنى حد من هلام. مدة تشغيل يعتمد على نسبة من مادة الأكريلاميد المستخدمة ، وقوة الأيونية للالعازلة وسمك هلام. ويمكن لتشغيل الماضي بين 2-4 ساعات. الاختيار على درجة حرارة هلام. ويمكن لميزان الحرارة هلام يساعد على مراقبة درجة الحرارة المناسبة أثناء التشغيل. </li></ol> عملية الجل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الجبهة صبغ وصلت الى نهاية للوضع الجل الجل من الغرفة السفلى العازلة. إزالة هلام من الغرفة وتخفيف المشابك. أبتعد الفواصل وراءى بعناية لوحات زجاجية. إذا كان ذلك ضروريا خفض بعيدا العليا التي تحتوي على جزء جيد هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الجل في الطبق مع الحل التثبيت هلام (نفس التركيز من الميثانول TBE زائد 50-10 ٪ ، والايثانول). ترك الجل في المحلول لمدة 5-10 دقائق وتغيير المخزن مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجل مستعدة لمزيد من المعالجة باستخدام مجفف فراغ أو هلام المسح المباشر للهلام. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحدة الفرقة تعتمد على عدة عوامل. وينبغي أن حجم العينة لتحميل أشرطة حادة تكون صغيرة قدر الإمكان ، من الناحية المثالية أي بين 1-5 ميكرولتر. ومع ذلك ، يمكن تحميل ما يصل إلى 15 ميكرولتر التي تضمن القرار ما زالت مقبولة. حجم العينة أقل من النتائج أكثر وضوحا في العصابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعية الفرقة هو أيضا يعتمد على سمك هلام. أرق المواد الهلامية ، مثل 0،75 ملم تظهر نتائج أفضل من المواد الهلامية سميكة 1.5 ملم. </li><li style=";te...

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (page اليوريا)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PAGE اليوريا أو تغيير طبيعة الكهربائي اليوريا هلام بولي أكريلاميد توظف 6-8 اليوريا M ، الذي يبدل طبيعة الحمض النووي الريبي الثانوية أو هياكل ، ويستخدم لانفصالهما في المصفوفة هلام بولي أكريلاميد على أساس الوزن الجزيئي. شظايا بين 2-500 القواعد ، مع وجود اختلافات طول صغيرة مثل النوكليوتيدات واحد ، يمكن فصلها باستخدام هذا الأسلوب 1. الهجرة من العينة يعتمد على تركيز مادة الأكريلاميد المختار. نسبة مئوية أعلى من بولي أكريلاميد يحل شظايا الوزن الجزيئي أقل. مزيج من اليوريا ودرجات الحرارة من 45-55 درجة مئوية خلال تشغيل هلام يسمح لفصل الحمض النووي غير منظم أو جزيئات الحمض النووي الريبي. عموما مطلوب هذا الأسلوب لتحليل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل أو تنقية واحد أو شظايا الحمض النووي الريبي ، مثل [أليغنوكليوتيد] توليفها أو المسمى أو المنتجات من ردود الفعل الأنزيمية الانقسام. في هذه المقالة الفيديو نظهر كيفية إعداد وتشغيل بولي أكريلاميد اليوريا تغيير طبيعة المواد الهلامية. نصائح يتم تضمين التقنية ، بالإضافة إلى 1،2 البروتوكول الأصلي.

تغيير طبيعة استخدام هلام بولي أكريلاميد الكهربائي لفصل واحد اليوريا الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي أو تصل إلى حد 500 النيوكليوتيدات. اليوريا في تركيبة مع عينات يبدل طبيعة الحرارة وضيق واحد غير منظمة الهجرة داخل المصفوفة هلام وفقا لوزنها الجزيئي.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

يستخدم الفصل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد بوجود اليوريا (Urea PAGE) أو الفصل الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد الممسخ باليوريا تركيزاً يتراوح بين 6-8 مولار من اليوريا، والتي تعمل على مسخ البنى الثانوية للحمض النووي DNA أو RNA، وتُستخدم من أجل...

