اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

أول شيء نقوم به هو أخذ قارورة T 25 متوافقة تماماً من خلايا umsl. سأقوم فقط بالغسل باستخدام PBS، ثم سأضيف بضع قطرات من TRON وأتركها لبضع دقائق. أستطيع أن أرى الآن أن الخلايا بدأت تنفصل عن الطبق، لذا فهي جاهزة تقريباً.

حسنًا، سأقوم الآن بجمع الخلايا المعالجة بالتربسين، ومن الجيد تحضير هذه الخلايا لفترة وجيزة لتفكيك التجمعات الخلوية قبل وضعها على طبق الزرع. وستُترك هذه الخلايا في الحاضنة لمدة تتراوح بين 30 إلى 45 دقيقة تقريبًا. سأقوم الآن بطرد هذه الخلايا مركزياً لجمعها، ثم سأقوم بشفط السائل العلوي.

لذا سأقوم بإعادة التعليق خلال بضع دقائق حتى أتمكن من عدّ هذه الخلايا. لقد أعدت تعليقها الآن، وبعد العد، سأقوم بأخذ جزء (aliquot) وتخفيفه إلى 50 مل، وهو ما سيعطيني التركيز المناسب للحصول على مائة خلية في القطرة الواحدة للتأكد من سلامة الخلايا. والآن لدينا خزان.

قم برجّ هذه العينات قليلاً مرة أخرى، ثم نسكبها في الخزان الخاص بنا. حسنًا، لقد تمت برمجة هذا بالفعل. ها قد انتهينا.

لقد أصبح الآن مستويًا تمامًا. اقلبه وضعه جانبًا. ومع كل بضع صفائح، أقوم بإمالته قليلًا فقط لجعله يتحرك ذهابًا وإيابًا بعض الشيء.

حسناً، هكذا أصبح لدينا خمسة أطباق. سأقوم الآن بوضع هذه الأطباق في الحاضنة. هذه هي القطرات المعلقة التي جهزناها قبل يومين.

لذلك، ومن أجل الجمع، قم ببساطة بهز الأطباق لتجميع القطرات. سأقوم بجمع كل شيء، وسأحاول القيام بذلك برفق حتى لا تتأثر الـ EVs بشكل كبير، حيث سأقوم بأخذ خمس أو ستة ملي لتر من PBS وغسل الأطباق بها. بعد ذلك، نتركها لمدة 10 دقائق على الأقل، وستترسب الـ EVs بفعل الجاذبية.

بمجرد التأكد بصرياً من استقرار أجسام الأجنة (EBS)، قم بإزالة معظم الوسط العلوي، ولكن ليس كله، لأنك لا تريد إزعاجها. حسناً، والآن يتم هزها حتى اليوم السادس. هذه أجسام أجنة تم تحضيرها قبل ستة أيام من خلايا جذعية جنينية، وعادة ما نقوم بجمعها عن طريق تدوير الأطباق قليلاً.

عندما تقوم بتدوير الأطباق، تتجمع الخلايا الطرفية (eds) نوعًا ما في مركز الطبق، مما يجعل تصحيح وضعها أسهل قليلاً. الآن، تترك الخلايا الطرفية (eds) لتستقر بفعل الجاذبية في قاع الأنبوب، ثم تقوم بإزالة الوسط الغذائي، وبعد ذلك تغسلها مرة واحدة باستخدام 10 مل، أو من 10 إلى 12 مل من PBS. حسنًا، سنترك هذه الخلايا الآن لمدة دقيقة.

سأقوم الآن بإزالة P. حيث نضيف 250 µL من مزيج الإنزيمات الخاص بنا، ثم نضيف milli، وبعد ذلك نضعها في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. ومن حين لآخر، ربما بضع مرات، سأمر وأقوم بهزها برفق لمجرد خلطها لأن Ed قد ترسب. لدينا الآن محلول منظم لتفكيك الخلايا خالٍ من الإنزيمات نحصل عليه من gpro.

وسنضيف حوالي 8 mL من هذا السائل إلى كل أنبوب. ثم سنقوم بعملية التقليب باستخدام ماصة سعة 5 mL لإحداث التفكيك، وبينما تقوم بالتقليب للتفكيك، سيصبح السائل عكراً جداً. وهذا مجرد مؤشر بصري على تشتت الخلايا في الوسط وهو ما يجعله عكراً. والآن سأقوم بعد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق، فإذا كنت تنوي إجراء عدوى أو كنت تقوم بحساب تعددية العدوى (MOI)، فمن المهم جداً إجراء عملية العد.

