التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

يشرح هذا الفيديو تقنية التقاط تمديد البادئ (PECA)، وهي تقنية تتيح الاسترجاع المستهدف لتسلسلات DNA من مصادر DNA شديدة التجزؤ وذات عدد نسخ منخفض للغاية. لقد استخدمنا هذه التقنية لتسلسل الجينومات الميتوكوندرية الكاملة من عظام إنسان النياندرتال التي يعود تاريخها إلى أكثر من 40,000 سنة، ويمكن استخدام هذه الطريقة لالتقاط أي مناطق مستهدفة صغيرة أو تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ومن العديد من الأفراد. وتتمثل الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء في تضخيم PCR لمكتبة DNA أولية، وتقدير كمية المكتبة المضخمة بواسطة qPCR، والتمديد الأولي المستهدف للمكتبة المضخمة، والالتقاط بالخرزات لمنتجات التمديد الأولي لإزالة الشظايا غير المستهدفة، وأخيراً شطف وتسلسل الأهداف التي تم التقاطها.

مرحباً، أنا أدريان بريغز من مختبر شانتي بايبل في قسم علم الوراثة بمعهد ماكس بلانك للأنثروبولوجيا التطورية في لايبزيغ. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل تتابعات DNA محددة ومطلوبة من مصدر DNA معقد وشديد التحلل مثل العظام القديمة. لقد استخدمنا هذا الإجراء لدراسة التنوع الجيني للميتوكوندريا في *Homo neanderthalensis* أو إنسان نياندرتال.

لنبدأ الآن. يأتي الحمض النووي (DNA) المستخدم في تجربتنا من عظام إنسان نياندرتال يتراوح عمرها بين 40,000 و70,000 عام، والتي عُثر عليها في مواقع مختلفة عبر النطاق الجغرافي لنياندرتال. في البداية، يتم تعريض العظمة للأشعة فوق البنفسجية (UV) طوال الليل لتطهير السطح من أي حمض نووي (DNA) خارجي.

يُستخدم مثقاب دقيق لإنتاج ما بين 100 و500 milligrams من مسحوق العظام، ثم يُستخلص الـ DNA من مسحوق العظام باستخدام الإجراء الموصوف في مقال عام 2007 بعنوان comparison and optimization of ancient DNA extraction للباحثين Nadine Rockland وMichael Hof. بعد ذلك، يتم تحويل مستخلص الـ DNA إلى مكتبة تسلسل عن طريق إضافة مواقع تحضير للمهايئات العامة (universal adapter priming sites) إلى نهاية جميع قطع الـ DNA؛ وبما أن مكتبة 4 5 4 التي يتم إنشاؤها من عظام إنسان نيانديرثال تحتوي على كميات ضئيلة جداً من الـ DNA، تصل أحياناً إلى بضعة picograms فقط، فإن مكتبة الـ DNA الأولية هذه تُضخم أولاً بواسطة PCR باستخدام بادئات emulsion PCR المقابلة لبادئات المكتبة العامة.

لتحضير خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم المكتبة، اخلط الكواشف التالية في أنبوب PCR: استخدم 10 µL من منظم GAMP PCR بتركيز 10 X، و 2 µL من كلوريد المغنيسيوم، و 2 µL من BSA، و 1 µL من خليط dNTP، و 3 µL من كل من بادئات 4 54 MPCR الأمامية والعكسية، و 1 µL من Amplygold DNA polymerase، و 25 µL من قالب المكتبة. وأخيراً، أضف 45 µL من الماء المخصص لـ PCR ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 µL. يعتبر Amplygold DNA polymerase مستقراً في درجة حرارة الغرفة، لذا ليس من الضروري العمل على الثلج.

