رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

تُعد ذبابة الفاكهة (Drosophila) جذابة وراثياً لدراسات تطور ووظيفة القلب ونشاط منظم ضربات القلب الكامن. يوضح هذا الإجراء كيفية تحضير اليرقات السليمة والمشرحة، وكيفية مراقبة معدل ضربات القلب. كما تتيح العينة المشرحة تسجيل الجهود خارج الخلوية أو داخل الخلوية لمزيد من دراسة وظيفة القنوات الأيونية.

مرحباً، أنا روبن كوبر، عضو هيئة التدريس في قسم الأحياء بجامعة كنتاكي. سيقوم طلابي، آن كوبر، وكايلا ريمان، ومات وارد، وإيستر بوكو، اليوم بعرض إجراءات متنوعة لمراقبة معدل ضربات القلب في يرقات Drosophila. تُسمى الطريقة التالية غير المقيدة بـ "مزرعة النمل" لأن اليرقات يتم تصورها ضمن مستوى بؤري واحد.

لتحقيق أفضل رؤية ليرقات، استخدم مجهراً تشريحياً بعدسة شيئية أساسية بقوة 2x وعدسة أنبوبية بقوة 0.5x للحصول على أفضل دقة مكانية وتكبير فوق مستطيل بمساحة 1 سنتيمتر في 0.5 سنتيمتر. يمكن تسجيل الصور ومقاطع الفيديو من خلال كاميرا مثبتة على حامل عينية. لبدء هذه الطريقة، ضع اليرقة بين شريحتين زجاجيتين مع طبقة رقيقة من الغذاء.

يتم تثبيت الشرائح بمسافة تتراوح من 1 إلى 1.5 مليمتر باستخدام فواصل بلاستيكية على جميع الجوانب الأربعة. قم بإمالة التحضير بزاوية تتراوح بين 20 و45 درجة لعدة دقائق لتحفيز اليرقة على إبقاء رأسها موجهاً للأسفل. اضبط مرآة المجهر لتحقيق أفضل تباين للقلب أو القصبتين الهوائيتين لمراقبة ضربات القلب.

تعد طريقة الغراء وسيلة تثبيت دائمة لتقييد اليرقات على شريحة زجاجية. لبدء طريقة الغراء، ضع غطاء شريحة نظيفاً فوق شريحة زجاجية، ثم ضع قطرة صغيرة من الغراء القوي (super glue) على أحد أركان غطاء الشريحة.

بعد ذلك، اشطف اليرقات بالماء. ولإزالة الطعام الزائد، امتص السائل باستخدام منديل ورقي أو زاوية من منشفة ورقية. وبمجرد شطف اليرقة جيداً، التقطها برفق باستخدام ملقط نظيف وضعها على الشريحة بعيداً عن غطاء الشريحة تحت المجهر، مع توجيه اليرقة بحيث تكون على بطنها.

ستظهر على المعدة أخاديد أفقية باهتة تمتد على طولها مع وجود شعيرات سوداء دقيقة. يجب أن يكون ظهر اليرقات متجهًا للأعلى ويتميز بخطين متوازيين، وهما القصبات الهوائية. باستخدام مجموعة ثانية من الملاقط المخصصة حصريًا للتعامل مع الغراء، خذ كمية صغيرة من القطرة الموجودة في نهاية الشريحة وضعها عند الزاوية في الجانب المقابل.

استخدم كمية ضئيلة تكفي فقط لتغطية رأس الملقط. التقط الحيوان وضعه على الغراء مع التأكد من بقاء الجانب البطني للأسفل في الفتحة السوداء.

يجب أن تكون الخطافات عند حافة غطاء الشريحة أو بالقرب منها، وكذلك خطافات الفم واللولب البني. يجب ألا تلامس الغراء. اضغط برفق على اليرقة لتسطيحها.

لتطبيق المادة المختبرة، يُفضل توزيع قطرات صغيرة باستخدام حقنة بالقرب من رأس اليرقة. يتم رصد معدل ضربات القلب عن طريق عد عدد مرات نبض الحلزونات في الدقيقة الواحدة. ولإجراء ملاحظات لفترات أطول، يمكن تغذية اليرقات في مكانها وترطيبها لمنع الجفاف. ولإعداد شريحة تشريح صالحة للاستخدام تحت المجهر، استخدم مشرطاً لعمل ثقب بقطر 2 cm في مركز قطعة من الشريط المغناطيسي، ثم ألصقها على شريحة زجاجية.

استخدم دبابيس التشريح التي تم ثنيها ولصقها بمشابك ورقية لتسهيل عملية التثبيت. وأثناء التشريح، ضع يرقة من المرحلة الثالثة سليمة من نوع star larvae على لوح التشريح. عند وضع الجانب الظهري للأعلى، يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية من خلال القشيرة.

ضع دبوسين في اليرقات على كلا الجانبين من كلاليب الفم، ودبوسين آخرين على كلا الجانبين من الحلزونات. بعد ذلك، أضف المحلول الملحي للحفاظ على رطوبة اليرقات. ثم قم بإجراء شق أفقي عند الطرف الخلفي، يليه قطع طولي يستمر بجانب الحلزونات باتجاه رأس الحيوان.