بشكل عام، يُستخدم هذا النوع من الهلام لفصل شظايا DNA أو RNA أحادية السلسلة، مثل قليلات النيوكليوتيد المصنعة أو الموسومة، أو نواتج تفاعلات الانقسام الإنزيمي. ويعتمد نطاق الفصل على تركيز البولي أميد، حيث يعمل اليوريا بالتزامن مع التسخين على تغيير طبيعة العينات، وبذلك تهاجر الجزيئات أحادية السلسلة داخل مصفوفة الهلام وفقاً لوزنها الجزيئي. يعرض هذا الفيديو عملية صب وتشغيل ومعالجة الهلام النموذجي.مرحباً، اسمي هاكي، من جامعة نانغ التكنولوجية. سأقوم في هذا العرض التوضيحي بشرح كيفية إجراء الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد الممسخ.استخدم ألواحاً زجاجية نظيفة وقم بتجميع شطيرة الهلام (gel Sandwich) وفقاً لوصف الشركة المصنعة. ثبت الهلام في غرفة صب الهلام القياسية. قم بتجميد الألواح الزجاجية للهلامات الكبيرة إذا كان الهلام يميل للالتصاق بالألواح الزجاجية.اختر حجم وسماكة الهلام وفقاً لمتطلبات الفصل الخاصة بك. قم بتحضير محلول الهلام وفقاً للبروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية.اختر تركيز البولي أميد الذي يناسب متطلبات الفصل الخاصة بك. إن استخدام نسبة أعلى من الأكريلاميد سيؤدي إلى فصل الشظايا ذات الوزن الجزيئي المنخفض بشكل أفضل. استخدم Alta pure UIA واخلطه مع الكمية المطلوبة من البولي أكريلاميد في بيكر أو زجاجة.أضف 10 من منظم XTBE إلى المحلول وأكمل الحجم المطلوب بالماء. سخن المحلول لمدة 20 ثانية في الميكروويف وامزجه بلطف حتى يذوب كل UIA تماماً. يمكنك تخزين المحلول إذا لزم الأمر في حال استخدام أحجام هلام أكبر.كرر خطوة التسخين في الميكروويف حتى يصبح المحلول دافئاً عند لمسه. تجنب تسخين المحلول بشكل مفرط. لا ترفع درجة الحرارة أكثر من اللازم لأن uria سيبدأ في التحلل بعد 60 درجة.يمكن الكشف عن درجة الحرارة المئوية من خلال رائحة الأمونيا. عندما يكون المحلول رائقاً ويبرد ليصل إلى درجة حرارة الغرفة تقريباً، أضف PS و tamid إلى محلول الهلام وامزجه برفق. إذا كان محلول الهلام ساخناً جداً، سيتلمر الهلام داخل الماصة.صُبَّ الهلام باستخدام ماصة سيرولوجية ومساعد ماصة بين اللوحين الزجاجيين. تجنب إدخال فقاعات الهواء. أدخل المشط بعناية.حاول تجنب حبس أي فقاعات هوائية واترك الهلام ليتبلمر لمدة 30 إلى 60 دقيقة. قم بفك الهلام من حامل الصب وتركيبه في غرفة المحلول المنظم العلوية. وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، ضع الهلام في غرفة المحلول المنظم السفلية واملأ الخزان السفلي بمحلول تشغيل الهلام المنظم، والذي يكون عادةً 0.5 إلى 1 XTBE.