التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

يشرح هذا الفيديو تقنية التقاط تمديد البادئ (primer extension capture) أو PECA، والتي تسمح بالاسترجاع المستهدف لتسلسلات DNA من مصادر DNA مجزأة للغاية وذات عدد نسخ منخفض جداً. لقد استخدمنا هذه التقنية لتسلسل الجينومات الميتوكوندرية الكاملة من عظام إنسان النياندرتال التي يزيد عمرها عن 40,000 سنة، ويمكن استخدام هذه الطريقة لالتقاط أي مناطق مستهدفة صغيرة أو تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ومن العديد من الأفراد. تتمثل الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء في تضخيم PCR لمكتبة DNA أولية، وتقدير كمية المكتبة المضخمة بواسطة PCR الكمي، والتمديد الأولي المستهدف للمكتبة المضخمة، والالتقاط بالخرزات لنواتج التمديد الأولي لإزالة الشظايا غير المستهدفة، ثم شطف وتسلسل الأهداف التي تم التقاطها وغسلها.

مرحباً، أنا أدريان بريغز من مختبر شانتي بايبل في قسم علم الوراثة بمعهد ماكس بلانك للأنثروبولوجيا التطورية في لايبزيغ. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل تتابعات DNA محددة ذات أهمية من مصدر DNA معقد وشديد التحلل مثل العظام القديمة. لقد استخدمنا هذا الإجراء لدراسة التنوع الجيني للمتقدرات في Homo neanderthalensis أو إنسان نيانديرتال.

لنبدأ العملية. يأتي الحمض النووي DNA المستخدم في تجربتنا من عظام إنسان نياندرتال يتراوح عمرها بين 40,000 و 70,000 عام، والتي عُثر عليها في مواقع مختلفة عبر النطاق الجغرافي لإنسان نياندرتال. أولاً، يتم تعريض العظمة للأشعة فوق البنفسجية UV طوال الليل لتطهير السطح من أي DNA خارجي.

يُستخدم مثقاب دقيق لإنتاج ما بين 100 و500 مليغرام من مسحوق العظام، ثم يُستخلص الـ DNA من مسحوق العظام باستخدام الإجراء الموضح في مقال عام 2007 بعنوان "مقارنة وتحسين استخلاص الـ DNA القديم" من تأليف نادين روكلاند ومايكل هوف. بعد ذلك، يتم تحويل مستخلص الـ DNA إلى مكتبة تسلسل عن طريق إضافة مواقع بادئة للمكيفات العامة إلى نهايات جميع قطع الـ DNA؛ ونظراً لأن مكتبة 4 5 4 الناتجة من عظمة إنسان نياندرتال تحتوي على كميات ضئيلة جداً من الـ DNA، والتي قد تصل أحياناً إلى بضعة بيكوغرامات فقط، يتم تضخيم مكتبة الـ DNA الأولية هذه أولاً بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات emulsion PCR المطابقة لبادئات المكتبة العامة.

لتحضير خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم المكتبة، اخلط الكواشف التالية في أنبوب PCR: استخدم 10 µL من منظم GAMP PCR بتركيز 10X، و 2 µL من كلوريد المغنيسيوم، و 2 µL من BSA، و 1 µL من مزيج DNTP، و 3 µL من كل من بادئات 4 54 MPCR الأمامية والعكسية، و 1 µL من إنزيم amply gold DNA polymerase، و 25 µL من قالب المكتبة. وأخيراً، أضف 45 µL من الماء المخصص لتفاعلات PCR ليصل الحجم النهائي إلى 100 µL. إن إنزيم amply Tech gold DNA polymerase مستقر في درجة حرارة الغرفة، لذا ليس من الضروري العمل على الثلج.

