تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D
October 26th, 2009
نقدم بروتوكولات للتغليف (3D) 3 الأبعاد للخلايا داخل الهلاميات المائية الاصطناعية. ويرد الإجراء التغليف لمدة الأساليب المستخدمة عادة من يشابك (مايكل وبالإضافة إلى ذلك النوع الخفيف شرعت آليات الجذور الحرة) ، فضلا عن عدد من التقنيات لتقييم السلوك مغلفة الخلية.
تبدأ العملية التدريجية لتغليف الخلايا بتحضير وتعقيم قوالب الهيدروجيل والمواد الأخرى ، متبوعة بعزل الخلايا إلى مجموعات فردية ، في أنابيب لكل مجموعة هلامية. ثم يتم إجراء التكوين في وجود الخلايا ، تليها فترة حضانة في المختبر أو في الجسم الحي. قد يتضمن التحليل النهائي لسلوك الخلية اختبارات للبقاء والتشكل والانتشار والتمايز.
مرحبا أميديو كاهان من مختبر الدكتور جيسون بورديك في قسم الهندسة الحيوية بجامعة بنسلفانيا. سنعرض لك اليوم إجراء للتغليف الخلوي في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد لهندسة الأنسجة. نستخدم هذا الإجراء لدراسة تأثيرات تكوين الهيدروجيل وهيكله على سلوك الخلايا المغلفة.
لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول وزن 0.5٪ من علاج الهواء بادئ الصور 2 9 5 9 أو I 2 9 5 9 في PBS. امزج واحتضن لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في الظلام عند 37 درجة مئوية.
عندما تصبح جاهزا ، استخدم مرشح حقنة لتعقيم المحلول وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel لحساب كمية البوليمر والرابط المتقاطع المطلوب موضحا. هنا يعمل حمض الهيالورونيك مع مجموعات تفاعلية من الأكريلات.
احسب أيضا كمية الببتيد المعلق الذي يحتوي على المجال اللاصق الوظيفي مع الأحماض الأمينية السيستين والأرجينين والجلايسين والأسبارتات. السيستين مخصص للربط بالبوليمر. الآن بعد أن تم تحديد الكميات المطلوبة من البوليمر المتشابك والثقيب ، قم بوزنها ووضع كل منها في أنبوب إينور.
اضبط جدول بيانات الحساب وفقا لذلك. للحصول على الكتلة الفعلية للبوليمر التي تم الحصول عليها ، تابع لإعداد قوالب الجل. استخدم شفرة حلاقة لقطع أطراف المعقمة الملفوفة بشكل فردي.
محاقن واحدة مليلتر يمكن التخلص منها. تأكد من عمل قطع مسطح للقوالب لاستخدامها في نمط الصور إلى المواد الهلامية. أخيرا ، قم بتعقيم قوالب الحقن وأنابيب الاستخلاص المعزز للنفط مع فتح أغطيتها وأي مواد ضرورية أخرى عن طريق وضعها تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم مدمج في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.
بمجرد اكتمال التعقيم ، استمر في تحضير الخلايا بعد تعقيم المعدات التجريبية. اعمل في غطاء المحرك وأضف TEA معقما إلى البوليمر المستخدم في الربط المتقاطع من النوع الميسكي و PBS المعقم إلى البوليمر المستخدم في الربط المتقاطع للجذور الحرة. أضف المخزن المؤقت المطابق إلى أنابيب الشق المعلقة والدوامة.
لإذابة الجزء المعلق يرتبط بحمض الهيالورونيك المؤلكل عبر ثيول من مجموعة INE على الببتيد لربط الجزء المعلق بالبوليمر ، أضفه إلى محلول البوليمر وختمها ببارام. باختصار ، دوامة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الخلط. أثناء تحضير الخلايا ، أثناء ارتباط الجزء المعلق ، قم بإعداد الخلايا ليتم تغليفها أو الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية أو HMCs عن طريق غسلها باستخدام PBS.
ثم احتضن مع التربسين لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة احتضان التربسين لمدة خمس دقائق أخرى عند 37 درجة. ثم أضف وسائط نمو HMSC لتحييد التربسين وتحرير الخلايا من سطح اللوحة. عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.