بعد تحضير تفاعل PCR، ضع أنبوب PCR في جهاز الدورات الحرارية (thermocycler) بدءاً بخطوة تمسخ عند 95 degrees Celsius لمدة 12 دقيقة، تليها 14 دورة تتكون من 95 degrees Celsius لمدة 30 ثانية، و60 degrees Celsius لمدة دقيقة واحدة، و72 degrees Celsius لمدة دقيقة واحدة. وفي نهاية هذه الدورات الـ 14، اضبط خطوة نهائية عند 72 degrees Celsius لمدة خمس دقائق، وبعد ذلك يمكن حفظ أنبوب PCR إلى أجل غير مسمى عند 10 degrees Celsius حتى تصبح جاهزة للاستخدام بعد اكتمال تضخيم PCR، ثم يتم تنقية ناتج PCR باستخدام عمود دوران Kyogen MinLu وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، واستخلاص DNA من العمود باستخدام 50 µL من منظم EB buffer المرفق مع مجموعة MinLu قبل عملية التمديد الأولية والتقاط الناتج.

يجب إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Quantitative PCR) على أجزاء من المكتبات غير المُضخمة والمُضخمة من أجل تقدير كمية وفحص جودة ناتج المكتبة المُضخمة. يجب أن تحتوي المكتبة المُضخمة بـ 14 دورة على كمية من DNA تزيد بعدة آلاف من المرات عن المكتبة الأولية. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فيجب مراجعة ظروف التضخيم وتكرارها.

يجب تصميم بادئات التقاط التمديد الأولية، التي ستُستخدم لالتقاط التسلسلات ذات الأهمية من المكتبة المضخمة، مثل بادئات PCR العادية لتتطابق مع منطقة مستهدفة محددة بدرجة حرارة انصهار مثالية تبلغ 60 °C عند الطرف '5 لكل من هذه التسلسلات المستهدفة وبطول تسلسل ذيل يبلغ 12 قاعدة، مع تضمين بقايا بيوتين عند الطرف '5. يمكن استخدام ما يصل إلى 150 من بادئات PEC معًا في مزيج متعدد (multiplex mix) واحد مُعد من مخزونات بتركيز 200 µM. وبالنسبة لتفاعل التمديد الأولي، قم بتحضير مزيج PCR في أنبوب PCR مناسب عن طريق إضافة 5 µL من منظم GAMP PCR بتركيز 10X، و 5 µL من كلوريد المغنيسيوم، و 1 µL من BSA، و 0.5 µL من DNTP. اخلط 5 µL من مزيج بادئات التقاط التمديد الأولية، و 0.5 µL من Taq gold DNA polymerase، و 2 µL من DNA المكتبة المضخمة عبر 14 دورة، وأخيرًا 31 µL من ماء بدرجة PCR للحصول على حجم إجمالي قدره 50 µL.

إذا كان قالب المكتبة المضخم يحتوي على أكثر من 1 × 10¹² نسخة لكل ميكرولتر، فيجب تخفيف القالب أولاً باستخدام محلول EB المنظم بحيث لا يتم إضافة أكثر من 2 × 10¹² نسخة إلى خليط التفاعل. بعد تحضير أنبوب PCR، وضعه في جهاز الدورات الحرارية وضبطه لدورة تفاعل واحدة. تبدأ العملية بمرحلة مسخ لمدة 12 دقيقة عند 95 °C، تليها مرحلة عند 60 °C لمدة دقيقة واحدة، ثم خمس دقائق عند 72 °C للتمديد الأولي.

وعند انتهاء الدورة الواحدة، يتم التثبيت عند 72 درجة Celsius للحفاظ على ناتج PCR حتى الخطوة التالية. ولتجنب الارتباط غير النوعي للبادئات (primer annealing) والالتقاط المباشر، قم بإضافة 150 µL من محلول PBI أو PB buffer من طقم تنقية Kyogen Ute إلى أنابيب تفاعل PCR، بينما لا يزال خليط التفاعل داخل الجهاز الحراري (thermocycler) عند درجة حرارة 72 درجة Celsius. تؤدي هذه الخطوة إلى تثبيط إنزيم البوليميراز بينما تكون درجة الحرارة مرتفعة جداً بحيث تمنع الامتداد غير النوعي للبادئات المستهدفة؛ أغلق الأنابيب، وقم برجها باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex) لفترة وجيزة، ثم قم بترسيب السائل باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي.

