في التصوير المجراة من الطبقات العميقة القشرية باستخدام Microprism
أغسطس 27, 2009
الحق الزاوية microprisms إدراجها في القشرة المخية الحديثة الماوس يسمح للتصوير عميق للطبقات قشرية متعددة مع وجهة النظر التي توجد عادة في شريحة. واحد ملليمتر microprisms العرض حقل من رأي واسعة (900 ميكرون ~) والقرارات المكانية كافية لحل شجيري العمود الفقري. نظهر طبقة V التصوير العصبية والأوعية الدموية التصوير باستخدام microprisms القشرة المخية الحديثة.
تتمتع تقنيات الفحص المجهري الفلوري بقدرة محدودة على تصوير الهياكل العميقة داخل الأنسجة ، خاصة في المواد شديدة الضوء مثل أنسجة المخ. حتى في حالة الفحص المجهري للفوتون ، قد يكون من الصعب جدا إنتاج صور عالية الجودة في الجسم الحي للهياكل العصبية التي يزيد أعمق عن 500 ميكرون من سطح القشرة المخرجية الحديثة. هنا ، يشير الخط الأخضر إلى عمق 500 ميكرون.
بشكل عام ، الطبقات القشرية الحديثة أربعة وخمس وست أكبر من 500 ميكرون من السطح. سنوضح كيف يمكن للمنشور الزجاجي الدقيق الذي يتم إدخاله في القشرة المخية الحديثة أن ينقل الضوء إلى وخارج الطبقات القشرية السطحية والعميقة. باستخدام هذه التقنية في الفأر ، من الممكن الحصول على مجال رؤية بحجم ملليمتر واحد وتصور جميع الطبقات القشرية الست في وقت واحد من منظور التصوير ، وعادة ما توجد فقط في أنسجة المخ المقطعة.
توفر المنشورات الدقيقة مجال رؤية واسعا قادرا على تصور أجسام الخلايا شبه المعدنية من الطبقة الخامسة مع التشعبات القمية الطويلة والشبكة المعقدة للأوعية الدموية في القشرة المخية الحديثة ، كل ذلك مع الحفاظ على الدقة المكانية القادرة على حل العمود الفقري المتغصني وتدفق خلايا الدم الحمراء عبر الشعيرات الدموية الدقيقة. اسمي توماس شيا وأنا طالب دراسات عليا في مختبر البروفيسور مايكل ليفين في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة ييل. سيكون البروتوكول الذي سنناقشه في هذا الفيديو حول كيفية استخدام مناشير زجاجية دقيقة ذات زاوية قائمة ملليمترا واحدا لإنشاء صور مضان للهياكل بعمق ملليمتر واحد في القشرة المخية الحديثة للفأر.
المنشورات الدقيقة التي نستخدمها عبارة عن مناشير بزاوية قائمة ملليمتر واحد مصنوعة من زجاج BK السبعة الذي تم شراؤه من شركة Opto Sigma Corporation. يتم التعامل مع المنشورات الدقيقة باستخدام الملقط كلما أمكن ذلك. يتم طلاء وتر المنشور الصغير بالفضة المحسنة لتوفير انعكاس أكبر من 97٪ من 400 إلى 2000 نانومتر.
يوفر هذا انعكاسا داخليا لكل من ضوء إثارة الليزر والتألق المقبول. نحن نستخدم مجهر فوتونين مصمم خصيصا قادرا على تصوير الصغيرة. يتم وضع المتصل بجهاز تجسيمي على مرحلة آلية ثلاثية المحاور.
يتم توصيل المجهر بجهاز كمبيوتر يعمل بنظام Windows يقوم بتشغيل صورة المسح الضوئي. صورة المسح الضوئي للبرامج هي برنامج للحصول على الصور مكتوب في MATLAB بواسطة Polo Gudo ، وآخرون. بالنسبة لتصوير المنشور الجزئي ، نقوم بجمع الصور بدقة 10 24 × 10 24 أو خمسة 12 × خمسة 12 بكسل.
