تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

تبدأ العملية التدريجية لتغليف الخلايا بتحضير وتعقيم قوالب الهيدروجيل والمواد الأخرى، يلي ذلك عزل الخلايا إلى مجموعات فردية في أنابيب مخصصة لكل مجموعة من الهلام. ثم يتم إجراء عملية التغليف في وجود الخلايا، تليها فترة الحضانة سواء في المختبر (in vitro) أو داخل الجسم الحي (in vivo). وقد تشمل التحليلات اللاحقة لسلوك الخلايا اختبارات الحيوية، والشكل الظاهري، والتكاثر، والتمايز.

مرحباً، أنا أميديو كاهان من مختبر الدكتور جيسون بيرديك في قسم الهندسة الحيوية بجامعة بنسلفانيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتغليف الخلوي في الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد (3D hydrogels) لأغراض هندسة الأنسجة. نستخدم هذا الإجراء لدراسة تأثيرات تركيب وبنية الهيدروجيل على سلوك الخلايا المغلفة.

لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير محلول بتركيز 0.5% وزناً من البادئ الضوئي air cure 2 9 5 9 أو I 2 9 5 9 في PBS. اخلط المحلول وحضنه لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في الظلام عند 37 درجة مئوية.

عندما تصبح جاهزاً، استخدم مرشح حقنة لتعقيم المحلول وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استخدم برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel لحساب كمية البوليمر والرابط التشابكي المطلوبة كما هو موضح. يظهر هنا حمض الهيالورونيك الوظيفي بمجموعات أكريلات تفاعلية.

قم أيضاً بحساب كمية الببتيد المتدلي الذي يحتوي على النطاق اللاصق الوظيفي والمكون من الأحماض الأمينية cystine وarginine وglycine وaspartate. يُستخدم الـ cystine للربط بالبوليمر. بعد تحديد الكميات المطلوبة من رابط البوليمر المتقاطع والببتيد، قم بوزنها ووضع كل منها في أنبوب einor.

قم بتعديل جدول بيانات الحسابات وفقاً لذلك. وبالنسبة للكتلة الفعلية للبوليمر التي تم الحصول عليها، انتقل إلى تحضير قوالب الهلام. استخدم شفرة حلاقة لقص أطراف الأنابيب المعقمة المغلفة بشكل فردي.

محاقن تستخدم لمرة واحدة بسعة 1 مل. تأكد من إجراء قطع مستوٍ للقوالب التي ستُستخدم لإنشاء النمط الضوئي للهلامات. وأخيرًا، قم بتعقيم قوالب المحاقن وأنابيب EOR مع ترك أغطيتها مفتوحة وأي مواد ضرورية أخرى عن طريق وضعها تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم مدمج في كابينة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.

بمجرد اكتمال عملية التعقيم، ابدأ في تحضير الخلايا بعد تعقيم المعدات التجريبية. قم بالعمل داخل كبينة التدفق الصفحي وأضف TEA المعقم إلى البوليمر المستخدم في الربط التشابكي من النوع الميكالي، وأضف PBS المعقم إلى البوليمر المستخدم في الربط التشابكي بالجذور الحرة. أضف المنظم المطابق إلى أنابيب الشق المعلق وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس.

لإذابة الجزء المتدلي الذي يرتبط بحمض الهيالورونيك المألكل عبر ثيول من مجموعة INE الموجودة على الببتيد لتثبيت الجزء المتدلي بالبوليمر، أضفه إلى محلول البوليمر وأغلقه بإحكام. باختصار، يتم الرج باستخدام جهاز الفورتكس والحضن عند 37 درجة مئوية مع التقليب. أثناء عملية تثبيت الجزء المتدلي، يتم تحضير الخلايا المراد تغليفها، سواء كانت خلايا جذعية ميزنكيمية بشرية أو HMCs، عن طريق غسلها بـ PBS.

بعد ذلك، يتم التحضين مع trypsin لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يُزال trypsin ويُحضن العينة لمدة خمس دقائق إضافية عند 37 درجة. ثم يُضاف وسط نمو HMSC لمعادلة trypsin وتحرير الخلايا من سطح الطبق. تُعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

قم بتقسيم الخلايا التي تم عدّها إلى أجزاء تحتوي على العدد المناسب لكل مجموعة من الهلامات. بالنسبة لمجموعة مكونة من ثلاثة هلامات بحجم 50 µL وبكثافة 10 مليون خلية لكل mL، قم بفصل 1.5 مليون خلية في أنبوب مخروطي فردي. لا تقم بتحضير أكثر من أربعة هلامات في المجموعة الواحدة بسبب توقيت العملية.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 RCF لمدة ست دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، وأثناء عملية الترسيب بالطرد المركزي للخلايا، قم بتحضير خليط البلمرة لربط mical edition التشابكي. أضف المنظم إلى عامل الربط التشابكي للوصول إلى التركيز المناسب.

بالنسبة للربط التشابكي للجذور الحرة المستحث بالضوء، أضف محلول I 2 9 5 9 الذي تم تحضيره مسبقاً إلى محلول البوليمر. بنسبة 10% من إجمالي حجم إعداد الهلام للحصول على تركيز نهائي للمبادئ يبلغ 0.05% وزناً. الآن أصبحت الخلايا ومزيج البلمرة جاهزة للتغليف داخل الهيدروجيل.

ابدأ بشفط السائل الطافي من الخلايا التي تم طردها مركزياً. انتظر حتى يهدأ السائل بعد عملية الشفط الأولية، ثم أعد الشفط لإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الغذائي دون تشتيت كتلة الخلايا المترسبة. قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا باستخدام محلول البوليمر لتجنب تكون فقاعات هوائية.