بعد تحضير تفاعل PCR، ضع أنبوب PCR في جهاز الدورات الحرارية (thermocycler)، بدءاً بخطوة تمسخ عند 95 °C لمدة 12 دقيقة، تليها 14 دورة تتكون من 95 °C لمدة 30 ثانية، و60 °C لمدة دقيقة واحدة، و72 °C لمدة دقيقة واحدة. وفي نهاية هذه الدورات الـ 14، يتم ضبط خطوة نهائية عند 72 °C لمدة خمس دقائق، وبعد ذلك يمكن حفظ أنبوب PCR عند 10 °C لفترة غير محددة حتى يحين وقت الاستخدام بعد اكتمال تضخيم PCR، ثم يتم تنقية ناتج PCR باستخدام عمود تنقية Kyogen MinLu spin column وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ويُستخلص DNA من العمود باستخدام 50 µL من محلول EB buffer المرفق مع مجموعة MinLu قبل عملية التمديد الأولية والتقاط الناتج.

يجب إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Quantitative PCR) على أجزاء من المكتبات غير المضخمة والمضخمة من أجل قياس وتقدير جودة ناتج المكتبة المضخمة. يجب أن تحتوي المكتبة المضخمة خلال 14 دورة على كمية من DNA تزيد بعدة آلاف المرات عن المكتبة الأولية. وفي حال لم يحدث ذلك، يجب مراجعة ظروف التضخيم وإعادتها.

يجب تصميم بادئات التقاط التمديد الأولية، التي ستُستخدم لالتقاط التسلسلات المستهدفة من المكتبة المضخمة، مثل بادئات PCR العادية لتطابق منطقة مستهدفة محددة، مع درجة حرارة انصهار مثالية تبلغ 60 °C عند الطرف 5' لكل من هذه التسلسلات المستهدفة، مع وجود تسلسل ذيلي مكون من 12 قاعدة، وتضم بقايا بيوتين عند الطرف 5'. يمكن استخدام ما يصل إلى 150 بادئ PEC معاً في مزيج متعدد (multiplex mix) واحد مُحضّر من مخزونات بتركيز 200 µM. لتفاعل التمديد الأولي، قم بتحضير مزيج PCR في أنبوب PCR مناسب عن طريق إضافة 5 µL من منظم GAMP PCR بتركيز 10 X، و 2.5 µL من كلوريد المغنيسيوم، و 1 µL من BSA، و 0.5 µL من DNTP. اخلط 5 µL من مزيج بادئات التقاط التمديد الأولية، و 0.5 µL من Taq gold DNA polymerase، و 2 µL من DNA المكتبة المضخمة لـ 14 دورة، وأخيراً 31 µL من الماء المخصص لـ PCR، للحصول على حجم إجمالي قدره 50 µL.

إذا كان قالب المكتبة المضخمة يحتوي على أكثر من 1 × 10¹² نسخة لكل ميكرولتر، فيجب تخفيف القالب أولاً باستخدام محلول EB المنظم بحيث لا يتم إضافة أكثر من 2 × 10¹² نسخة إلى خليط التفاعل. بعد تحضير أنبوبة الـ PCR، ضعها في جهاز التدوير الحراري واضبطه لإجراء دورة تفاعل واحدة. ابدأ بعملية تمسخ لمدة 12 دقيقة عند 95 °C، تليها دقيقة واحدة عند 60 °C، ثم خمس دقائق عند 72 °C للتمديد الأولي.

وعند انتهاء الدورة الواحدة، يتم الضبط على 72 درجة Celsius للحفاظ على ناتج PCR حتى الخطوة التالية. ومن أجل تجنب الارتباط غير النوعي للبادئات، يتم سحب 150 µL من محلول PBI أو محلول PB المنظف من مجموعة تنقية Kyogen Ute مباشرة في أنابيب تفاعل PCR، بينما يظل خليط التفاعل في الجهاز الحراري عند 72 درجة Celsius. تساهم هذه العملية في تثبيط إنزيم البوليميراز، بينما تكون درجة الحرارة مرتفعة جداً بحيث تمنع الامتداد غير النوعي لبادئات الهدف؛ أغلق الأنابيب واستخدم جهاز vortex لفترة وجيزة، ثم قم بترسيب السائل باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

استخدم فقط منظم PBI أو PB في هذه الخطوة، حيث يمكن أن تتداخل منظمات الربط الأخرى مثل منظم Qiagen PM مع عملية الالتقاط اللاحقة. بعد ذلك، انقل الخليط من أنبوب PCR إلى عمود دوران Rogen MinLu للتنقية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة كما تم القيام به سابقاً، ثم استخلص DNA من العمود باستخدام 30 µL من منظم EB المرفق مع مجموعة MinLu. ومن أجل إزالة جميع الشظايا التي لم ترتبط ببادئات PEC، يتم إجراء خطوة التقاط تعتمد على الخرز.