افصل الخلايا التي تم عدها إلى أجزاء تحتوي على العدد المناسب لكل مجموعة من المواد الهلامية. بالنسبة لمجموعة من ثلاثة مواد هلامية سعة 50 ميكرولتر بكثافة 10 ملايين خلية لكل مليلتر ، افصل 1.5 مليون خلية في أنبوب مخروطي فردي. لا تحضر أكثر من أربعة مواد هلامية في مجموعة فردية بسبب توقيت التحضير.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 RCF لمدة ست دقائق. في درجة حرارة الغرفة أثناء دوران الخلايا لأسفل ، قم بإعداد مزيج البلمرة للتشابك في إصدار الميكروفونية. أضف المخزن المؤقت إلى الرابط المتقاطع لتحقيق التركيز المناسب.
بالنسبة للتشابك المتبادل للجذور الحرة التي تبدأ بالضوء ، أضف محلول I 2 9 5 9 المعد مسبقا إلى محلول البوليمر. عند 10٪ من إجمالي حجم مجموعة الهلام لتركيز بادئ نهائي يبلغ 0.05٪ من الوزن. الآن الخلايا ومزيج البلمرة جاهزان للتغليف في الهيدروجيل.
ابدأ بشفط snat من خلايا الطرد المركزي. انتظر حتى يستقر السائل بعد الشفط الأولي وأعد الشفط لإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط دون تعطيل الخلية بيليه ريسوس. قم بتعليق حبيبات الخلية بمحلول البوليمر لمنع فقاعات الهواء.
قم بسحب المحلول ببطء لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات ، والتي يجب أن تكون كافية لتوزيع الخلايا بالتساوي. بالنسبة لتفاعل الإضافة من النوع الميسري، استخدم طرف ماصة فتحة عريضة لإضافة الحجم المناسب من محلول الربط المتقاطع إلى خلية البوليمر. امزج. اضبط الماصة على حجم الهلام الفردي المطلوب.
ماصة المحلول لأعلى ولأسفل للتجانس و Eloqua في قوالب طرف المحقنة. قم بتنفيذ الخطوة بسرعة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا والسماح بالحضانة لمدة 10 إلى 30 دقيقة في غطاء المزرعة للربط المتقاطع. للضوء بدأ الجذور الحرة عبر الارتباط.
اقتبس الحجم المناسب في قوالب طرف المحقنة. قم بتعريض المحاقن للأشعة فوق البنفسجية للربط المتبادل الجذري لمدة 10 دقائق إلى 365 نانومتر. أربعة مللي واط لكل سنتيمتر مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية شائع للبوليمرات الوظيفية ACRL.
قم بتنفيذ الخطوة بسرعة لتقليل استقرار الخلية قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية. بعد الربط المتقاطع ، اغمر المواد الهلامية في آبار صفيحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسائط للحضانة والتحليل. يمكن أيضا إجراء الربط المتقاطع للهيدروجيل بالتتابع.
أولا ، أضف الروم الميثوليد الصبغي الوظيفي إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانومولار في الجل. تساعد الصبغة في تصور الزخرفة لأنها تدمج بشكل تفضيلي في المناطق المتشابكة جذريا من الجل. ثم ابدأ بتفاعل البلمرة من نوع الميكروفون الذي ينتج عنه جزء بسيط من الروابط المتقاطعة النظرية لما يلي.
سيحتاج المرء إلى استخدامقناع مصمم في برنامج مثل Adobe Photoshop أو Illustrator وطباعته مباشرة على أقنعة الشفافية. يجب أن تتطابق أبعاد القناع مع الجزء العلوي من المحقنة المستديرة. استخدم ملاقط معقمة لوضع قناع معقم مباشرة على سطح الجل وتعريضه للضوء لربط الجل
.كما يظهر هنا HMCs داخل الهلاميات المائية القائمة على HA بعد ساعة واحدة من التغليف. نظرا لأن الهلاميات المائية المركبة عادة ما تكون شفافة ، يمكن تصور الخلايا للتشكل باستخدام الفحص المجهري الضوئي. تم تصور نفس الخلايا من أجل البقاء بعد 24 ساعة من التغليف باستخدام مجموعة تلطيخ الميت الحي الفلوري.
