Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف
نوفمبر 4, 2009
وكميا عينات Microvolume بواسطة نظام يستخدم معمل الطبيعية التوتر السطحي للاحتفاظ عينات من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. وزيادة كبيرة في مجموعة ديناميكية من تركيزات البروتين والسرعة التي يمكن قياسها مع هذا الأسلوب.
تقنية NanoDrop بين الألياف الضوئية والتوتر السطحي لاحتفاظ وقياس كميات صغيرة من العينات مثل الأحماض النووية والبروتينات. يتم سحب قطرة صغيرة من العينة مباشرة على قاعدة التمثال السفلية. ثم تقوم قاعدة التمثال العلوية بإشراك العينة لتشكيل عمود.
تتحرك قاعدة التمثال تلقائيا لضبط طول المسار الأمثل. يؤدي تقصير طول المسار إلى التخلص من الحاجة إلى إجراء التخفيفات لمعظم عينات البروتين ، ويحدث القياس في ثوان ويتم عرض نتائج الطيف. مرحبا ، أنا لين كالهورن في مختبرات NanoDrop التابعة لشركة Thermo Fisher Scientific.
سنعرض اليوم إجراء لتحديد تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير المبتكر. يستخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 C NanoDrop 2000 C نظاما مبتكرا للاحتفاظ بالعينات يعتمد على التوتر السطحي للسوائل لحمل وقياس عينات الحجم الصغير بين قاعدتين بصريتين دون استخدام الكوفيت أو الشعيرات الدموية. يتم وضع عينة الميكروس مباشرة فوق سطح الكشف ، ويتم إنشاء عمود سائل بين نهايات الألياف الضوئية عن طريق التوتر السطحي.
يشكل هذا العمود السائل مسارا بصريا رأسيا. يوفر مصباح فلاش الزينون مصدر الضوء ويتم استخدام مقياس طيف يستخدم مصفوفة CCD خطية لتحليل الضوء الذي يمر عبر العينة. تتميز إزالة أجهزة الاحتواء التقليدية مثل الكوفيت من النظام بالعديد من المزايا.
هناك حاجة إلى كميات صغيرة جدا من العينة للقياس. يتطلب تنظيف واحد إلى اثنين من الميكرولتر ببساطة مسح الأسطح البصرية بمسح مختبري ويتغير طول المسار تلقائيا في الوقت الفعلي أثناء القياس. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح تقصير طول المسار قياس التركيزات الأعلى ، مما يلغي بشكل فعال الحاجة إلى إجراء التخفيف لمعظم عينات البروتين.
في الحالات التي يكون فيها هناك ما يبرر الطبيب البيطري ، مثل الدراسات الحركية ، يوفر NanoDrop 2000 C خيارا مفيقا في نفس مقياس الطيف الضوئي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، سنستخدم خيار قاعدة التمثال ذات الحجم الصغير لتحديد تركيز البروتين. طريقة البروتين A two 80 قابلة للتطبيق على البروتينات المنقاة التي تحتوي على التربتوفان والتيروزين وبقايا ألانين الفينيل أو السيستين ديس روابط الكبريتيد وتظهر امتصاصا عند 280 نانومتر.
لبدء هذا الإجراء ، حدد تطبيق البروتين A two 80 من القائمة الرئيسية. إذا ظهرت نافذة التحقق من الطول الموجي، فتأكد من أن الذراع لأسفل، وحدد نوع العينة المراد قياسها من القائمة المنسدلة. يوصى بالإعداد الافتراضي لمعظم مخاليط البروتين غير المعروفة التي يساوي فيها الامتصاص ملليغراما واحدا لكل مليلتر.
إذا كان قياس بروتين منقى تم تحديده سابقا ، فيمكن إدخال معامل الانقراض الجماعي أو معامل الانقراض المولي. لتحديد تركيز البروتين بشكل أكثر دقة ، اختر وحدات التركيز من القائمة المنسدلة المجاورة للمربع المرمز بالألوان. بعد ذلك ، قم بإنشاء فراغ.
باستخدام مخزن مؤقت مناسب ، من المهم استخدام المخزن المؤقت الذي يتم فيه تعليق البروتين. يجب أن يكون المخزن المؤقت المستخدم من نفس الأس الهيدروجيني وقوة أيونية مماثلة لمحلول العينة. نظرا للتباين في التوتر السطحي بين البروتينات المختلفة ، نوصي بتحميل ميكرولترين من العينات لضمان تكوين العمود بشكل صحيح.