قم بسحب المحلول وإطلاقه ببطء باستخدام الماصة حوالي 10 مرات، وهو ما ينبغي أن يكون كافياً لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ. بالنسبة لتفاعل الإضافة من النوع الميكالي (mical)، استخدم رأس ماصة بفتحة واسعة لإضافة الحجم المناسب من محلول الربط التشابكي إلى خلية البوليمر. اخلط المكونات. اضبط الماصة على الحجم المطلوب لكل هلام فردي.

قم بسحب المحلول وإطلاقه بالماصة لضمان التجانس، ثم وزعه في قوالب طرف السرنجة. نفذ هذه الخطوة بسرعة لضمان توزيع الخلايا بشكل متساوٍ، واتركها للحضانة لمدة تتراوح بين 10 إلى 30 دقيقة داخل غطاء المزارع الخلوية لإتمام عملية التشبيك. وبالنسبة للتشبيك بالجذور الحرة المحفز بالضوء.

قم بتوزيع الحجم المناسب في قوالب رؤوس المحاقن. وعرّض المحاقن للأشعة فوق البنفسجية لإحداث التشبيك الجذري من خلال التعرض لمدة 10 دقائق لطول موجي 365 nanometer. ويعد استخدام الأشعة فوق البنفسجية بكثافة 4 milliwatts per centimeter squared شائعاً للبوليمرات الوظيفية من نوع ACRL.

قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتقليل ترسب الخلايا قبل التعريض للأشعة فوق البنفسجية UV. بعد عملية الربط التشابكي، اغمر الهلامات (gels) في فجوات طبق زراعة أنسجة يحتوي على أوساط مغذية لغرض الحضن والتحليل. كما يمكن إجراء الربط التشابكي للهيدروجيل بشكل متسلسل.

أولاً، أضف الصبغة الوظيفية metholated rumine لتصل إلى تركيز نهائي قدره 20 nanomolar في الهلام. تساعد هذه الصبغة في تصور النمط لأنها تندمج بشكل تفضيلي في المناطق ذات الروابط التشابكية الجذرية في الهلام. ثم ابدأ بتفاعل بلمرة من نوع mic الذي ينتج جزءاً من الروابط التشابكية النظرية لما يلي.

في عملية التشبيك بالجذور الحرة، سيتعين استخدام قناع مُصمم ببرنامج مثل Adobe Photoshop أو Illustrator ومطبوع مباشرة على أقنعة شفافة. يجب أن تتطابق أبعاد القناع مع الجزء العلوي المستدير للمحقنة. استخدم ملقطاً معقماً لوضع قناع معقم مباشرة على سطح الهلام، ثم عرّضه للضوء لإتمام عملية تشبيك الهلام.

يظهر هنا أيضاً خلايا HMCs داخل هيدروجيلات تعتمد على HA بعد ساعة واحدة من التغليف. ونظراً لأن الهيدروجيلات المُصنعة تكون شفافة عادةً، فإنه يمكن تصور الخلايا من حيث المورفولوجيا باستخدام المجهر الضوئي. وقد تم تصور الخلايا ذاتها لتقييم الحيوية بعد 24 ساعة من التغليف باستخدام مجموعة صبغ الفلورسنت للخلايا الحية والميتة.

استخدمنا calcium M للكشف عن الخلايا الحية وatherium homodimer للخلايا الميتة، ولوحظ أن نسبة الحيوية كانت أكبر من 95%. كما استخدمنا مقايسة alamar blue لتحديد مستوى تكاثر الخلايا، والذي يتم قياسه من خلال مدى قدرة الخلايا على استقلاب كاشف المقايسة، مما يؤدي إلى تغيير في اللون. تم إجراء صبغ الخلايا على H HMCs بعد سبعة أيام من التغليف داخل هيدروجيل قائم على HA، وهو هيدروجيل قابل للتحلل ولاصق، وذلك باستخدام إجراءات التثبيت والنفاذية القياسية.

يمكن رؤية خيوط الأكتين الخلوية باستخدام الفالين المسمى بالفلوريسين، بينما يتم تحديد النوى باستخدام dpi. ويُستخدم التصبيغ المناعي ضد cullin لتصوير الالتصاقات البؤرية داخل مصفوفة الهيدروجيل. كما يتم إجراء التصبيغ النسيجي بعد عمليات التجفيف، والتضمين في البارافين، وتقطيع الهيدروجيلات باستخدام البروتوكولات القياسية لهيدروجيلات HA المغلفة بخلايا HMSC والمبلمرة جذرياً.

بعد أسبوع واحد من الزرع، صُبغت العينات بصبغة hemat toin لتمييز النوى، وصبغة ASIN لتمييز النسيج الضام، وأصباغ زرقاء لتمييز الجليكوزامينوجليكانات. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Realtime PCR) لقياس تمايز الخلايا الجذعية المغلفة. بعد طرح الخلفية، يتم تحديد مستوى تعبير الجين المستهدف من خلال رقم الدورة التي تم عندها الوصول إلى عتبة الفلورية مقارنة بإشارة مرجعية سلبية، وهي جين تدبير منزلي نشط بنيوياً. لقد عرضنا لكم الآن كيفية تغليف الخلايا في هيدروجيلات ثلاثية الأبعاد ودراسة سلوك الخلايا داخل هذه الهلامات.

عند استخدام هذه الإجراءات، من المهم ضمان التعقيم الكامل للمواد، إما عن طريق حفظ المحاليل المنظمة والكواشف المعقمة لفترات طويلة أو التعقيم باستخدام مصباح UV المبيد للجراثيم. هذا كل شيء. شكرًا لكم وبالتوفيق في تجاربكم.