ارفع دبوساً ظهرياً واحداً وقم بتعليقه أسفل القشيرة. استخدم الدبوس للتوسيع. افتح تجويف الجسم.

كرر العملية مع الدبابيس الثلاثة الأخرى. بمجرد تثبيت الحيوان مفتوحاً بالدبابيس، قم بإزالة الأحشاء مع الحرص على عدم إتلاف القصبة الهوائية أو القلب. ترتبط بعض التراكيب، بما في ذلك الدماغ وبعض الأجسام الدهنية، بالقلب، ومن شأن إزالتها أن تؤدي إلى إتلافه.

اترك المستحضر ليرتاح في حمام من محلول HL three الملحي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق بعد التشريح، وتُجرى التسجيلات داخل الخلوية والمجالية في هذا المستحضر أثناء تطبيق العوامل الدوائية مباشرة على القلب. يستغرق إجمالي وقت خطوة التشريح هذه من ثلاث إلى ست دقائق. لإجراء التحفيز الكهربائي، يجب أولاً تجهيز أقطاب بؤرية؛ ولصنع قطب بؤري، يتم تمرير قطب زجاجي فوق عنصر تسخين لإجراء الصقل الناري ولعمل ثني تدريجي بزاوية 45 درجة تقريباً، ثم يتم تركيب القطب البؤري المملوء بمحلول HL three الملحي بدرجة حرارة الغرفة في جهاز التحكم مع توجيه الطرف إلى الأسفل.

تأكد من أن سلك المحفز يلامس المحلول الملحي داخل القطب الكهربائي وأن المحفز متوقف عن العمل. قم بتثبيت تحضيرة تشريح قلب حديثة على المجهر. ضع سلك التأريض في المحلول الملحي.

مع الحرص على عدم لمس الدبابيس أو تعكير التحضير. حافظ على التركيز على القطب الكهربائي أثناء استخدام المنسق لتحريكه للأسفل داخل المحلول الملحي. وبمجرد وصوله إلى المحلول الملحي، قم بوضع طرف القطب الكهربائي بحيث يكون التجويف مسطحاً مقابل القلب ويلامسه بخفة.

بمجرد وضع القطب الكهربائي في موضعه، اضبط تردد المحفز على 2 hertz مع ضبط الجهد عند أدنى إعداد له. قم بتشغيل المحفز. اضبط التردد ليكون حوالي 3 hertz وزد الجهد ببطء حتى تزداد سرعة ضربات القلب لتتطابق مع إيقاع المحفز.

يمكن الآن التحكم في النظم عن طريق المحفز. كما يمكن إضافة مركبات لمعرفة ما إذا كانت تؤثر على الانقباض أو التوصيل الكهربائي. ولإجراء تسجيلات الجهد الميداني، املأ قطب تسجيل الرقعة الكبيرة (macro patch) بالوسط الاستحمامي وثبته في أداة تحكم على مجهر مركب.

قم بتوصيل القطب الكهربائي بمضخم صوت وجهاز تسجيل. استخدم الملاعب (manipulator) لخفض تجويف القطب الكهربائي فوق قلب تحضير تشريحي مثبت في المجهر. لامس القلب برفق شديد باستخدام طرف القطب الكهربائي.

يمكن الآن إجراء تسجيلات ميدانية لتسجيل الجهود الميدانية من منطقة أخرى في القلب. ارفع طرف القطب الكهربائي برفق وحركه إلى منطقة جديدة باستخدام وحدة التحكم، ثم أعد خفض الطرف لبدء تسجيلات الجهد الميداني. اسمح بالمراقبة الدقيقة لمعدل ومدة الإشارات الكهربائية في القلب لقياس جهود الغشاء عبر الخلايا العضلية القلبية لليرقات.

أولاً، تأكد من أن تجويف قطب كهربائي حاد مملوء بـ 3 molar potassium chloride مسطح مقابل القلب بزاوية 45 درجة تقريباً من الوضع العمودي. وبمجرد تحديد الموضع بشكل صحيح، المس القلب برفق بطرف القطب الكهربائي ثم انقر بالطرف ليدخل في خلية. يمكن استخدام القطب الكهربائي مرة أخرى إذا لم يكن مكسوراً.

تسمح التسجيلات داخل الخلوية بقياس الأساس الأيوني لجهد الفعل والأشكال المميزة للجهود لفحص تأثيرات طفرات القنوات الأيونية أو معدلات القنوات. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تسجيلات القلب، بالإضافة إلى كيفية أخذ الجهود داخل الخلوية والجهود الميدانية. يمكنكم استخدام هذه التقنيات لدراسة التغيرات القلبية، وكذلك التدخلات الدوائية والتعديلات الجينية.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم عدم سحب أي بنية مرتبطة ومتصلة بالقلب، أو الضغط بقوة زائدة باستخدام القطب البؤري. كذلك، عند استخدام طريقة الغراء، يجب الحرص على عدم لصق الفم أو الكرة بحيث تُغلق. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، مع تمنياتنا بالتوفيق في تجاربكم.