للتحميل، المس طرف الماصة منخفض الاحتباس على سطح قاعدة التمثال السفلي أثناء طرد المحلول لمنع المحلول من الالتصاق بالجزء الخارجي من طرف الماصة، وقم بطرد أقل من الكمية الكاملة من العينة لمنع الانفجار وإدخال الفقاعات في العينة. بمجرد تحميل العينة ، اخفض الذراع ، انقر فوق فارغ. عند اكتمال الطمس ، امسح المحلول الفارغ من الركائز السفلية والعليا.
باستخدام منديل مختبري جاف قبل أخذ حصة للقياس ، من المهم التأكد من أن العينة متجانسة. امزج العينة برفق ولكن جيدا عن طريق دوامة لطيفة باستخدام دورة في الدقيقة متوسطة المستوى لتجنب إدخال الفقاعات الدقيقة في السائل. أدخل نموذج معرف في الحقل المناسب.
قم بتحميل ميكرولترين من العينة الأولى كما هو موضح سابقا للفراغ ، وقم بخفض الذراع وانقر فوق القياس عند اكتمال القياس ، امسح العينة من الركائز السفلية والعليا. باستخدام مناديل معملية جافة ، قم بقياس جميع العينات الأخرى بنفس الطريقة باستخدام كمية جديدة من عينة ميكرولتر لكل قياس. غالبا ما تكون مناديل المختبر العادية الخالية من النسالة كافية لتنظيف الركائز البصرية بين القياسات.
المذيب الوحيد غير المتوافق ويجب عدم استخدامه هو محاليل حمض الهيدروفلوريك والكواشف التي تحتوي على مواد خافضة للتوتر السطحي قد تغير أسطح قاعدة القياس بمرور الوقت مما يمنع تكوين عمود سائل العينة. يشير تسطيح القطرة على قاعدة التمثال السفلية إلى أن السطح البصري أصبح غير مشروط لإعادة التجديد. تقوم أسطح الركيزة إما بتلميعها بقوة باستخدام مناديل معملية أو الطريقة المفضلة هي استخدام مركب إعادة تكييف قاعدة التمثال NanoDrop PR واحد حسب التوجيهات.
إذا كانت العينة عبارة عن محلول بروتيني غير مميز أو محللة خلوية أو مستخلص بروتين خام ، فإننا نوصي باستخدام إحدى طرق قياس الألوان المكونة مسبقا المتوفرة في NanoDrop 2000 C. سيتم عرض اختبار BCA هنا. يتم تضمين الكواشف المطلوبة لمقايسة BCA في مجموعة عوامل تقليل ثقب الترمس العلمية المتوافقة BCA ، والكاشف A و B و C و A والكاشف B ، ومعايير ألبومين مصل الأبقار.
سنستخدم مجموعة الألبومين المخففة مسبقا من بيرس حيث تشير معاييرنا إلى أدبيات بيرس BCA لتحديد معايير الفحص المناسبة لظروفك. لتحضير الكواشف ، قم أولا بموازنة جميع البروتينات غير المعروفة ومعايير البروتين مع درجة حرارة الغرفة واخلطها جيدا عن طريق دوامة لطيفة. استخدم دورة في الدقيقة متوسطة المستوى لتجنب إدخال الفقاعات الدقيقة في السائل.
لأن الفقاعات قد تؤثر سلبا على القراءات. قم بإعداد كاشف عمل جديد كاف للمعايير والعينات المراد قياسها باستخدام نسبة 50 إلى واحدة من الكاشف A إلى B.In هذا المثال ، سنقوم بإعداد ثلاثة ملليلتر من كاشف العمل لتغطية المعايير الخمسة المرجعية وست عينات. يغطي اختبار BCA العادي نطاقا ديناميكيا أوسع ويستخدم نسبة كاشف إلى بروتين من 20 إلى واحد ، في حين أن مقايسة BCA الدقيقة أكثر حساسية ولها نطاق ديناميكي أضيق باستخدام نسبة كاشف واحد إلى واحد إلى بروتين.
نظرا لأننا نجري اختبار BCA العادي ، فسنقوم بإعداد نسبة 20 إلى واحد من كاشف العمل إلى العينة. أضف 190 ميكرولترا من كاشف العمل إلى كل أنبوب مع أنابيب كافية لتغطية جميع العينات والمعايير. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من المعيار أو العينة إلى كل أنبوب من الأنابيب التي تحتوي على كاشف.
تخلط جيدا عن طريق دوامة لطيفة. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اترك التفاعلات تتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.