بتركيز مماثل لما تم استخدامه للهلام، املأ حجرة المحلول المنظم العلوية بمحلول تشغيل الهلام حتى حافة اللوح الزجاجي. قبل تحميل العينات، يجب تشغيل الهلام مسبقاً لمدة 30 دقيقة على الأقل لتسخينه وإزالة ما تبقى من اليوريا منه. يجب أن تتراوح درجة الحرارة المثالية بين 45 إلى 55 درجة مئوية، كما هو الحال في عملية تشغيل الهلام الفعلية.تجنب درجات الحرارة التي تتجاوز 60 °C لأن النطاقات قد تتعرض للتلطخ أو قد تتشقق الألواح الزجاجية. قم بإزالة المشط بعناية دون المساس بالحواف، واشطف الآبار من خلاله لإزالة اليوريا التي قد تكون تسربت إليها. استخدم رؤوس تحميل الجل وقم بسحب السائل ودفعه للأعلى والأسفل عدة مرات.لكل منها، قم بتثبيت غطاء نظام الهلام وتوصيل الكابلات بمصدر طاقة عالي الجهد. اختر واتات ثابتة (constant watts) للتشغيل المسبق، بنحو 15 إلى 20 watts لكل هلام. عند تشغيل مصدر الطاقة، تشير الفقاعات الهوائية إلى وجود توصيلية جيدة.في هذه الأثناء، قم بتحضير عيناتك، وبذلك أضف الكمية المناسبة من محول تحميل الجل (gel loading) بمقدار ضعفين إلى عينتك. عند انتهاء التشغيل المسبق (pre-run)، قم بإزالة الغطاء واغسل الجيب جيداً كما تم وصفه سابقاً، ومن المهم جداً شطف جيوب الجل بعناية لإزالة بقايا اليوريا، حيث ستشكل اليوريا طبقة كثيفة تعيق دخول العينة إلى الجل.قبل البدء مباشرة، قم بتسخين عينتك عن طريق تحضينها عند درجة حرارة 70 °C على الأقل لعدة دقائق. قم بنقل العينات بعناية من قاع الأنبوب.في بعض التطبيقات، قد يتداخل الصبغ مع العينة ويؤدي إلى ظهور حزم منتشرة، أو قد يظهر الصبغ إشارة فلورية. في هذه الحالة، يكون من المفيد إزالة صبغ واحد أو جميع الأصباغ وتحميل المنظم الذي يحتوي على الصبغ القياسي. وفي بئر فارغ، يتم وضع معيار الحجم؛ وتتراوح كمية العينة التي يجب تحميلها للحصول على حزم حادة مثاليًا بين 1 إلى 5 µL، ولكن يمكنك أيضًا تحميل أحجام أعلى تصل إلى 15 µL.يؤدي استخدام حجم أقل من العينة إلى الحصول على حزم أكثر وضوحاً. تجنب إدخال فقاعات الهواء واترك العينة تغوص في الجيب ببطء ليتشكل طبقة موحدة. في حال استخدام وسم فلوري، قم بتغليف نظام الهلام بورق ألومنيوم لمنع التعرض للضوء، والذي قد يتسبب في حدوث التبييض الضوئي لعنتك.قم بتركيب الغطاء وتشغيل وحدة إمداد الطاقة. قم بتشغيل الهلام حتى تصل جبهة DIA إلى الطرف السفلي من الهلام. وتعتمد مدة التشغيل على نسبة الأكريلاميد.يمكنك اختيار القوة الأيونية للمحلول المنظم، وسُمك الهلام وطوله. قد تستغرق عملية الفصل من ساعة واحدة إلى عدة ساعات. راقب هجرة المؤشرات لتحديد مدة الفصل الكهربائي.استخدم وات ثابت وراقب درجة الحرارة على الهلام. يمكن أن يساعد مقياس حرارة الهلام في مراقبة درجة الحرارة الصحيحة أثناء التشغيل، أو ارجع إلى دليل جهاز الهلام عند وصول الجبهة إلى النهاية. قم بإيقاف تشغيل وحدة إمداد الطاقة وارفع غطاء جهاز الهلام.