استخدم محلول PBI أو محلول PB المنظم فقط في هذه الخطوة، حيث أن محاليل الربط الأخرى مثل محلول Qiagen PM المنظم قد تتداخل مع عملية الالتقاط اللاحقة. بعد ذلك، قم بإزالة الخليط من أنبوب PCR وانقله إلى عمود طرد مركزي من نوع Rogen MinLu للتنقية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة كما تم القيام به سابقاً، ثم استخلص الـ DNA من العمود باستخدام 30 µL من محلول EB المنظم المرفق مع مجموعة MinLu. ومن أجل إزالة جميع الشظايا التي لم تلتصق ببادئات PEC، يتم إجراء خطوة التقاط تعتمد على الخرزات.

أولاً، قم بإعادة تعليق المحلول المخزون من حبيبات M 270 strip divide عن طريق الرج الميكانيكي (vortexing)، ثم اسحب كمية من الحبيبات تعادل 25 µL لكل عينة. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 500 µL من محلول 2x BW buffer، ثم أعد تعليقها في حجم من محلول 2x BW مساوٍ لحجم الحبيبات الذي تم سحبه في البداية. جهز 25 µL من هذا المعلق.

لكل عينة، أضف 25 µL من الحمض النووي DNA المُنقّى والمستخلص إلى 25 µL من معلق الخرزات، مع الاحتفاظ بخمسة µL المتبقية للتقدير الكمي لاحقاً. اخلط الـ DNA ومعلق الخرزات عن طريق السحب والطرد بالماصة والتحريك برأس الماصة، ثم قم بتدويرهما ببطء على جهاز تدوير مختبري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الخلط، انقل المحتويات إلى أنبوب PCR جديد سعة 1.5 mL.

خلال خطوة الحضن مع التدوير السابقة، قد يكون بعض الحمض النووي غير المستهدف قد التصق بجدار الأنبوب. لذا، فإن نقل معلق الخرزات إلى أنبوب جديد يتجنب احتمالية تحرر هذا الحمض النووي غير المستهدف في النواتج النهائية. خلال خطوة الاستخلاص الحراري، استخدم مجمع الجسيمات المغناطيسية لترسيب الخرزات، وبعد مرور 10 إلى 20 ثانية، ستكون جميع الخرزات قد انتقلت إلى الجدار، تاركةً طافياً رائقاً (SUP) يجب إزالته لغسل الخرزات، ثم أضف 500 µL من منظم BW بتركيز 1x إلى الأنبوب وقم بالرج بواسطة جهاز الفورتيكس لمدة ثلاث ثوانٍ تقريباً بسرعة بطيئة.

عند وضع الأنبوب بشكل رأسي ومرة أخرى عند قلبه، يجب ألا تتبقى أي خرزات ملتصقة بجدار الأنبوب. باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بتدوير المعلق لمدة تتراوح بين ثانية واحدة إلى ثلاث ثوانٍ، وهي فترة كافية لسحب جميع السوائل من جدران الأنبوب. أعد الأنبوب إلى جهاز MPC وانتظر من 10 إلى 20 ثانية حتى يتم تجميع كل الخرزات عند جانب الأنبوب.

ثم قم بإزالة السائل الطافي (SUP). وبذلك تكون عملية الغسل الأولى قد اكتملت. كرر هذا الإجراء أربع مرات إضافية، تليها عملية غسل واحدة بـ BW وإزالة السائل الطافي.

أضف 500 µL من محلول الغسل الساخن (hot wash buffer) بتركيز 1x. اخلط المعلق عن طريق استخدام جهاز الرج الدوامي (vortexing) لفترة وجيزة ثم إجراء عملية الطرد المركزي (spinning down) كما سبق، وبعد ذلك رج الأنبوب لمدة دقيقتين عند 65 °C باستخدام جهاز رج القوالب الحرارية (thermal block shaker) بسرعة 1000 RPM، متبوعاً بعملية طرد مركزي وجيزة لإزالة آثار السائل الطافي خلال دقيقة واحدة من إخراجه من القالب الحراري. ستعمل هذه الخطوة على إزالة الشظايا التي قد ترتبط ببادئات PEC، ولكن لم يتم تمديدها في خطوة تمديد البادئ؛ أعد تعليق الراسب في 30 µL من محلول EB buffer وانقل الخليط إلى أنبوب PCR جديد سعة 1.5 mL.

