تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent
December 8th, 2009
نبدي بروتوكول لجيل من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من الخلايا الجسدية البشرية باستخدام الفيروسة البطيئة بوساطة التسليم من العوامل البشرية Oct4 ، Sox2 ، Nanog وLin28. وأكد تعدد القدرات التي التشكل وجود الجذعية الجنينية (ES) بعلامات محددة الخلية.
مرحبا ، اسمي براد هاميلتون. أنا عالم هنا في قسم البحث والتطوير هنا في STEM Gen. سنعرض لكم اليوم إجراء حول كيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية باستخدام عوامل إعادة البرمجة التي يتم تسليمها من الفيروسات العدسية.
يمكن استخدام هذا الإجراء لإنشاء خلايا IPS ودراسة عملية إعادة البرمجة. تشبه خلايا IPS الخلايا الجذعية الجنينية في التشكل والتكاثر والقدرة على التمايز وجميع أنواع أنسجة الجسم. تتمتع خلايا IPS البشرية بميزة واضحة على الخلايا الجذعية الجنينية لأنها تظهر الخصائص الرئيسية لخلايا ES دون المعضلة الأخلاقية المتمثلة في تدمير الجنين للحصول على الخلايا.
يتحايل توليد خلايا IPS الخاصة بالمريض على عقبة مهمة أمام علاجات الطب التجديدي الشخصية من خلال القضاء على احتمالية الرفض المناعي للخلايا المزروعة غير الذاتية. لذلك دعونا نبدأ. في عدة نقاط في هذا البروتوكول ، يمكنك استبدال وسط IPSC النامي أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بوسط مكيف للميثامفيتامين.
يستغرق تحضير هذه الوسيلة ستة أيام. لذا ابدأ قبل أسبوع على الأقل من بدء تجربتك. للبدء بذرة كل بئر من ستة.
صفيحة البئر مع اثنين في 10 إلى الخامس cf خلايا مغذية واحدة للميثامفيتامين في ملليلتر من نمو الميثامفيتامين. يحتضن المتوسط بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط إلى ثقافة خلايا E-S-I-P-S البشرية.
يحتضن المتوسط بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اجمع المادة الطافية واستبدلها بوسط طازج كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
استكمل المادة الطافية التي تم جمعها ب 15 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية BFGF. سينتهي بك الأمر بحوالي 16 مل من الميثامفيتامين المتوسط المكيف لتخزين المواد الطافية التي تم جمعها كل يوم بشكل منفصل عند أربع درجات SIUs. يمكن تخزين وسط مكيف الميثامفيتامين لمدة أسبوع إلى أسبوعين عند أربع درجات مئوية أو لعدة أشهر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
الآن بعد أن تأكدت من أن الوسيط المكيف للميثامفيتامين سيكون جاهزا عندما تحتاج إليه ، دعنا نتحدث عن تحضير الخلايا. تتمثل المهمة الأولى في توليد IPSC في استخدام فيروسات العدسات لنقل خلايا الخلايا الليفية للقلفة البشرية أو خلايا BJ ذات أربع خصائص نسخ للخلايا الجذعية. للتحضير لخلايا BJ بذرة التحويل بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من ستة صفيحة وثقافة.
الخلايا في ملليلتر من النمو ، متوسطة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في نفس اليوم. ابدأ في تحضير ألواح تغذية الميثامفيتامين بإضافة ملليلترين من 0.1٪ جيلاتين مخفف في الماء إلى صفيحة من ستة آبار واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يغطي الجيلاتين الآبار ويعمل كمصفوفة ل.
الآن خلايا BJ جاهزة لنقل الفيروسات العدسية لإعداد الفيروس للنقل. استكمل ملليلترين من الوسط الطازج بستة ميكروغرامات لكل مليلتر من الدماغ المتعدد وأربعة فيروسات عدسية يعبر كل منها عن أحد عوامل النسخ البشري. T أربعة ، SO اثنان نانوغ ولين 28 ، بحيث يكون كل منهما بنفس تعدد العدوى أو وزارة الداخلية.