أولاً، قم بإعادة تعليق محلول مخزون من حبيبات M 270 strip divide عن طريق الخض بالدوامة (vortexing)، ثم اسحب كمية من الحبيبات تعادل 25 µL لكل عينة. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 500 µL من محلول 2x BW buffer، وأعد تعليق الحبيبات في حجم من محلول 2x BW مساوٍ لحجم الحبيبات التي تم سحبها في الأصل. قم بتحضير 25 µL من هذا المعلق.

لكل عينة، أضف 25 µL من الـ DNA المستخلص والمنقى إلى 25 µL من معلق الخرزات، مع الاحتفاظ بالخمسة µL المتبقية للتقدير الكمي لاحقاً. اخلط الـ DNA ومعلق الخرزات عن طريق السحب والطرد بالماصة والتقليب باستخدام طرف الماصة، ثم قم بتدوير المزيج ببطء على جهاز تدوير مختبري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الخلط، انقل المحتويات إلى أنبوب PCR جديد سعة 1.5 mL.

خلال خطوة تحضين التدوير السابقة، قد يكون بعض الحمض النووي غير المستهدف قد التصق بجدار الأنبوب. لذا فإن نقل معلق الخرزات إلى أنبوب جديد يتجنب احتمالية تحرر هذا الحمض النووي غير المستهدف في النواتج النهائية. خلال خطوة الشطف الحراري، يتم استخدام جامع الجسيمات المغناطيسية لترسيب الخرزات، وبعد مرور 10 إلى 20 ثانية، ستكون جميع الخرزات قد انتقلت إلى الجدار، تاركةً سائلًا علويًا رائقًا يجب إزالته لغسل الخرزات، ثم أضف 500 µL من محلول BW المنظم بتركيز 1x إلى الأنبوب وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لمدة ثلاث ثوانٍ تقريبًا وبسرعة بطيئة.

قم برج الأنبوب وهو في وضع رأسي ثم مرة أخرى وهو مقلوب، بحيث لا تتبقى أي خرزات ملتصقة بجدار الأنبوب. باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بتدوير المعلق لمدة تتراوح من ثانية واحدة إلى ثلاث ثوانٍ، وهي مدة كافية فقط لسحب كافة السوائل من جدران الأنبوب. أعِد الأنبوب إلى جهاز MPC وانتظر من 10 إلى 20 ثانية حتى تتجمع كل الخرزات على جانب الأنبوب.

بعد ذلك، قم بإزالة الطافي (supernatant). وبذلك تكون عملية الغسيل الأولى قد اكتملت. كرر هذا الإجراء أربع مرات إضافية، تتبعها عملية غسيل واحدة أخيرة باستخدام BW وإزالة الطافي.

أضف 500 µL من محلول غسيل ساخن بتركيز 1x. امزج المعلق عن طريق استخدام جهاز الـ vortex لفترة وجيزة ثم التدوير الطردي كما سبق، بعد ذلك رج الأنبوب لمدة دقيقتين عند 65 °C باستخدام هزاز كتل حراري بسرعة 1000 RPM، يليه تدوير طردي وجيز لإزالة آثار المادة الطافية خلال دقيقة واحدة من إخراجها من الكتلة الحرارية. ستعمل هذه الخطوة على إزالة الشظايا التي قد ترتبط ببادئات PEC ولكنها لم تمتد في خطوة تمديد البادئ؛ أعد تعليق الراسب في 30 µL من محلول EB وانقل المزيج إلى أنبوب PCR جديد سعة 1.5 mL.

