التنميط الضد من قبل أنظمة مناعي Luciferase (الشفاه)

يوضح هذا الفيديو الخطوات المتبعة لإجراء تحليل الـ lips. يتم التعبير عن مستضدات المقايسة في خلايا CO one كاندماجات من الـ recombinant ran vanilla luciferase أو الـ rook antigen. ويتم الحصول على المستخلصات الخام واستخدامها دون تنقية.

تبدأ مقايسة الـ lips بتحضين مستخلصات مستضد الغراب الخام مع SRA الخاص بالمريض. بعد ذلك، يتم نقل خليط الجسم المضاد والمستضد في آبار المعايرة الدقيقة إلى لوحة ترشيح ذات 96 بئراً تحتوي على حبيبات protein A G لالتقاط جزيئات IgG بعد غسل لوحة الترشيح التي تحتوي على حبيبات protein AG. يتم قياس مستضد الغراب المرتبط بالجسم المضاد عن طريق إضافة ركيزة linine، وتُقاس وحدات الضوء باستخدام مقياس الضوء (luminometer).

مرحباً، أنا الدكتورة كاثرين تشانغ من مختبر البيولوجيا الحسية في المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة. سنعرض لكم اليوم إجراءات أنظمة الترسيب المناعي للوسيفيراز (LIPS). نحن نستخدم تقنية LIPS في مختبرنا لقياس عيارات الأجسام المضادة من أجل تشخيص الأمراض و/أو العدوى.

تُستخدم استراتيجيات الطبقية في تصنيف الحالات المرضية ومراقبة التطعيمات وغيرها من التطبيقات التي تتضمن إنشاء ملفات تعريف الأجسام المضادة. لذا، لنبدأ العمل. قبل البدء في عملية عفن التحول (transfection)، يتم تحضير بلازميدات اندماج luciferase التقليدية مسبقاً كما هو موضح في ورقة BMC biotechnology البحثية.

يتم تحضير الـ plasma DNA وفقاً لطريقة BYO etal 2005 باستخدام مجموعة MIDI prep kit بإنتاجية تتراوح من 1 إلى 3 mg، ويُخزن كمحلول مخزون بتركيز 1 mg/mL عند درجة حرارة -20 °C. تُزرع خلايا Cost one المستخدمة في عملية عفن الخلايا (transfection) في وسط DMEM يحتوي على 10% FCS باتباع بروتوكولات زراعة الأنسجة القياسية. وقبل يوم واحد من عملية الـ transfection، يتم تقسيم خلايا costs one في أطباق جديدة مقاس 100 × 20 mm بكثافة تقريبية تصل إلى 2 × 10⁶ خلية لكل طبق، وتُحضن عند درجة حرارة 37 °C حتى اليوم التالي.

يجب أن تتراوح نسبة تلاقي الخلايا بين 80 إلى 95%. اترك كاشف ترانسفكشن FUgene 6، المخزن في درجة حرارة 4 °C، ليدفأ حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. وأثناء انتظار دفء FUgene 6، قم بتمييز أنابيب طرد مركزي دقيقة من البولي بروبيلين سعة 1.5 مل لكل DNA بلازميدي سيتم نقله، مع الحرص على عدم لمس الجدران الداخلية للأنابيب. أضف 6 µL من FUgene 6 إلى الأنابيب، والتي يجب أن تحتوي مسبقاً على 94 µL من وسط النمو الأمثل (optimum media)، ثم حضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف من 1 إلى 2 µg من بناء اندماج Lucifer antigen البلازميدي، واخلط المزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة والحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

انقل محلول الاندماج الأمثل السادس للحمض النووي DNA بالكامل إلى الخلايا عن طريق تقطيره بالتساوي في وسط خلايا cos.1. قم بتحضين خلايا cos.1 المنقولة لمدة يومين ثم اجمعها. لبدء جمع البروتين المندمج، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا باستخدام 6 mL من PBS.

قم بسحب أي كمية متبقية من PBS من طبق زراعة الأنسجة باستخدام الماصة، ثم أضف 1.4 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer) البارد، واجمع الخلايا باستخدام كاشطة الخلايا (cell scraper)، وانقل نصف المستخلص الخلوي بسرعة إلى كل من أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter على الثلج. يُستخدم جهاز Branson SOLIDIFIER one 50 لتحليل الخلايا. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على المستخلص الخلوي على الثلج وقم بتشغيل الجهاز بنبضات لمدة خمس ثوانٍ.

