تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

مرحبا ، أنا هوب كامبل من أخصائي قياس التدفق الخلوي من معهد أبحاث الدم في مركز الدم في ويسكونسن. مرحبا ، أنا STR Baso ، طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور بوني ديتر. أنا أيضا في معهد أبحاث الدم التابع لمركز الدم في ولاية ويسكونسن.

سنقوم اليوم بإجراء لعزل الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة وظيفة الخلايا الليمفاوية ومجموعات الخلايا النخاعية. هيا بنا نبدأ.

في هذا الإجراء ، سيتم تنقية أربع خلايا تائية B و CD من خلايا الفئران. يجب حساب عدد البداية من الخلايا المستهدفة بناء على عدد الخلايا المطلوبة ومعدل استرداد الجهاز باستخدام هذه الطريقة. معدل الاسترداد النموذجي لأربع خلايا تائية B و CD هو 85 إلى 90٪ ، ويبلغ عدد الخلايا الأولية SP حوالي 60 إلى 70٪ خلايا B و 20 إلى 30٪ خلايا T.

وبالتالي ، إذا بدأت ب 100 في 10 إلى الخلايا الست ، فستتمكن من استعادة 50 إلى 60 مليون خلية بائية و 20 إلى 30 مليون خلية تائية قبل بدء الحقائق. يجب وضع الحلول والكواشف اللازمة للبروتوكول على الجليد. وتشمل هذه المخزن المؤقت للتلطيخ الذي يتكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 3٪ من معلق مصل عجل الجنين يتكون من 25 مللي مولار HEPs محضرة في محلول الملح المتوازن من هانك أو HBSS يحتوي على 3٪ مصل عجل الجنين A 25 مللي مولار محلول هيب ب المحضر في مصل العجل الجنيني ، والأجسام المضادة ، والخرز التعويضي.

يتطلب هذا البروتوكول أيضا الإمدادات والكواشف التالية. أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر ، أنابيب تدفق البوليسترين أو البولي بروبيلين 12 × 75 ملليمتر. يجب أيضا تحضير مصفاة خلية النايلون باللون الأزرق ، وأنابيب جمع فرز مقياس الخلوي الدموي في وقت مبكر للقيام بذلك.

عند 300 ميكرولتر من محلول FCS لتدفق الأنابيب أو ملليلتر واحد من محلول HEPs FFC S إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا. يجب وضعها على الجليد حتى تبدأ عملية التجميع. ابدأ بتوليد معلق خلية واحدة لمجموعة الخلايا المطلوبة.

إذا تم عزل الخلايا ، استزراع استخدام هذا الإجراء. يجب إجراء تحضير الخلية بالكامل في غطاء زراعة الأنسجة. باستخدام تقنية معقمة ، اغسل الخلايا بمجرد إضافة محلول تلطيخ مثلج بارد وتعليق الخلايا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.

ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة سبع إلى ثماني دقائق عند حوالي 250 درجة مئوية أربع درجات مئوية. قد تختلف ظروف الغسيل باختلاف نوع الخلية وتركيزها. بالنسبة للخلايا ، اغسل ما يصل إلى 200 مرة 10 إلى الخلايا الست مع 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط حتى تظل حبيبات الخلية سليمة. ثم أعد تعليق الخلايا في مخزن تلطيخ بارد بتركيز يصل إلى 50 مرة 10 إلى السادس لكل 100 ميكرولتر. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق النقر أو دوامة الأنبوب برفق.

ثم انقل 0.25 إلى 1 في 10 من الخلايا الست إلى أنبوب تدفق جديد من البوليسترين أو البولي بروبلين مقاس 12 × 75 ملم على الجليد. واترك هذا جانبا لاستخدامه لاحقا كعينة تحكم غير ملوثة في الأنبوب الأول ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى تعليق الخلية لتحقيق التركيز النهائي المطلوب. هنا يتم استخدام الأجسام المضادة الحمراء المترافقة ل PE Texas ، واثنين من الأجسام المضادة 20 لتلطيخ الخلايا البائية ، بينما يتم استخدام أربعة أجسام مضادة مترافقة مضادة ل TCR R و أو 700 مترافقة مضادة للقرص المضغوط لتلطيخ الخلايا التائية الممزوجة عن طريق النقر على قاع الأنبوب أو بالضوء.

تضع الدوامة الخلايا على الجليد وتحتضن في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا المصنفة بواسطة Resus ، وعلقها في 10 ملليلتر من التعليق المثلج البارد ، والمخزن المؤقت والانتقاء كما كان من قبل ، بعد الإزالة الدقيقة للطاف. كرر هذه الخطوة لغسل الخلايا مرة ثانية.

أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في Ice Cold Suspension Buffer. إذا لم يتم اقتران الأجسام المضادة الأولية مباشرة مع فلورو أربعة ، فأضف الأجسام المضادة الثانوية المسمى أو البكتيريا العقدية AVID في اقتران معلق الخلية ومرة أخرى ، احتضن الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 20 إلى 30 دقيقة بعد الحضانة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام عازلة معلق مثلج.

بعد إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت المعلق المثلج. حدد تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام صبغة حيوية مثل التريان الأزرق ومقياس الخلوي الدموي. اضبط تركيز الخلية على 10 إلى 20 في 10 في الخلايا السادسة لكل مليلتر عن طريق إضافة مخزن مؤقت للتعليق لتجنب انسداد جهاز الفاكس بمجموعات من الخلايا التي ربما تكون قد ماتت أثناء العزل.

الإجراء والتلوين. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة بالتنقيط مباشرة قبل بدء بروتوكول الفرز. يجب اختيار حجم مسام المصفاة اعتمادا على نوع الخلية للخلايا ، ويتم استخدام مصفاة بحجم مسام 40 ميكرومتر.

اجمع الخلايا المفلترة في أنبوب مخروطي 15 لترا أو أنابيب تدفق 12 × 75 ملم حسب الحجم. وضع الخلايا على الجليد أثناء إعداد مقياس الخلوي لإجراء الفرز. في حالة استخدام حبات BD comp كعناصر تحكم إيجابية أحادية اللون ، قم بإعداد أنبوب تحكم واحد لكل لون مستخدم في الفحص بالإضافة إلى أنبوب تحكم سلبي غير ملطخ.

بعد دوامة تعليق الخرزة تماما ، أضف واحدة ، وقم بإسقاط كل من تعليق الخرزة السلبية والإيجابية إلى مخزن مؤقت تعليق سعة 100 ميكرولتر لكل لون مستخدم والتحكم السلبي. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من الجسم المضاد المسمى إلى كل أنبوب تحكم إيجابي. في هذه التجربة ، يتم تحضير أنبوب واحد باستخدام PE Texas'Red B اثنين من الأجسام المضادة 20.

أحدهما يستخدم أجسام بيتا ETCR والآخر يستخدم lor 700 CD أربعة أجسام مضادة مختلطة عن طريق النقر على قاع الأنابيب واحتضانها لمدة 15 إلى 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرزات مرة واحدة بملليلترين من التلوين والمخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط وأعد تعليق حبيبات الخرزة في 200 إلى 500 ميكرولتر من التلوين.

يختلف إعداد المخزن المؤقت لمقياس التدفق الخلوي حسب الشركة المصنعة ويجب أن يتم إجراؤه فقط من قبل موظفين مدربين تدريبا مناسبا. سيتم تنفيذ إجراء فرز الخلايا هنا باستخدام عيوب BD. قبل الفرز ، حدد الفوهة المناسبة حسب نوع الخلية المراد فرزها.

الأحجام المتاحة لأغنية الحقائق هي 70 ميكرومتر و 100 ميكرومتر و 130 ميكرومتر. يجب أن يكون حجم الفوهة ثلاثة أضعاف حجم الخلية المراد فرزها بحثا عن الخلايا الليمفاوية ، ويتم تحديد فوهة 70 ميكرومتر. يمكن إجراء فرز الخلايا المعقمة باستخدام خيار الفرز المعقم للأداة.

باستخدام هذا الخيار ، يتم تطهير مسار الغمد بالكامل بنسبة 70٪ من الإيثانول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من استبدال مرشحات الغمد واستبدال PBS ب PBS المعقم. بمجرد أن يصبح مقياس الخلوي جاهزا للعمل ، ضع أنابيب التجميع المبردة مسبقا التي تحتوي على أكوام FCS في جهاز التجميع المناسب.

يمكن لأجهزة التجميع المتاحة استيعاب ما يصل إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل. أربعة أنابيب 12 × 75 ملم أو أربعة أنابيب دقيقة. استخدم أنابيب 12 × 75 ملم لجمع أقل من 1.5 في 10 للخلايا السادسة و 15 مليلتر أنابيب مخروطية لجمع 1.5 في 10 إلى ستة إلى 4.5 في 10 في الخلايا السادسة.

ضع جهاز التجميع المناسب في غرفة تجميع الفرز. قم بتوجيه التدفقات الجانبية إلى جهاز التجميع المثبت لفرز متعدد الألوان. تتم معايرة مقياس الخلايا أولا لحساب التداخل الطيفي بين أجهزة الكشف.

يوضح المثال الموضح هنا التداخل بين طيف الانبعاثات من الملاءمة E و pe. يسمى هذا التداخل الموضح في المنطقة المظللة الداكنة بالانتشار. وهنا سيتم الكشف عن الامتداد غير المباشر للإيثيلين في القناة E الملائمة وسيتم الكشف عن الامتداد الملائم في قناة PE.