بعد ذلك، أخرج شطيرة الهلام من حجرة المحلول المنظم السفلية. قم بتفريغ المحلول المنظم من حجرة المحلول المنظم العلوية. املأ وعاءً بمحلول تثبيت الهلام.يجب أن يكون لهذا المحلول نفس تركيز TB وبنسبة تتراوح بين 5 إلى 10% من الميثانول وحمض الأسيتيك. قم بإزالة شطيرة الهلام (gel sandwich) من الجهاز وفك المشابك. اسحب الفواصل وقم بتفكيك الأطباق الزجاجية بعناية باستخدام ملعقة مسطحة (spatula). إذا لزم الأمر، قم بقص جزء الهلام الذي يحتوي على بئر أو جزء الهلام السفلي الفارغ، وتخلص من قطع الهلام غير الضرورية مثل المسارات التي تحتوي على الصبغة.بالنسبة للعينات الفلورية، افصل الهلام بعناية عن اللوح الزجاجي وانقله إلى وعاء مملوء بمحلول تثبيت الهلام. اترك الهلام في المحلول لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق وقم بتغيير المنظم مرتين. قم بهز الوعاء برفق لغسل اليوريا من الهلام، أو ضع الهلام في محلول الصبغ بناءً على تطبيقك.تعتمد جودة الهلام أيضاً على سمكه. وتُظهر الهلامات الأكثر رقة مثل تلك التي يبلغ سمكها 0.75 millimeter نتائج أفضل من الهلامات التي يبلغ سمكها 1.5 millimeter، ولكن التعامل معها يكون أكثر صعوبة. وتعتمد حدة النطاقات على عدة عوامل.يمكن أن يساعد استخدام جهد كهربائي منخفض في بداية التشغيل في الحصول على حزم أكثر وضوحاً، كما يضمن دخول العينة إلى جبهة الهلام بسلاسة، مما يمنع انهيار جيوب الهلام الناتج عن الجهد الكهربائي العالي. ويمكن أن يحقق استخدام هلام تكديس قصير وبنسبة منخفضة من الأكريلاميد تأثيرًا مماثلاً في حدة الحزم، كما يساعد تضمين 10% Glycerol أثناء تحميل الهلام في غوص العينة داخل البئر. يُفضل تطبيق محلول التحميل على الجيوب الفارغة بسهولة للحفاظ على ظروف متساوية أثناء التشغيل.عندما يكون الهلام في محلول التثبيت، يمكنك تجفيفه باستخدام مجفف هلام مفرغ من الهواء لإجراء تصوير إضافي، أو مسحه ضوئياً بشكل مباشر اعتماداً على صبغة التوسيم أو الصبغة المستخدمة. هذه الصفحة مفيدة لتحليل أو عزل عينات DNA أو RNA أحادية السلسلة. يمكن تخزين الهلام في درجة حرارة الغرفة.لذلك، قم بلف الهلام في منشفة ورقية ونقعه بالماء أو بمحلول التشغيل (running buffer). ضع الهلام الملفوف والمبلل في كيس بلاستيكي محكم الإغلاق واستخدمه في غضون 48 ساعة. ومن المشكلات التي تُلاحظ غالباً ظاهرة "ابتسامة الهلام" (gel smiling).يعود ذلك إلى التوزيع غير المتساوي للحرارة عبر الهلام. وإذا لم يكن الهلام محاطاً بمحلول منظم، فإن تثبيت لوحة معدنية يمكن أن يحسن من جودة الهلام. مرحباً، أنا هاي كاسام.أنا من جامعة نانيانغ التكنولوجية. لقد شرحتُ لكم كيفية إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المزيل للطبيعة. أراكم في المرة القادمة.