حضّن الأنبوب في الجهاز الدوري الحراري عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. قم بترسيب الحبيبات في جامع الجسيمات المغناطيسية. يستغرق الأمر من 10 إلى 20 ثانية حتى يصبح السائل الطافي رائقاً تماماً، ثم انقل السائل الطافي S إلى أنبوب جديد مصنف.

مع الحرص على عدم نقل أي من الحبيبات. احتفظ بالراشح الذي يحتوي على ناتج شظايا DNA المُلتقطة. يمكن التخلص من الحبيبات في هذه المرحلة.

لتضخيم المنتج الملتقط، قم بتحضير مزيج PCR بحجم إجمالي قدره 100 µL كما تم القيام به في الجزء الثاني، وطبق نفس ظروف دورات PCR. ومرة أخرى، بعد اكتمال تضخيم المنتج الملتقط بواسطة PCR، اتبع ذلك بعملية تنقية باستخدام عمود Qiagen Ute الدوراني كما سبق القيام به في القسم الثاني، ثم استخلص DNA من العمود باستخدام 50 µL من Eeb Buffer؛ وبذلك يصبح المنتج جاهزاً للتسلسل عالي الإنتاجية. لقد صممنا 574 بادئ PEC لتغطية كامل الجينوم الميتوكوندري للإنسان النياندرتالي.

قمنا بتقسيم هذه المجموعات إلى أربعة مخاليط متعددة، وأجرينا جولتين متتاليتين من عملية التقاط التمديد الأولي (PEC) على مكتبات من خمس أحافير لنانديرتال من أربعة مواقع عبر أوراسيا يتراوح عمرها بين 40,000 و 70,000 سنة، مما أنتج ما بين 170,000 و 500,000 تسلسل لكل فرد، وتمت محاذاة النتائج مع تسلسل مرجعي للميتوكوندريا. وقد وجدنا أن إجراء PEC قد أدى إلى إثراء هائل للحمض النووي الميتوكوندري، محققاً تغطية كاملة للحمض النووي الميتوكوندري لكل فرد بمتوسط تغطية يتراوح بين 18 و 56.3 ضعفاً. وبناءً على هذه النتائج، تمكنا من إنشاء تسلسل جينومي ميتوكوندري كامل وعالي الجودة لكل فرد.

قمنا بعد ذلك بإجراء مقارنة تطورية لهذه التسلسلات مع عينة عالمية من البشر الحاليين وأقرب أقاربنا الأحياء، الشمبانزي والبونوبو. وقد أكد ذلك النتائج السابقة التي تشير إلى أن الحمض النووي الميتوكوندري لنياندرتال مرتبط ارتباطاً وثيقاً بالبشر المعاصرين، ولكنه متميز بوضوح عنهم. علاوة على ذلك، كشفت المقارنة بين تسلسلات نياندرتال ذاتها عن تنوع جيني منخفض للغاية لدى نياندرتال، وهو أقل من التنوع الموجود بين البشر في جميع أنحاء العالم اليوم، ومماثل للتنوع لدى الأوروبيين في الوقت الحاضر.

تشير هذه الأدلة، مقترنة بتحليل تطور البروتين في تسلسلات إنسان النياندرتال، إلى أن النياندرتال كان لديهم حجم سكاني منخفض على المدى الطويل، وهو ما يتفق مع الأدلة الأثرية التي تشير إلى أن الكثافة السكانية للنياندرتال لم تصل مطلقاً إلى المستويات التي حققها البشر الحديثون. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء عملية التقاط الامتداد للرئيسيات (primate extension capture) لتضخيم والتقاط التسلسلات المستهدفة استعداداً للتسلسل عالي الإنتاجية. عند اتباع هذا الإجراء، من المهم الالتزام بجميع مواصفات درجة الحرارة في جهاز التدوير الحراري (thermocycler)، ولكن يجب الانتباه إلى أن البادئات قد تكون لها درجات حرارة تلدن (annealing temperatures) مختلفة، لذا قد تضطر إلى ضبط درجة حرارة التلدن لتناسب بادئاتك الخاصة، مع الحرص خلال جميع خطوات الغسيل على إزالة أكبر قدر ممكن من السائل.

شكرًا لكم على المشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.