لذا، سأقوم بتحضير دفعة كبيرة من الفيروس بالإضافة إلى الوسط الغذائي والخلايا بالتركيز المناسب بالإضافة إلى كبريتات البروتين. ثم أتأكد من الخلايا، وأكرر أنني أخشى خروج الخلايا من المعلق. لذا، أحرص دائماً، وأستخدم أيضاً حجماً صغيراً، وأحاول توخي الحذر لتجنب حدوث الكثير من الرذاذ، ثم نقوم بالطرد المركزي بسرعة 2,500 rpm.

لذا، سأقوم بجمع خلايانا في اليوم 10، وسأحتفظ بجميع محاليل الغسيل. كنت أستخدم سابقاً يوديد البروبيديوم (PI)، لكن صبغة 7 ليست ساطعة بنفس القدر، وبالتالي فهي لا تتداخل مع القنوات الأخرى بقدر ما تفعل الأولى، مما يجعل النتائج أكثر دقة ونقاءً.

والآن سنقوم ببساطة بالحصول على المتغير، وهذه طريقة جيدة لمنع الفقد في الإبرة بسبب الحجم. أنا شانون ميكيني فريمان، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبر جورج فاميليز لايف بجامعة مستشفى الأطفال في بوسطن.

سنتناول اليوم كيفية اشتقاق مجموعة من الخلايا القابلة للزرع من الخلايا الجذعية الجنينية للفئران، لتكوين جهاز دموي قابل للزرع. لماذا نقوم بهذا الاختبار؟ حسناً، نحن نعلم أنه باستخدام هذا النظام يمكننا الاشتقاق، حسناً أولاً، لقد تم تطوير البروتوكول النهائي من أجل اشتقاق مجموعة من الخلايا من الخلايا الجذعية الجنينية التي تمتلك نشاط الخلايا الجذعية المكونة للدم، بمعنى أنها كانت قادرة على إنقاذ الفئران من الإشعاع القاتل، وإعادة تكوين جهازها الدموي لفترة طويلة، أي طوال حياة الكائن الحي وفي جميع سلالات الدم الطرفي.

لهذا السبب تم تطوير هذا البروتوكول. ونقوم الآن بإجراء تجارب إضافية لفهم النمط الظاهري لمجموعة الخلايا ضمن هذه المجموعة الموسعة التي اشتققناها، والتي تتوسط فعلياً نشاط الخلايا الجذعية المكونة للدم. وذلك لأننا لا نعرف، فنحن نعلم أن هذه المجموعة غير متجانسة للغاية، ونعلم أن الخلية التي تقوم فعلياً بإنقاذ الفئران نادرة جداً ضمن مجموعة الخلايا هذه.

لذلك، نحن نحاول بشكل أساسي تحديد النمط الظاهري الخاص بها لنتمكن من تنقيتها من هذه الخلايا غير المتجانسة للغاية. ومن ثم، فإن اهتمامنا الأكبر ينصب على فهم كيفية مقارنتها وظيفياً بخلية جذعية مكونة للدم حقيقية يمكن استخلاصها من نخاع العظم الكامل. هل تمتلك قدرة مساوية على إعادة التشكل من الناحية التطورية، وهل تبدو انعكاساً لخلية جذعية مكونة للدم من نخاع عظم شخص بالغ؟

أو ربما قد تكون أشبه بالخلية الجذعية المكونة للدم. قد تجد التطور المبكر، على سبيل المثال، في الغدة الزعترية أو كبد الجنين. وهذا هو الأمر الذي نحاول فهمه في نهاية المطاف، ونريد استكشاف هذه التساؤلات لأننا نرغب في أن يساهم هذا البروتوكول في توجيه أعمال مشابهة نهتم بإجرائها على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

ونحن نشعر أن المعلومات التي سنتعلمها من خلال النظام الرياضي ستفيد بشكل كبير تلك التجارب المستقبلية. أعتقد أن هناك بضعة أمور؛ أولاً، فهو نموذج مخبري (in vitro) جيد، وهو نموذج مستقبلي جيد للتطور.