قم بتحضين الأنبوب في الجهاز الدوري الحراري عند 95 درجة Celsius لمدة ثلاث دقائق. قم بترسيب الحبيبات في مجمّع الجسيمات المغناطيسية. يستغرق الأمر من 10 إلى 20 ثانية حتى يصبح السائل الطافي رائقاً تماماً، ثم انقل السائل الطافي S إلى أنبوب جديد ومسمى.

احرص على عدم نقل أي من الحبيبات. احتفظ بالطبقة الطافية التي تحتوي على المنتج المقتنص من قطع DNA. يمكن التخلص من الحبيبات في هذه المرحلة.

لتضخيم الناتج الذي تم التقاطه، قم بتحضير مزيج PCR بحجم إجمالي قدره 100 microliters كما تم في الجزء الثاني، وطبق نفس ظروف دورات PCR. ومرة أخرى، بعد اكتمال تضخيم الناتج الملتقط بواسطة PCR، اتبع ذلك بالتنقية باستخدام عمود Qiagen Ute spin كما تم سابقاً في القسم الثاني، ثم قم باستخلاص DNA من العمود باستخدام 50 microliters من Eeb Buffer؛ وبذلك يصبح الناتج جاهزاً لتسلسل عالي الإنتاجية. لقد صممنا 574 بادئ PEC لتغطية كامل الجينوم الميتوكوندري لإنسان نياندرتال.

قمنا بتقسيم هذه العينات إلى أربعة مزيج من تعدد الإرسال (multiplex mixes) وجولتين متتاليتين من عملية التقاط التمديد الأولي (primary extension capture) على مكتبات من خمس أحافير لإنسان نيانديرتال من أربعة مواقع عبر أوراسيا يعود تاريخها إلى ما بين 40,000 و70,000 عام، مما نتج عنه ما بين 170,000 و500,000 تسلسل لكل فرد، مع محاذاة النتائج مع تسلسل مرجعي ميتوكوندري. ووجدنا أن إجراء PEC قد أدى إلى إثراء هائل للحمض النووي الميتوكوندري، حيث حقق تغطية كاملة للحمض النووي الميتوكوندري لكل فرد بمتوسط تغطية يتراوح بين 18 و56.3 ضعفاً. وبناءً على هذه النتائج، تمكنا من إنشاء تسلسل جينومي ميتوكوندري كامل وعالي الجودة لكل فرد.

قمنا بعد ذلك بإجراء مقارنة تطورية لهذه التسلسلات مع عينة عالمية من البشر الحاليين وأقرب أقربائنا الأحياء، وهم الشمبانزي والبونوبو. وقد أكد ذلك النتائج السابقة بأن الحمض النووي الميتوكوندري لإنسان النياندرتال وثيق الصلة بالحمض النووي للبشر المعاصرين، ولكنه متميز عنه بوضوح. علاوة على ذلك، كشفت المقارنة بين تسلسلات النياندرتال نفسها عن تنوع جيني منخفض للغاية لدى النياندرتال، وهو أقل منه لدى البشر في جميع أنحاء العالم اليوم، ومماثل لسكان أوروبا في الوقت الحاضر.

تشير هذه الأدلة، مقترنة بتحليل تطور البروتين في تسلسلات إنسان النياندرتال، إلى أن مجموعات النياندرتال كانت ذات حجم سكاني منخفض على المدى الطويل، وهو ما يتفق مع الأدلة الأثرية التي تشير إلى أن الكثافة السكانية للنياندرتال لم تصل قط إلى المستويات التي حققها البشر المعاصرون. لقد شرحنا لكم للتو كيفية إجراء عملية التقاط التمديد في الرئيسيات لتضخيم والتقاط التسلسلات المستهدفة تمهيداً للتسلسل عالي الإنتاجية. عند اتباع هذا الإجراء، من المهم الالتزام بجميع مواصفات درجة الحرارة في جهاز الدورات الحرارية، مع مراعاة أن البادئات قد تختلف في درجات حرارة الارتباط، لذا قد تضطر إلى ضبط درجة حرارة الارتباط لتناسب بادئاتك الخاصة، والحرص خلال جميع خطوات الغسيل على إزالة أكبر قدر ممكن من السائل.

شكراً لكم على المشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.