على عكس طريقة البروتين A two 80 ، تتطلب طريقة البروتين BCA إنشاء منحنى قياسي قبل قياس تركيزات البروتين العينة. لإنشاء منحنى قياسي ، ابدأ بتحديد طريقة بروتين BCA من القائمة الرئيسية. إذا ظهرت نافذة التحقق من الطول الموجي، فتأكد من أن الذراع لأسفل.
أدخل قيم كل تركيز قياسي في جدول الجزء الأيمن. يسمح البرنامج بالرجوع إلى ما يصل إلى سبعة معايير إضافية. يمكن قياس المرجع و / أو المعايير في التكرارات.
قم بإنشاء فراغ باستخدام المخزن المؤقت المناسب. يتم إزالة الأيونات بشكل عام من الفراغ لفحوصات مقياس الألوان. ماصة الماء ميكرولتر من الماء على قاعدة التمثال السفلية وخفض الذراع.
انقر فوق فارغ. لا يلزم سوى فراغ واحد لتغطية جميع القياسات اللاحقة للمرجع والمعايير. قم بإنشاء المرجع عن طريق سحب ماصة Eloqua سعة ميكرولتر من الكاشف العامل فقط والمخزن المؤقت بدون بروتين على قاعدة التمثال السفلية.
اخفض الذراع وانقر فوق القياس. ضمن علامة تبويب المعايير، قم بتمييز المعيار المطلوب وقم بوضع ماصة ميكرولترين من المعيار المطلوب على قاعدة التمثال السفلية. اخفض الذراع وانقر فوق القياس.
كرر العملية لجميع المعايير. لعرض المنحنى القياسي، انقر فوق عرض المنحنى القياسي. بعد قياس جميع المعايير ، انقر فوق الزر العينات.
أدخل معرف العينة ، وقم بتحميل ميكرولترين من العينة على قاعدة التمثال السفلية وانقر فوق القياس. يجب استخدام كمية جديدة من عينة ميكرولتر لكل قياس. عند اكتمال القياس ، امسح العينة من الركائز السفلية والعلوية باستخدام منديل مختبري جاف.
ثم يتم الحصول على النتيجة حيث يتم حساب التركيز النهائي للعينة تلقائيا باستخدام المنحنى القياسي. لقد أظهرنا للتو طريقتين لتحديد تركيز البروتين ، إما عن طريق قياس 80 أو بطريقة مترية لونية غير مباشرة تستخدم كل منهما مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 C الصغير. هذا كل ما في الأمر.
شكرا للمشاهدة.
نظرة عامة
يستخدم مطياف الطيف الضوئي NanoDrop 2000 C تقنية مبتكرة لقياس عينات الميكروحجم من البروتينات والأحماض النووية بدون الخلايا التقليدية. تعمل هذه الطريقة على تحسين سرعة القياس والنطاق الديناميكي، مما يسمح بتحديد تركيز البروتين بكفاءة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- الكيمياء التحليلية
- تحليل البروتين
الخلفية
- تستخدم تقنية NanoDrop الألياف البصرية وقوة السطح للتماسك العيني.
- تسمح بقياس مباشر لأحجام العينات الصغيرة (1-2 ميكرولتر).
- يؤدي التخلص من الخلايا إلى تقليل متطلبات العينة ووقت التنظيف.
- يمكن للنظام قياس التركيزات العالية دون الحاجة إلى التخفيف.
هدف الدراسة
- لإظهار إجراءات تحديد تركيز البروتين باستخدام NanoDrop 2000 C.
- لتسليط الضوء على مزايا التحليل الطيفي للميكروحجم.
- لتوفير إرشادات لاستخدام الجهاز بشكل فعال.
الطرق المستخدمة
- تقطير العينة مباشرة على القاعدة البصرية.
- استخدام عينات فارغة للمعايرة بمحلول عازل مناسب.
- قياس الامتزاز عند 280 نانومتر لتركيز البروتين.
- استخدام التحليلات اللونية مثل BCA للبروتينات غير المحددة.
النتائج الرئيسية
- يوفر NanoDrop 2000 C قياسات تركيز البروتين سريعة ودقيقة.
- تحتفظ قوة السطح بشكل فعال بعينات الميكروحجم للتحليل.
- يعزز تعديل طول المسار في الوقت الحقيقي دقة القياس.
- يتطلب التنظيف بين القياسات كمية قليلة من العينة.
الاستنتاجات
- يعد NanoDrop 2000 C أداة قيمة لتحليل البروتين في إعدادات البحث.
- يبسط تصميمه عملية القياس ويقلل من هدر العينات.
- توسع الطرق اللونية نطاق انطباقها على عينات البروتين المختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
![عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56110.jpg%3Fv%3D2026-07-03T23%253A55%253A10.000Z&w=384&q=75)