نحن نحاول أولاً فهم تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم. لذا، فإن هذا النظام يُعد نظاماً مثالياً وبسيطاً جداً للتعبير الجيني خارجي المنشأ، وبحث كيفية تأثير هذه العوامل على تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم. وهذا الأمر مفيد للغاية من منظور العلوم الأساسية.

ولكن في نهاية المطاف، فإننا نرغب في اشتقاق نوع من العلاج القائم على الخلايا والذي يمكن استخدامه سريريًا لاستخلاص خلايا جذعية أيضية قابلة للزرع من خلايا بشرية. ولكن من المحتمل أن يكون ذلك في المستقبل البعيد. في الواقع، اكتشفنا أن الجزء الأكثر صعوبة لا يكمن في اشتقاق الخلايا نفسها، بل وجدنا من خلال تجارب دقيقة أن هناك فترة زمنية واجهنا خلالها صعوبة في جعل الخلايا تعيد تكوين الأنسجة في الحيوانات المستقبلة.

وما اكتشفناه في نهاية المطاف هو أنه كان علينا إيلاء اهتمام دقيق للغاية بعملية الاستئصال لدى المتلقين لأن هذه الخلايا ليست قادرة. فعادةً عند إجراء عملية زرع في الفئران باستخدام خلايا جذعية من نخاع العظم، يتم تعريض الفئران لـ 10 أو 11 gray من الإشعاع لاستئصال النخاع، وتكون الخلايا الجذعية لنخاع العظم قادرة تماماً على إنقاذ الحيوانات من ذلك. ولكن تبين أن هذه المجموعة من الخلايا التي نقوم بتوسيعها غير قادرة على إنقاذ الحيوانات من مثل هذه الجرعة العالية من الإشعاع.

لذا، كان علينا تحديد جرعة التشعيع بدقة شديدة مع مراعاة حجم الحيوانات؛ لأننا وجدنا أنه إذا كانت الحيوانات كبيرة جداً وحاولنا استخدام نفس الجرعة، فإن عملية الاستئصال لا تتم بفعالية كافية. ولكن مرة أخرى، إذا لم يتم تشعيع الحيوانات بشكل كافٍ، فلن تكون الخلايا قادرة على منافسة المضيفات الأكثر مقاومة.

لذا، في الواقع، بمجرد أن أدركنا أن هذا كان متغيراً رئيسياً يصعّب علينا ملاحظة نشاط ab لهذه الخلايا، وقمنا أساساً بمعايرة جرعة التشعيع وأدركنا أيضاً أن عمر الحيوان ووزنه أمران بالغان الأهمية، بدأت تجاربنا حينها تعمل بشكل قابل للتكرار بدقة. لذا، ما اكتشفناه هو أنه إذا استخدمت حيوانات تزن حوالي 20 غراماً، أي من 15 إلى 20 غراماً، وقمت باستئصال نخاعها بجرعة 9.25 gray، يبدو أن هذه هي الجرعة المثالية التي تمنح هذه الخلايا الميزة التي تحتاجها لإعادة تكوين نخاع الفئران. نعم، وأعتقد أن هذا كان أحد أهم المتغيرات.

أما الأمر المهم الآخر فهو عدد الخلايا التي يتم حقنها. لقد قمنا أيضاً بتحديد العيار باستخدام هذه الظروف المحددة لإشعاع الكائن النموذجي الخاص بنا. كما قمنا بتحديد عيار عدد هذه الخلايا غير المجزأة، أي هذا المجمع غير المتجانس من الخلايا التي كنا نحقنها في الفئران.

وقد وجدنا أساساً أنك بحاجة إلى جرعة أدنى تبلغ حوالي 2 مليون إلى 5 ملايين خلية لإنقاذ الحيوانات. فإذا حقنت كمية أقل من ذلك، فلن يتم إنقاذ الحيوانات. وأعتقد أن هذا يشير إلى أن الخلايا -التي ربما تكون نادرة- هي التي تقوم فعلياً بتوسط عملية الإنقاذ ضمن هذه المجموعة غير المتجانسة.

لذا أعتقد أن أهم المتغيرات هي عدد الخلايا التي يتم حقنها، والتأكد من أن نموذج الزرع المستخدم، أياً كان، يتضمن استئصالاً كافياً لمنح الخلايا الميزة التي تحتاجها لإعادة التكوين، ولكن ليس إلى حد يجعلها غير قادرة على الإنقاذ. لقد كانت هذه الأمور هي المتغيرات الرئيسية والكبرى.