يجب تصحيح هذا الامتداد من أجل القضاء على التألق المتبقي لطابق واحد أربعة في قناة أخرى. تسمى عملية تصحيح التداعيات بالتعويض لأداء التعويض اليدوي. استخدم برنامج القياس الخلوي لإعداد قالب يتضمن مخططا ثنائي المتغير لعرض FSC المبعثر الأمامي و SSC المبعثر الجانبي ورسم بياني واحد لكل فلورو سيتم استخدامه.

تختلف طريقة إعداد هذه المخططات حسب البرنامج. ضع أنبوب التحكم السلبي في منفذ التحميل الخاص بمقياس الخلوي وابدأ في الحصول على البيانات أثناء تشغيل العينة. اضبط FSC و SSC لوضع السكان المهتمين على نطاق واسع.

ثم اضبط إعدادات PMT الفلورية لوضع السكان السالب أو التألق الذاتي في الجزء الأيسر الأقصى من الرسم البياني. سجل أنبوب التحكم السلبي. قم بإزالة أنبوب التحكم السلبي من منفذ تحميل مقياس الخلايا واستبدله بأول أنبوب تحكم إيجابي.

الآن ابدأ الاستحواذ. كرر هذه العملية لكل أنبوب من أنابيب التحكم الإيجابية التي تسجل البيانات لكل أنبوب. لكل عنصر تحكم إيجابي، ارسم بوابة فاصل زمني أو مربعا حول الأحداث المسجلة في الرسم البياني.

ثم ارسم بوابة فاصل زمني أخرى في الجزء السالب من الرسم البياني. عند إجراء التعويض اليدوي ، ضع في اعتبارك كل فلورو مستخدم في التجربة عن طريق ضبط متوسط الإيجابيات حتى يساوي متوسط السلبيات. لضبط الوسيط ، اضبط قيم التداخل الطيفي ، إما أعلى أو أقل حتى تتطابق المتوسطات لكل معلمة فلورية بشكل وثيق قدر الإمكان.

باستخدام الإعدادات المحددة مع عينات التحكم الإيجابية والسلبية، استعد لإجراء الفرز من خلال تحديد إعدادات المشي للعينة التجريبية. ضع أنبوب الخلايا المراد فرزها في منفذ تحميل مقياس الخلوي وابدأ في الاستحواذ بسرعة من تسعة إلى 10،000 حدث في الثانية. حدد مخططا نقطيا لعرض المبعثر الأمامي مقابل المبعثر الجانبي.

التشتت الأمامي هو مؤشر عام لحجم الخلية ويتم وضعه على المحور x بينما التشتت الجانبي هو مؤشر على دقة الخلية ويتم وضعه على المحور Y. الآن بوابة السكان محل الاهتمام. بمجرد تحديد البوابات ، تحقق للتأكد من ضبط درجة حرارة منفذ التحميل الخاص بمقياس الخلوي على أربع درجات مئوية.

ثم ضع أنبوب العينة التجريبي في منفذ التحميل. اضغط على خيار الفرز وابدأ في الاستحواذ يجب وضع أنابيب التجميع على الجليد أثناء ملئها. استمر في الفرز حتى يتم جمع العدد المطلوب من الخلايا أو حتى يفرغ أنبوب العينة.

ثم أوقف الفرز عن طريق تحديد زر الفرز مرة أخرى وإزالة العينة من منفذ التحميل. بعد ذلك ، ضع أنبوب التجميع مباشرة على منفذ التحميل الخاص بمقياس الخلوي واحصل على 500 إلى 1000 حدث. باستخدام نفس الإعدادات المستخدمة لفرز الخلايا التائية ، زاد إجراء الفرز من النقاء من 21 إلى 99٪ بالنسبة للخلايا البائية ، تمت زيادة عدد الخلايا البائية الأولية بنسبة 5٪ إلى 98٪ بعد الفرز.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تنقية الخلايا البائية والتائية من الخلايا عن طريق الفاكس. تذكر أنه يمكن استخدام الحقائق لتنقية أي مجموعة من الخلايا إذا كان من الممكن إنشاء تعليق خلية واحدة وتوفر الأجسام المضادة المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بسهولة تنقية الخلايا المكدسة وراثيا باستخدام علامات الفلورسنت دون استخدام الأجسام المضادة.

تذكر أيضا أيضا استخدام عناصر التحكم المناسبة لتجاربك وتحقق دائما من تكوين ليزر قياس التدفق الخلوي للتأكد من أنك تستخدم الفلوروكرومات الصحيحة وتأكد من استخدام البوابات المناسبة بحيث تكون حول سكانك بشكل صحيح. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.