يتم تضمين جميع فيروسات العدسات هذه في مجموعة فيروس العدسات لعامل إعادة البرمجة البشري. لإجراء التنبيغ ، ما عليك سوى استبدال وسط نمو خلايا BJ بالوسط المحتوي على الفيروس. هز اللوحة برفق حتى يغطي الوسيط الجزء السفلي بالتساوي.
احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في نفس اليوم. قم بإزالة قارورة واحدة من خلايا تغذية الميثامفيتامين من النيتروجين السائل وقم بإذابته. قم بإزالة محلول الجيلاتين من ألواح تغذية الميثامفيتامين ، والتي أصبحت الآن مطلية بالجيلاتين لكل منها.
حسنا ، أضف 0.2 في 10 إلى الخلايا الخامسة في ملليلترين من نمو الميثامفيتامين متوسط. احتضان MES بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، افصل خلايا BJ باستخدام 0.05٪ تريبسين EDTA وجهاز الطرد المركزي عند 200 Gs لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط النمو. قم بإزالة الوسيط من لوحة تغذية الميثامدادامفيتامين وأضف ملليلترين لكل بئر من تعليق خلية BJ. يجب أن يكون تركيز خلية BJ حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر.
احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة من انحسار خلايا BJ على لوحة تغذية الميثامفيتامين ، استبدل الوسط ب E-S-I-P-S البشري ، وهو جذع جنيني أو ثقافة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. متوسط. استمر في تغيير الوسيط كل 24 ساعة لمدة سبعة أيام.
في اليوم السابع ، استبدل وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية بملليلترين من الوسط المكيف بالميثامفيتامين. توفر الخلايا المغذية للميثامفيتامين العوامل القابلة للذوبان اللازمة لنمو خلايا IPS. لكننا الآن بحاجة إلى إضافة المزيد من هذه العوامل للحفاظ على صحة الثقافة.
يحتوي الوسط المكيف للميثامفيتامين على جميع العوامل القابلة للذوبان التي تفرزها خلايا تغذية الميثامفيتامين تحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالنظر إلى النطاق ، حدد مستعمرة خلية. تتميز بقبة صغيرة مدمجة تشبه المظهر في صفيحة جديدة مكونة من 24 بئر سبقتها قبل 24 ساعة مع خلايا تغذية الميثامفيتامين الواحدة CCF تنحسر المستعمرة المختارة في ثقافة E-S-I-P-S البشرية.
متوسط مكمل ب 10 جزيء جذعي ميكرومولار Y 2 7 6 3 2. مثبط كيناز معتمد. قم بتغيير وسط الاستزراع دون تناول جزيء الساق Y 2 7 6 3 2 كل 24 ساعة خلال الأيام السبعة الأولى.
بعد سبعة أيام ، قم بتغيير الوسط إلى الميثامفيتامين. تستمر الحالة إلى المتوسطة في مرور الخلايا حتى تظهر مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية النموذجية. ابحث عن قبة صغيرة ومضغوطة مثل المستعمرات ذات الحافة الحادة.
يجب أن تكون المستعمرات موحدة وتحتوي على نسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازم. في هذه المرحلة ، قمت بتطوير مستعمرات لها مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية ، ولكن هل تعبر أيضا عن الجينات المميزة للخلايا الجذعية الجنينية؟ لمعرفة تلطيخ المستعمرات لعلامات تعدد القدرات مثل TRA 180 1 TRA واحد 60 SSEA أربعة s و SE و ثلاثة T أربعة sox و اثنان nanog و SSEA واحد للبدء في غسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام PBS.
بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من 4٪ paraform أو الألدهيد أو أي مثبت آخر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، اغسل الخلايا باستخدام PB S3 مرات أخرى لإزالة المثبت الزائد. بعد ذلك ، قم بحظر الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد خطوة الحظر ، أضف 250 ميكرولترا من الجسم المضاد الأولي المخفف من واحد إلى 100 في المخزن المؤقت المانع لكل منها.
حسنا ، احتضان الخلايا في الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط. احتضان الخلايا ب 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف من واحد إلى 300 وحجب المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، مع الابتعاد عن الضوء لتجنب التبييض الضوئي بعد الحضانة بالجسم المضاد الثانوي.
اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS إلى الغسيل الثالث. أضف DPI بمعدل ميكروغرام واحد لكل مليلتر لتلطيخ النوى. أخيرا ، ها هو تحليل التعبير الجيني لخلايا IPS الخاصة بك.
تحت المجهر ، لوحظت نتائج مورفولوجيا البشرية الأربع خلايا الليفية الجلدية حيث تم نقل المهد مع T four SOX و اثنين nanog و lin 28 التغيرات المورفولوجية في وقت مبكر من اليوم الرابع بعد التنبيغ وأصبحت مجموعة الخلايا معبأة بشكل أكثر إحكاما في اليوم 17 للتعبير عن علامات الفاعلية المتعددة. لتوصيف مستعمرات خلايا IPS المعزولة ، بحثنا عن وجود علامات متعددة القدرات الشائعة يتم التعبير عنها في الخلايا الجذعية الجنونية. أظهرت المستعمرات نشاطا قويا للفوسفاتيز القلوي.
بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء الكيمياء المناعية أو ICC على مستعمرات خلايا IPS باستخدام لوحة من الأجسام المضادة المحددة لعلامات متعددة القدرات بما في ذلك علامات السطح TA 180 1 TRA one 60 SSEA four و SS EEA three ، بالإضافة إلى العلامات النووية ، T four ، SOX two ، و Nanog. كانت مستعمرات IPS المعزولة إيجابية لجميع العلامات. تظهر نتائج ICC أن خلايا IPS أظهرت نمط تعبير علامة تعدد القدرات المناسب ، مما يدل على أن خلايا IPS هذه تشبه إلى حد كبير خلايا E es البشرية غير المتمايزة.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية توليد خلايا IPS عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية باستخدام الجيل الجذعي. مجموعة فيروس العدسات البشري لعامل إعادة البرمجة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم مراعاة عدة عوامل.
أولا ، قد تحتاج نسبة الفيروس النشط إلى الهدف إلى التعديل أثناء خطوة التنبيغ الأولية لتحقيق كفاءة التحويل المثلى. ثانيا ، يمكن أن تؤثر حالة نمو الخلايا المستهدفة. إعادة برمجة الخلايا السليمة والتكاثرية أكثر قابلية لإعادة البرمجة.
ثالثا ، عند تعديل البروتوكول لأرقام الخلايا المختلفة ، يوصى بتعديل أرقام الخلايا المستهدفة بشكل متناسب مع مساحة سطح طبق الاستزراع. أخيرا ، يجب النظر في استخدام مثبطات الصخور مثل Y 2 7 6 3 2 للمساعدة في ضمان إعادة البرمجة الناجحة حيث أثبتت الدراسات الحديثة فائدتها في تعزيز بقاء مستعمرة نعم البشرية. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الخلايا الليفية البشرية باستخدام ناقلات فيروسية بطيئة. يتضمن العملية توصيل عوامل النسخ الرئيسية، والتتميز الخلايا متعددة القدرات الناتجة بمورفولوجيتها وعلاماتها المحددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- إعادة برمجة الخلايا
- الطب التجديدي
الخلفية
- تتشارك الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) خصائص مع الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs).
- يمكن توليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الخلايا الجسدية دون المخاوف الأخلاقية المرتبطة بالخلايا الجذعية الجنينية (ESCs).
- يمكن أن تعزز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) الخاصة بالمريض الطب الشخصي عن طريق تقليل مخاطر الرفض المناعي.
- يستخدم البروتوكول ناقلات فيروسية بطيئة لإدخال عوامل إعادة البرمجة.
هدف الدراسة
- لإظهار طريقة موثوقة لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الخلايا الليفية البشرية.
- لتوفير رؤى حول عملية إعادة البرمجة وتطبيقاتها في الطب التجديدي.
- لتأكيد تعددية القدرات للخلايا المتولدة من خلال التوصيف المورفولوجي والجزيءي.
الطرق المستخدمة
- تحضير الوسط المشروط بالميث لزراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs).
- النقل الفيروسي البطيء للخلايا الليفية البشرية باستخدام عوامل إعادة البرمجة.