خمس ثوانٍ ثم خمس ثوانٍ أخرى. مع ضبط إعدادات جهاز السونيكاتور على قيمتين، 2 و 4 على التوالي. يتم طرد محلل الخلايا مركزياً بسرعة 12,500 RPM لمدة أربع دقائق.

يتم إجراء الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C. تُقلب الأنابيب برفق بين عمليات الطرد لإزالة الحطام الملتصق بشكل فضفاض بجدار الأنبوب الجانبي. ثم يُنقل الطافي بعناية من الأنبوبين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد موضوع على الثلج، مع مراعاة عدم تعكير الراسب.

لقياس وحدات الضوء أو lu للمحلل، خفف 1 µL من المحلل بـ 8 µL من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد، ثم أضف مباشرة 100 µL من ركيزة one celent ine إلى الخليط المخفف، وقم بقياس التألق فوراً في الأنبوب باستخدام مقياس التألق للأنابيب مع قراءة لمدة خمس ثوانٍ بدءاً من هذه الخطوة. تذكر اتباع احتياطات السلامة عند التعامل مع عينات بشرية وحيوانية. لإعداد لوحة رئيسية من المصل كمصدر للأجسام المضادة للمريض من أجل تحديد خصائص المستضد، أضف أولاً 450 µL من buffer A إلى كل بئر من لوحة معايرة دقيقة من البولي بروبيلين ذات 96 بئراً عميقاً.

في هذه الخطوة، يمكن أيضاً إضافة صبغة الفينول الأحمر (phenol red) إلى المنظم A لتعمل ككاشف لتتبع إضافات عينات SRA والخطوات الأخرى من مقايسة الدهون. بعد ذلك، أضف 50 µL من المصل من كل عينة إلى كل بئر يحتوي على 450 µL من المنظم. ملاحظة: هذا يمثل تخفيفاً بنسبة 1 إلى 10 لـ SRA في المنظم.

عادةً لا يتم إضافة SRA إلى البئرين الأخيرين في اللوحة الرئيسية، حيث يتم تخصيصهما لفراغات المحلول المنظم (buffer blanks) قبل تخزين اللوحة الرئيسية لاستخدامها مستقبلاً. يتم رج اللوحة بشكل مكثف لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين على منصة دوارة. وعند سرعة 650 RPM، يظل المصل مستقراً لمدة شهر واحد على الأقل أو أكثر في درجة حرارة 4 °C، ويمكن ختم اللوحة بـ parfum لمنع التبخر إذا كان سيتم تخزينها قبل إجراء مقايسة lips؛ قم بتنظيم جدول بيانات يحتوي على أرقام تعريف العينات والآبار المرتبطة بها في اللوحة الرئيسية. تُستخدم ألواح معايرة دقيقة من البولي بروبيلين ذات 96 بئراً ضحلاً كألواح عمل لاختبار الأمصال.

في الخطوة الأولى، أضف 40 µL من المنظم A إلى كل بئر من آبار طبق الـ 96 بئرًا باستخدام ماصة دقيقة ثمانية القنوات. بعد ذلك، خذ 10 µL من المصل المخفف من الطبق الرئيسي وأضفها مباشرة إلى كل بئر من آبار طبق العمل باستخدام ماصة دقيقة ثمانية القنوات. بعد الاستخدام، قم بإغلاق الطبق الرئيسي باستخدام البارافورم، ثم أعد وضع الغطاء على الطبق الرئيسي، وبعد ذلك غطه بغلاف Saran واحفظه في درجة حرارة 4 °C.

يتم بعد ذلك تحضير خليط رئيسي يحتوي على مستخلص مستضد الغراب، بحيث يُضاف 1 × 10⁷ IU في 50 µL من المنظم A إلى كل بئر. قم بإعداد هذا الخليط الرئيسي واسحب بواسطة الماصة 50 µL من خليط مستضد الغراب إلى كل بئر. غطِّ الطبق بغطاء طبق من البوليسترين واحضنه على هزاز دوار بسرعة 100 RPM لمدة ساعة واحدة.