بالإضافة إلى ذلك ، نقوم عادة بالمسح الضوئي بمقدار مللي ثانية لكل سطر أو أربعة مللي ثانية لكل سطر. أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول هو نوع أهداف المجهر المستخدمة جنبا إلى جنب مع المنشورات الدقيقة. يتم استخدام نوعين من الأهداف في التجارب.
الهدف الموجود على اليسار هو هدف هوائي منخفض الفتحة العددية لتصوير مجالات الرؤية الواسعة ، في هذه الحالة ، هدف أربعة × 0.28 NA Olympus. الهدف الموجود على اليمين هو هدف هوائي NA بارتفاع 40 × 0.60 مع طوق تصحيح زجاجي قادر على تقليل الانحرافات الكروية الناجمة عن صفر إلى ملليمترين من الزجاج. من أجل تحضير الفأر للجراحة وإدخال المنشور الصغير ، فإن الخطوة الأولى هي تخدير بشكل صحيح إلى مستوى مناسب للإجراءات الجراحية.
أولا ، يتم تسجيل وزن بناء على الجرعة المحددة. يتم سحب حجم مناسب من كوكتيل الكيتامين والزيلازين في حقنة. يتم توصيل أدوية التخدير من خلال حقن IP باستخدام إبرة قياس 28.
بمجرد أن يكون الفأر في مستوى تخدير مناسب للعمليات الجراحية ، يتم حلق غالبية الشعر على رأس باستخدام رعشة برقم 40 شفرة. ثم يتم تطبيق nare على الشعر المتبقي على الرأس للمساعدة في إنشاء سطح خال من الشعر الذي قد يعيق طريق المنشور الصغير. أثناء التصوير ، بعد خمس دقائق ، يتم تنظيف NA باستخدام مسحة قطنية ، يتم وضع المخدر بشكل صحيح في جهاز تجسيمي للفأر.
أثناء العمليات الجراحية وجلسات التصوير ، يتم الاحتفاظ بالحيوان على وسادة تسخين مملوءة بالماء عند 36 درجة مئوية. مع تثبيت رأس بشكل صحيح في مكانه ، يتم إجراء شق نظيف واحد أسفل الخط الإنسي للجمجمة. لفصل الجلد ، يتم وضع كمية صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ على قطعة قطن وتوضع على الجمجمة لإزالة الأغشية بين الجمجمة والجلد.
يساعد بيروكسيد الهيدروجين أيضا في الكشف عن BMA ، وهو معلم رئيسي في معرفة مكان إجراء حج القحف وإدخال المنشور الدقيق. قبل بدء حج القحف ، يتم ضبط قضبان الأذن وشريط العض بشكل صحيح لإمالة الجمجمة المكشوفة بحيث تكون مستوية بشكل أساسي مع الطاولة. هذا يوفر منصة أفضل لبضع القحف.
يتم توصيل لدغ أسنان صغير بأداة Dremel لبضع القحف. قمنا بضبط السرعة على حوالي 7,000 إلى 10,000 دورة في الدقيقة. يتم تقشير نتوء الأسنان على طول الجمجمة حتى يتم إنشاء أخدود مربع في العظم.
يبلغ طول جوانب المربع حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات وتوسيطها. 1.5 ملم كودلي ، ويستمر ريما جانبي واحد في ترقق العظم حتى يتم عمل فتحة صغيرة من خلال الجمجمة. يمكن لزوج من الملقط رفع السديلة العظمية.
يجب إزالة الجافية قبل إدخال المنشور الدقيق في القشرة. من الأفضل السيطرة على النزيف عن طريق ترك الدم يتخثر على السطح لعدة دقائق. بعد ذلك ، تتم إزالة الدم المتخثر باستخدام إسفنجة جراحية للمساعدة في محاذاة المنشور مع القشرة.