- زراعة وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) في ظل ظروف معينة.
- توصيف علامات تعددية القدرات في مستعمرات الخلايا المشتقة.
النتائج الرئيسية
- توليد ناجح للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) بمورفولوجيا مشابهة للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs).
- تأكيد التعبير عن علامات تعددية القدرات في المستعمرات المشتقة.
- يسمح البروتوكول بالإنتاج الفعّال للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) الخاصة بالمريض.
- إمكانية الاستفادة في العلاجات التجديدية الشخصية.
الاستنتاجات
- يقوم البروتوكول بتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الخلايا الليفية البشرية بشكل فعّال.
- تظهر الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) خصائص أساسية لتعددية القدرات، مما يجعلها قيّمة للبحث والعلاج.
- توفر هذه الطريقة أساسًا للدراسات المستقبلية في الطب التجديدي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Generation of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human fibroblasts enables disease modeling and target validation without ethical constraints of embryonic stem cells. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, genetically matched human cell system for pathway interrogation and phenotypic screening. The lentiviral delivery of defined transcription factors offers a scalable, reproducible method to produce iPSCs for downstream assay development and preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human genetic context using iPSCs derived from patient fibroblasts.
- Operational Value: Provides a renewable source of pluripotent cells for consistent target engagement and pathway modulation studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming target relevance in a disease-relevant human system prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized iPSC-derived cells suitable for assay preparation and compound screening workflows.
- Operational Value: Enables production of uniform cell colonies with defined morphology and marker expression for reproducible assay performance.
- Scalability: Lentiviral transduction allows for consistent iPSC generation across multiple wells and plates, supporting medium-to-high throughput screening preparation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patient-specific iPSCs bridge discovery and preclinical validation by maintaining genetic fidelity to the donor.
- Mechanistic De-risking: Expression of pluripotency markers (TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, Oct4, Sox2, Nanog) confirms cellular identity, reducing ambiguity in downstream differentiation and toxicity studies.
- Predictive Confidence: Morphological and molecular characterization of iPSC colonies enables go/no-go decisions based on pluripotency fidelity before preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a human-relevant system for mechanistic insight and assay readiness.
- Discovery Biology: Lentiviral reprogramming supports hypothesis testing by generating iPSCs that reflect patient-specific genetics for target validation.
- Screening: Produces conditioned medium and feeder-independent iPSC colonies suitable for assay standardization and compound testing.
- Analytics: Enables quantification of pluripotency via marker expression (alkaline phosphatase, surface and nuclear markers) to assess reprogramming efficiency and consistency.
- Translational Research: Patient-derived iPSCs support continuity into preclinical models by preserving genetic background for disease-relevant differentiation.
- Enterprise Reuse: The Stemgent Human TF Lentivirus Set provides a reusable platform for iPSC generation across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through confirmed pluripotency and reduction of mechanistic ambiguity in human cells.
- Operational Value: Standardization of iPSC production via lentiviral transduction and defined culture conditions (meth conditioned medium, Y-27632).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via early biological de-risking, reducing late-stage failure risk in regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets using patient-specific iPSC models that predict clinical translatability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, stem cell culture, and immunofluorescence characterization.
- Dependent on lentiviral vector infrastructure and biosafety protocols for handling reprogramming factors.
- Necessitates standardized feeder cell preparation and conditioned medium production for consistent iPSC maintenance.
- Adaptation to alternative fibroblast sources may require optimization of transduction efficiency and selection conditions.
- Practical limitations include variability in reprogramming efficiency based on cell passage, donor variability, and MOI titration needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:09
Introduction
1:05
Preparing Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) Conditioned Medium
2:39
Transducing Human-Foreskin-Fibroblast (BJ) Cells with Stem-Cell-Specific Transcription Factors
6:33
Selecting and Passaging Induced Pluripotent Stem Cell Colonies
9:43
Representative Results: Induced Pluripotent Stem Cell Colonies Morphologically Resemble Stem-Cells and Express Markers of Pluripotency
7:33
Staining Resulting Colonies for Markers of Pluripotency
11:07
Conclusion
