والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين
أغسطس 21, 2009
نحن تصف طريقة جديدة lipidomics كمي لتحديد الأنواع الدهنية عديدة في الخميرة باستخدام المسح المسح الشامل التأين مطياف electrospray (ESI / MS). هذا الأسلوب يتجاوز حاليا الأساليب المتاحة لتحديد وتقدير الدهون في القدرة على حل مختلف أشكال الجزيئية من الدهون ، والحساسية ، والسرعة.
يسمح هذا البروتوكول للمرء بتحليل المكونات الرئيسية لدهون الخميرة بسرعة. يبدأ بحصاد خلايا الخميرة وغسلها. توضع الخلايا المغسولة في مزيج من الكلوروفورم أو اثنين من الميثانول وتوضع بخرز زجاجي.
إضافة الكلوروفورم والماء يفصل بين المرحلتين. يتم جمع المرحلة العضوية وتجفيفها ثم إذابة الطبقة الدهنية في الكلوروفورم للتخزين قبل التحليل الطيفي الكتلي. يتم تخفيف الدهون المستخرجة في الكلوروفورم والميثانول مع هيدروكسيد الأمونيوم ويضاف مزيج من المعايير الداخلية.
يمكن الآن حقن محلول الدهون مباشرة في مطياف الكتلة. مرحبا ، أنا سيمون بورك من مختبر فلاديمير تكو في قسم الأحياء بجامعة كونكورديا. سأريكم اليوم طريقة لقياس دهون الخميرة باستخدام التحليل الطيفي الكتلي.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التغيرات في دهون الخميرة في ظل ظروف نمو مختلفة. لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بتعليق كريات الخميرة المجمدة المعدة مسبقا في 1.6 مل من الثلج والماء المقطر البارد ونقل 1.6 مل من تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الزجاجية عالية السرعة.
لاحظ أنه خلال هذا الإجراء ، تتم جميع عمليات التلاعب بالدهون المستخرجة باستخدام ماصات زجاجية أو محاقن. نظرا لأن البلاستيك سيخلق إشارة خلفية كبيرة ، إذا لامست الكلوروفورم ، فابدأ في استخراج الدهون عن طريق إضافة ستة ملليلتر من مزيج الميثانول الكلوروفورم بنسبة واحد إلى اثنين و 0.8 مل من الخرز الزجاجي المقاس في أنبوب إينور إلى تعليق الخلية. الأحجام الدقيقة ليست حرجة طالما يتم الاحتفاظ بنسبة واحد إلى اثنين إلى 0.8 للكلوروفورم والميثانول والخميرة المعلقة في الماء. دوار.
يختلط تعليق الخلية والخرز الزجاجي مرتين لمدة دقيقة واحدة في كل مرة ، واستمر بإضافة ملليلترين من الكلوروفورم والخلط برفق ثم يحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الخلط العرضي. بعد خمس دقائق من الحضانة ، أضيفي ملليلترين من الماء المقطر واخلطيهم برفق. ثم مرة أخرى ، احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الخلط من حين لآخر.
هنا أيضا ، من المهم الحفاظ على نسبة اثنين إلى اثنين إلى 1.8 للكلوروفورم والميثانول والماء بدلا من حجم معين. عند اكتمال الحضانة الثانية. جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 جيجابايت في درجة حرارة الغرفة ، اجمع كل المادة الطافية من هذا الاستخراج الأول في أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد عالي السرعة وأضف 3.2 مل من الكلوروفورم إلى كريات الخلية المتبقية لاستخراج الدهون الثانية.
دوامة كريات الخلية مع الكلوروفورم المضاف مرتين لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3000 جيجابايت في درجة حرارة الغرفة ، أضف المادة الطافية من هذا الاستخراج الثاني إلى المادة الطافية التي تم جمعها بعد الاستخراج الأول. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للطافية التي تم جمعها لمدة خمس دقائق.
عند 3000 جرام في درجة حرارة الغرفة ، يتم الآن إذابة الدهون المستخرجة في المرحلة العضوية السفلية. تخلص من المرحلة المائية العلوية وانقل المرحلة السفلية إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي جديد عالي السرعة. لإنتاج أطياف أنظف على جهاز الطرد المركزي لمطياف الكتلة ، المرحلة العضوية لمدة خمس دقائق عند 3000 جي ثانية في درجة حرارة الغرفة ونقل المادة الطافية بأكملها إلى قارورة زجاجية.
جفف الدهون الذائبة تحت النيتروجين ، وقم بإذابة الطبقة الدهنية المجففة في 500 ميكرولتر من الكلوروفورم وتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لتحليل العينات عن طريق قياس الطيف الكتلي. ابدأ بإعداد مزيج قياسي من الدهون في الكلوروفورم كما هو موضح في الجدول الأول الموجود في البروتوكول المكتوب المصاحب. يمثل كل دهون فئة مختلفة.
يمكن تخزين هذا المحلول عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامه لاحقا قبل حقن الدهون المستخرجة في مطياف الكتلة. تم الجمع بين 10 ميكرولتر من العينة مع 10 ميكرولتر من المزيج القياسي للدهون. لاحظ أنه يمكن تغيير النسبة القياسية إلى العينة حسب الحاجة.