يصطف الوجه الرأسي للمنشور الصغير بالتوازي مع المقابض الموجودة على الملقط. مع تثبيت المنشور بشكل صحيح ، يتم إدخال المنشور الدقيق بالكامل حتى يتدفق الجزء العلوي من المنشور مع سطح القشرة الحديثة. هنا يمكننا أن نرى المنشور يستريح في القشرة المخية الحديثة.
عند إدخاله بشكل صحيح ، يجب أن يظل المنشور الصغير في الموضع المناسب. أي نزيف ينتج عن ذلك يكون ضئيلا ويمكن امتصاصه باستخدام إسفنجة جراحية صغيرة. بمجرد وضع المنشور في مكانه ، يكون جاهزا للتصوير مع.
تحت هدف التكبير المنخفض ، يمكن للمرء أن يرى المسح النقطي بالليزر فوق المنشور الصغير على سطح الدماغ. فيما يلي بعض الأمثلة التمثيلية للصور المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأصفر. في الطبقة الخامسة من الخلايا العصبية القشرية التي تستخدم مناشير دقيقة ، يمكن للمرء أن يرى مجموعة من أجسام الخلايا البارافلزية الكبيرة في الطبقة الخامسة ، ما يقرب من ملليمتر واحد تحت سطح القشرة.
كما تظهر التشعبات القمية التي تمتد عبر جميع الطبقات السطحية قبل أن تتباعد إلى خصلات باستخدام هدف فتحة عددية عالية مع طوق تصحيح الزجاج ، ومن الممكن حل العمود الفقري الشجيري في هذه الحالة. على التشعبات القمية للخلايا العصبية شبه المعدنية من الطبقة الخامسة ، فإن العمود الفقري المتغصني عبارة عن هياكل فرعية من الميكرون ويتم تحديد العديد منها في الصورة باستخدام رؤوس الأسهم الصفراء. يمكن للمرء أيضا تسمية الأوعية الدموية القشرية بصبغة فلورية ، مثل فلورسين ديكستران باستخدام تقنيات حقن وريد الذيل المعمول بها.
باستخدام هذه التقنية ، يمكن للمرء أن يرى الأوعية ذات العيار الأكبر من الطبقات العميقة تمتد نحو PIA وتتفرع لتشكيل شبكة من الشعيرات الدموية الدقيقة. من الأفضل تقدير هذه الشبكة الحساسة من الشعيرات الدموية الدقيقة في القشرة المخية الحديثة باستخدام هدف فتحة عددية عالية. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن قياس سرعة خلايا الدم الحمراء وتدفقها من الشعيرات الدموية القشرية الحديثة العميقة عن طريق مسح الخط.
يشير الخط الأحمر إلى نمط مسح الخط على الصورة الشعرية من خلال المنشور الصغير. نظرا لأن خلايا الدم الحمراء لا تمتص صبغة الفلورسنت ، فإنها ستظهر على شكل خطوط داكنة. الصورة الموجودة في الأسفل هي نتيجة مسح خطي ببعد مكاني في أحد AEs وبعد زمني في الآخر.
يمكنل AEs من هذا حساب تدفق وسرعة خلايا الدم الحمراء عبر الشعيرات الدموية. بعد استخدام المنشور الدقيق في ما ، يمكن إعادة استخدامه عدة مرات. ومع ذلك ، فإنه يحتاج إلى التنظيف بشكل صحيح لإزالة أي مادة بيولوجية متبقية.
يمكن تحقيق ذلك عن طريق غمس المنشور في كمية صغيرة من حمض الهيدروكلوريك ، متبوعا بالغمس في الميثانول. يمكن بعد ذلك لف المنشور الدقيق النظيف بورق العدسة حتى استخدام الميزة. بهذا يختتم بروتوكولنا بشأن استخدام المنشورات الدقيقة للتصوير القشري في الجسم الحي في الفئران.