denaturing-urea-polyacrylamide-gel-electrophoresis-urea-page

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، وصفنا توصيف المجمعات multiprotein (البلدان المتوسطية الشريكة) من الأزرق الأصلي بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (BN - PAGE). في البعد الأول ، يتم فصل lysates الخلوية مدال بواسطة PAGE - BN لتحديد البلدان المتوسطية الشريكة الفردية. في البعد الثاني SDS - PAGE ، وتنقسم البلدان المتوسطية الشريكة من الاهتمام لتحليل من قبل ناخبيهم immunoblotting.

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

يوضح هذا الفيديو تقنية فصل قائمة على بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة البروتينات. تساعد هذه التقنية في التحديد الأولي للبروتينات بناء على أوزانها الجزيئية.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

في هذا الفيديو ، نوضح الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة لفصل أنواع الحمض النووي الريبي الفسفوري عن نظيراتها غير الفسفرية. يتم تصنيف أنواع الحمض النووي الريبي بالفلورسنت للكشف بالليزر على الجل.

تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد اليوريا لتحليل الحمض النووي الريبي: تقنية لفصل قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الفسفرية المسمى بالفلورسنت عن نظيراتها غير الفسفرية

&lt; p class = "jove_content"&gt;في هذا الفيديو ، نوضح طريقة الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد التي تفصل البروتينات الفردية عن خليط بروتيني معقد يتم الحصول عليه من أنسجة الورم الورمي الحميد النخامي البشري غير الوظيفي (NFPA). يتم فصل البروتينات بناء على شحنتها الكهربائية في البعد الأول ويتم فصلها بشكل أكبر بناء على الأوزان الجزيئية في البعد الثاني.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني يجمع على الحمض النووي الريبي السلائف الذي يمتد إلى ما بعد نهاية 3 'من مرنا ناضجة. يتم إنشاء نهاية الحمض النووي الريبي ناضجة cotranscriptionally، في موقع تمليها تسلسل الحمض النووي الريبي، عن طريق النشاط نوكلياز داخلية للمجمع الانقسام. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة لدراسة تفاعلات الانقسام في المختبر.

تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 &#39;نهاية الشق من قبل مرنا ركائز<em&gt; في المختبر</em

تصف هذه المقالة بروتوكولا بسيطا وسريعا لتقييم حالة قلة القلة لبروتين GTPase MxA الشبيه بالدينامين من محللات الخلايا البشرية باستخدام مزيج من PAGE غير المتمسخ مع تحليل اللطخة الغربية.

توصيف مجمعات متعدد فرعية البروتين من MXA الإنسان عن طريق عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام الكهربائي

يستخدم هذا البروتوكول كل من coexpression الوحيدات وحدة فرعية postlysis خلط لإجراء فحص أكثر دقة التجمع proteasome والمؤتلف.

دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

هنا نقدم طريقة حساسة وسريعة، والتمييز بعد جل تلطيخ لصورة RNAs الموسومة مع الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، وذلك باستخدام إما الأصلي أو التشويه البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (صفحة) المواد الهلامية. بعد تشغيل المواد الهلامية القياسية الصفحة، يمكن أن تكون ملطخة بسهولة RNA المانجو مع TO1-البيوتين ومن ثم تحليلها باستخدام القراء الفلورسنت المتاحة عادة.

التصور الفلورسنت من الحمض النووي الريبي المانجو الموسومة في المواد الهلامية البولي أكريلاميد عن طريق طريقة بوستينينغ

تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

هذا الفيديو يوضح بروتوكول لفحص الأوعية الدموية في المختبر الذي يلخص مراحل عديدة من الأوعية الدموية. وتظهر -- الوقت الفاصل بين الصور التي تنتشر من وتشكيل التجويف ، والمتفرعة مفاغرة -- الملامح الرئيسية الأوعية الدموية.

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

تعلم تقنية الترحيل الكهربائي لبولي أكريلاميد اليوريا الكاشفة لفصل الحمض النووي أحادي السلسلة أو الرنا في الأحياء الجزيئية. هذه الطريقة تتيح تحليل الأوليغونيوكليوتيدات المُصنّعة بدقة عالية.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

استكشف المزيد من الفيديوهات