استخدمنا الكالسيوم M للكشف عن الخلايا الحية ومثلي الأثيريوم للخلايا الميتة ولاحظنا قدرة أكبر على 95٪ من البقاء. استخدمنا أيضا اختبار ألامار الأزرق لتحديد مستوى تكاثر الخلايا المقاس بمدى جودة استقلاب الخلايا لكاشف الفحص مما يؤدي إلى تغيير اللون. تم إجراء تلطيخ الخلايا على H HMCs بعد سبعة أيام من التغليف داخل هيدروجيل قابل للتحلل ولاصق قائم على HA وباستخدام إجراءات التثبيت القياسية والنفاذية.
يمكن رؤية الأكتون الخلوي باستخدام الفلورسين المسمى فين والنوى المقيدة بنقطة في البوصة. يستخدم التلوين المناعي ضد الكولين لتصور الالتصاقات البؤرية داخل مصفوفة الهيدروجيل. يتم إجراء التلوين النسيجي بعد الجفاف وتضمين البارافين وتقطيع الهلاميات المائية باستخدام البروتوكولات القياسية المبلمرة جذريا HMSC المغلفة بهيدروجيل هيدرولاري.
بعد أسبوع واحد في الثقافة, تم تلطيخها مع hemat toin علامات على النوى و ASIN بمناسبة النسيج الضام A والبقع الزرقاء للجليكوزامينوجليكان. الوقت الحقيقي. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد تمايز الخلايا الجذعية المغلفة بعد طرح الخلفية ، يتم تحديد مستوى التعبير عن الجين محل الاهتمام من خلال رقم الدورة حيث تم الوصول إلى التألق العتبة مقارنة بإشارة مرجعية سلبية ، وهو جين التدبير المنزلي النشط بشكل أساسي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تغليف الخلايا في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد ودراسة سلوك الخلايا في المواد الهلامية.
عند استخدام هذه الإجراءات ، من المهم ضمان مواد العقم الكاملة ، إما عن طريق الحفاظ على المحاليل العازلة والكواشف المعقمة على المدى الطويل أو التعقيم باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم. هذا كل شيء. شكرا على الغسيل ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.
الموجز
تقدم هذه المقالة بروتوكولات لتغليف الخلايا ثلاثي الأبعاد داخل المواد الهلامية الاصطناعية، وتفصيلاً للطرق المستخدمة في التشابك وتقدير سلوك الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الهندسة الحيوية
- هندسة الأنسجة
الخلفية
- إن تغليف الخلايا ثلاثي الأبعاد أمر بالغ الأهمية لتطبيقات هندسة الأنسجة.
- توفر المواد الهلامية بيئة داعمة لنمو الخلايا وتمايزها.
- يمكن أن تؤثر طرق التشابك المختلفة على سلوك الخلايا.
- فهم هذه الطرق يمكن أن يعزز استراتيجيات هندسة الأنسجة.
هدف الدراسة
- لتحديد إجراءات تغليف الخلايا في المواد الهلامية.
- لمقارنة تقنيات التشابك المختلفة.
- لتقييم سلوك الخلايا المغلفة في ظروف مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير وتعقيم قوالب المواد الهلامية.
- عزلة وتحضير مجموعات الخلايا.
- التشابك باستخدام إضافة من نوع مايكل وآليات الجذور الحرة التي تبدأ بالضوء.
- التحليل اللاحق لقابلية الخلايا للحياة، والشكل، والانتشار، والتمايز.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق تغليف ناجح للخلايا في المواد الهلامية.
- أثرت طرق التشابك المختلفة على سلوك الخلايا.
- تم تقييم قابلية الخلايا المغلفة للحياة وشكلها.
- تبين أن تركيبة وهيكل المادة الهلامية يؤثران على النتائج.
الاستنتاجات
- يمكن استخدام البروتوكولات المنشأة لمختلف تطبيقات هندسة الأنسجة.
- فهم تأثيرات التشابك أمر حيوي لتحسين سلوك الخلايا.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لتعزيز تقنيات هندسة الأنسجة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