قم بحل العينة ومزيج الدهون القياسية باستخدام مطياف كتلة صغيرة من Q إلى F ، مزود بمصدر رش كهربائي نانوي يعمل بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة. الإعدادات مفصلة في الجدول الثاني من البروتوكول المكتوب المصاحب. على الرغم من أن استخدام الدقة العالية لمطياف الكتلة من Q إلى F مفيد ، إلا أنه ليس مطلبا إلزاميا.
تختلف معلمات الأداة الدقيقة بين مطياف الكتلة. بعد الحصول على البيانات ، يتم تنعيم أطياف الكتلة ، وطرح الخلفية وتوسيط القمم. أخيرا ، قم بتصدير قائمة الذروة إلى Excel.
ثم تطبيع قمم كل زجاج دهني إلى معاييرها الداخلية. اعتمادا على التطبيق ، قد يكون من الضروري إجراء مزيد من المعالجة اللاحقة مثل النظائر وإزالة الالتفاف. تسمح هذه الطريقة بالتحديد السريع المتعمق للمكونات الرئيسية لدهون الخميرة.
لقد أبرزنا هنا دهون واحدة ، والتي تم إضفاء الطابع de المعقدة وتطبيعها وفقا لمعيارها الداخلي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل دهون الخميرة وكيفية تحديد دهون الخميرة باستخدام التحليل الطيفي لكتلة التأين الكهربائي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب استخدام البلاستيك والحفاظ على عينتك في النطاق الخطي للتركيزات.
هذه الطريقة مرنة للغاية ويمكن تغييرها في العديد من المجلدات حسب الحاجة. بروتوكول الاستخراج هذا مناسب أيضا لطرق أخرى لتحليل الدهون ، مثل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة والتحليل الطيفي الكتلي متعدد الأبعاد. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة طريقة كمية جديدة لتحليل الدهون لتحديد أنواع مختلفة من الدهون في الخميرة باستخدام قياس الطيف الكتلي بتقنية التأين بالرش الكهربائي (ESI/MS). تعمل هذه الطريقة على تحسين التقنيات الحالية بشكل كبير من حيث تحديد الدهون وقياسها وحساسيتها وسرعتها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تحليل الدهون
- قياس الطيف الكتلي
- بيولوجيا الخميرة
الخلفية
- تحليل الدهون ضروري لفهم وظائف الخلايا.
- الطرق التقليدية لتحليل الدهون لها قيود في الحساسية والدقة.
- يوفر التأين بالرش الكهربائي وقياس الطيف الكتلي بديلاً واعدة.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين تحديد الدهون وقياسها في الخميرة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة سريعة وفعالة لتحليل الدهون.
- تحسين دقة تحديد أنواع الدهون.
- زيادة حساسية قياس الدهون.
الطرق المستخدمة
- حصاد وغسل خلايا الخميرة.
- تفتيت الخلايا باستخدام كرات زجاجية في خليط الكلوروفورم والميثانول.
- فصل مراحل الدهون باستخدام الكلوروفورم والماء.
- تحضير عينات الدهون لتحليلها بقياس الطيف الكتلي.
النتائج الرئيسية
- تتيح الطريقة الجديدة تحديد العديد من أنواع الدهون.
- تظهر حساسية أعلى مقارنة بالتقنيات الحالية.
- تم تعزيز سرعة التحليل بشكل كبير.
الاستنتاجات
- تمثل هذه الطريقة تقدمًا كبيرًا في تحليل الدهون.
- يمكن تطبيقها في مجالات بحثية مختلفة تتضمن تحليل الدهون.
- قد توسع الدراسات المستقبلية تطبيقها على كائنات أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative lipidomics using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) enables rapid, high-sensitivity profiling of yeast lipidomes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This workflow accelerates lipid identification and quantification, providing robust data for pathway interrogation and functional studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking scalable, reproducible lipidomic analyses to inform discovery-stage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive profiling of lipid species to clarify metabolic pathways.
- Supports functional validation of lipid-related targets in genetically tractable yeast models.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying lipid changes under different conditions.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible lipid quantification suitable for assay standardization.
- Reduces sample preparation time by eliminating chromatographic separation steps.
- Supports high-throughput screening readiness with rapid sample analysis.
- Enables reliable comparison of compound effects on lipid profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant lipidomic studies by enabling organelle-specific lipid analysis.
- Provides continuity from yeast model findings to higher eukaryotic systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying lipid biomarkers.
- Enhances predictive confidence in translational lipid biology research.
Pipeline & Workflow Integration
This ESI/MS lipidomics method fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via quantitative lipid profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible lipid measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized, quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when extending findings beyond yeast.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to various lipidomic research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, standardized sample processing and analysis.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of lipid-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and lipid extraction protocols.
- Needs access to high-resolution mass spectrometry instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of sample handling to ensure reproducibility.
- Adaptable to other model systems with protocol optimization.
- Plasticware must be avoided to prevent background signal interference.