عند درجة حرارة الغرفة وأثناء فترة الحضن، استخرج مقدار 1.5 milliliter من معلق خرزات protein ag ultra link بتركيز 30% في PBS من الثلاجة. أضف خمس microliters إلى قاع كل بئر في لوحة HTS ترشيحية جديدة ذات 96 بئراً. بعد حضن اللوحة لمدة ساعة واحدة، انقل 100 microliters من خليط تفاعل الأجسام المضادة لـ rook antigen إلى لوحات HTS الترشيحية ذات 96 بئراً التي تحتوي على خرزات protein ag باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات. قم بحضن لوحة الترشيح ذات 96 بئراً على هزاز دوار لمدة ساعة إضافية بسرعة 100 RPM عند درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، تُغسل لوحة الترشيح باستخدام محطة عمل أتمتة Biome FX؛ وباستخدام مجمع تفريغ، تُغسل كل بئر ثماني مرات بـ 100 µL من المنظم A، يليه غسل مرتان بـ 100 µL من PBS، وبعد الغسلة الأخيرة، يتم إيقاف تشغيل التفريغ. تُزال لوحة الترشيح وتُجفف عن طريق التربيت باستخدام مجموعة من المناشف الورقية أو ورق الترشيح، مع التأكد من إزالة الرطوبة من أعلى وأسفل اللوحة. ويُستخدم مقياس لومينومتر من طراز Burt hold LB nine 60 Centro Microplate لتحديد التألق الحيوي في كل بئر من اللوحة.

قم بتشغيل الجهاز وشطف الحاقن بالماء المقطر. يتم استخدام الركيزة INE في دورة غسيل الحاقن لتهيئة الجهاز وتشغيله، وتُحضَّر باستخدام مجموعة ركيزة ranil من Promega وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، حيث يلزم عادةً 6 mL من مزيج ركيزة one excellent tine لصفيحة واحدة. قم بتحميل مزيج الركيزة في مقياس الضيائية (luminometer)، ثم افتح ملف البرنامج الذي يحتوي على إعدادات حقن الركيزة وقراءة الصفيحة.

لهذه القياسات، يتم حقن 50 µL من ركيزة السوبين. تُرج الصفيحة لمدة ثانيتين، يتبع ذلك قراءة للتألق الحيوي لمدة خمس ثوانٍ.

ابدأ البرنامج الذي يقوم بقراءة الطبق بعد انتهاء التشغيل، ثم قم بإزالة طبق الترشيح ميكروتيتر فوراً لمنع حدوث أي تسرب داخل جهاز قياس اللمعان. يتم تصدير البيانات تلقائياً من برنامج microwind إلى تنسيق Excel لإجراء مزيد من التحليل. يتم حساب متوسط النتائج لتشغيلين مختلفين باستخدام نفس الأمصال.

من أجل توليد قيم عيار lu، يُوصى بإجراء ذلك لكل عينة. يجب أن تُظهر العينات المكررة توافقاً عالياً في قيم العيار بين التشغيلين. ولغرض رسم البيانات، يمكن تعديل قيم عيار lu بشكل أكبر لطرح فراغات المنظم (buffer blanks) كما هو موضح هنا.

يمكن أيضاً حساب حساسية ونوعية المقايسة من خلال استخدام نقاط القطع المشتقة من المتوسط زائد ثلاثة أو خمسة انحرافات معيارية لعينات الضبط. لقد عرضنا لكم للتو كيفية قياس عيارات الأجسام المضادة باستخدام تقنية LIPS، والتي تتطلب حداً أدنى من تحسين المقايسة، وبفضل بساطتها، يمكن استخدامها لإنتاج بيانات عالية الجودة في أقل من أسبوعين لأي مستضد محدد. عند العمل مع العينات البشرية، من المهم تذكر اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة.

وتذكر أن تقنية Lifts قابلة للتوسع بشكل كبير، ولهذا السبب يمكن استخدامها لقياس عدد صغير من العينات باستخدام الغسل اليدوي أو لوحة كاملة باستخدام محطة عمل روبوتية. وبفضل هذه المرونة، نعتقد أن Lifts ستكون مفيدة للغاية في التحليل المصلِي المستضدي وسيكون لها تداعيات واسعة في تحليل الأمراض والصحة العامة بشكل عام. حسناً، هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجارب توصيف الأجسام المضادة الخاصة بكم.