يعد استخدام المنشورات الدقيقة في تجربة التصوير أمرا بسيطا نسبيا ويوفر العديد من المزايا عندما يتعلق الأمر بالدراسات في الجسم الحي على القشرة المخية الحديثة. نأمل أن تكون قد وجدت أن هذه تقنية مثيرة للاهتمام ويمكنك استخدامها في مختبرك في المستقبل. شكرا للمشاهدة ونتمنى لك التوفيق.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة نهجًا جديدًا لتصوير عميق للقشرة الجديدة للفأر باستخدام المنشورات الدقيقة بزاوية قائمة. تُمكّن هذه المنشورات الدقيقة من تصور طبقات قشرية متعددة مع مجال رؤية واسع ودقة مكانية كافية لتحديد العمود الفقري الكثيف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تقنيات التصوير
- بنية القشرة الجديدة
الخلفية
- تمتلك مجهريات الفلورة قيودًا في تصوير هياكل الدماغ العميقة.
- تكافح مجهريات الفوتون المزدوج لإنتاج صور عالية الجودة لما هو أبعد من 500 ميكرون.
- عادةً ما تكون طبقات القشرة الجديدة أربع وخمس وستة أعمق من هذا العتبة.
- يمكن للمنشورات الدقيقة تسهيل تصوير هذه الطبقات الأعمق.
هدف الدراسة
- لإظهار استخدام المنشورات الدقيقة لتصوير الطبقات القشرية العميقة.
- لتصور جميع الطبقات القشرية الست في وقت واحد.
- لتوفير منظور موجود عادة فقط في أنسجة الدماغ المقطعة.
الطرق المستخدمة
- إدخال منشورات زجاجية دقيقة بطول ملليمتر واحد في القشرة الجديدة.
- مجهريات الفلورة للتصوير.
- تقنيات التصوير في الجسم الحي في نموذج الفأر.
- تقييم مجال الرؤية والدقة المكانية.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لخلايا العصبون في الطبقة الخامسة والأوعية الدموية في القشرة الجديدة.
- تم تحقيق مجال رؤية واسع بنحو 900 ميكرومتر.
- دقة كافية لملاحظة العمود الفقري الكثيف.
- تصور جميع الطبقات القشرية الست في وقت واحد.
الاستنتاجات
- توفر المنشورات الدقيقة أداة قيمة للتصوير العميق في علم الأعصاب.
- تعزز هذه التقنية القدرة على دراسة هياكل القشرة الجديدة.
- تطبيقات محتملة في فهم وظيفة الدماغ وعلم الأمراض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Deep cortical imaging using microprisms enables simultaneous visualization of multiple neocortical layers in vivo, overcoming traditional depth limitations of fluorescence microscopy. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in neurobiology-focused discovery pipelines. The approach enhances predictive confidence for early-stage CNS portfolio decisions by providing high-resolution, quantitative data from intact neural circuits.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of deep neural circuits and cellular architecture in live tissue.
- Supports functional target validation by visualizing neuronal morphology and connectivity across cortical layers.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing real-time observation of neuronal and vascular responses.
- Improves predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated biological system for quantitative imaging-based assays in deep brain regions.
- Enables reproducible measurement of dendritic spine morphology and vascular dynamics.
- Supports assay standardization by delivering consistent, high-resolution outputs across experiments.
- Prepares platforms for scalable compound evaluation targeting deep cortical structures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical imaging outputs with disease-relevant neural circuits and biomarkers.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo assessment of neuronal and vascular function.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for CNS therapeutic programs.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This microprism-based imaging method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-resolution, quantitative analysis of deep cortical layers in vivo.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in intact neural circuits.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation in deep brain regions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of dendritic spine density, vascular architecture, and red blood cell dynamics.
- Translational Research: Connects in vivo imaging data to disease-relevant biomarkers and functional endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse CNS research and drug discovery applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes deep tissue imaging workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency in CNS portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced in vivo imaging and surgical techniques.
- Demands access to custom two-photon microscopy and precision microprism handling tools.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different animal models or cortical regions.
- Potential limitations include surgical complexity and the need for rigorous cleaning and reuse protocols.
