سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

لرسم خريطة لمواقع ربط البروتينات النووية الريبو على الرنا المرسال المسبق ، ابدأ بالتجانب عبر المنطقة المحددة من الحمض النووي الريبي الأساسي ذي الأهمية في 30 نافذة نيوكليوتيدات وقم بتصنيع oligos المبلطة على مصفوفة. يتم غلي oligos من المصفوفة وترسيب كون مع RNP الفائدة. يتم تسمية تجمع البداية الكلي ب SCI ثلاثة ويتم تسمية التجمع المرتبط ب SCI خمسة، ويتم تطبيق كلاهما على مصفوفة الكشف.

ثم يتم فحص المصفوفة واستخدام برنامج استخراج الميزات لتفسير النتائج. أملاح. مرحبا ، أنا كيت واتكينز من مختبر شقيق ويل فير في قسم MCB في جامعة براون. سأريكم اليوم إجراء سريعا وغير مكلف لتحديد الموقع الدقيق لمركب بروتين الحمض النووي الريبي على التهاب المفاصل الروماتويدي في المختبر ، وإعادة تصنيع بريم أ كمجموعة من قليل النوكليوتيدات المتداخلة.

يمكن بعد ذلك فصل هذا التجمع إلى جزء مرتبط وغير مرتبط عن طريق الترسيب المناعي المشترك ثم تحليله بواسطة مصفوفة دقيقة. في حين أن هذا الإجراء له العديد من التطبيقات ، فإننا نستخدمه لدراسة عوامل الربط المتعددة ودورها والربط البديل. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، استخدم متصفح الجينوم UC SC لتنزيل جينات معينة أو تقاطعات لصق أو مجالات اهتمام أخرى يمكن من خلالها تصميم تجمع prem A. حدد النوافذ ذات الأهمية ، ثم قم بتجانبها حسابيا بطول قراءة 30 نيوكليوتيدات وتداخل 20 نيوكليوتيدات بحيث يتم نقل كل قلة 10 نيوكليوتيدات من السابق. الآن بعد أن تم تحديد oligos الطويلة البالغ عددها 30 نيوكليوتيدات ، كل منها له تسلسلات أولية عالمية.

أرسل oligos إلى Agilent للطباعة على مصفوفة دقيقة مخصصة من قليل النوكليوتيدات. بمجرد وصول المصفوفة الدقيقة ، ابدأ في استعادة oligos الحمض النووي من سطحه عن طريق وضع شريحة غطاء المصفوفة في غرفة تهجين المصفوفة وسحب 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات برفق على الشريحة. ضع شريحة المصفوفة الدقيقة ووجهها لأسفل أعلى شريحة الغطاء بحيث تواجه الملصقات الموجودة على كل شريحة بعضها البعض واحرص على تجنب فقاعات الهواء التي يمكن أن تعطل عملية استرداد oligo.

أغلق غرفة التهجين وقم بتدويرها طوال الليل عند 99 درجة مئوية في فرن تهجين في اليوم التالي ، قم بإزالة المصفوفة بعناية من الغرفة واسحب الماء ، الذي يحتوي الآن على oligos المحررة من سطح المصفوفة. ضع تجمع oligo الذي تم إطلاقه في أنبوب einor سعة 1.5 ملليلتر وصوتنة لتفكيك الكتل المحتملة بسعة 50٪ ثلاث مرات لمدة ثلاث إلى خمس نبضات في كل مرة. بعد ذلك ، قم بتضخيم المسبح عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل منخفض الدورة باستخدام بادئات عالمية مع مروج T ملحق بنهايتها.

قد يختلف عدد الدورات المطلوبة اعتمادا على كفاءة استعادة oligo. تجنب الإفراط في التضخيم ، والذي يمكن رؤيته على شكل شريط ملطخ على جل مادة الأكريلاميد. أخيرا ، استخدم مجموعة البرامج النصية القصيرة الضخمة من Amon لنسخ الحمض النووي الريبي.

قم بإنهاء تفاعل النسخ عن طريق استخراج كلوروفورم الفينيل للحمض النووي الريبي ، متبوعا بترسيب الإيثانول باستخدام أسيتات الصوديوم وأيضا الجليكو الأزرق كناقل. يقوم Resus بتعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 105 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي بدقة.

استخدم الريبو الأخضر لإنشاء منحنى قياسي. ثم قم بالقياس باستخدام قارئ لوحة الفلورة. تجمع الحمض النووي الريبي جاهز الآن للترسيب المناعي المشترك لبدء السحب.

أولا ، قم بإعداد الخرزات المغناطيسية عن طريق الجمع بين حبات البروتين A والبروتين G dyna بنسبة واحد إلى واحد إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر لكل تفاعل. ركز الخرزات في مكان واحد باستخدام حامل فصل مغناطيسي لإزالة المادة الطافية. ثم اغسل مرتين بحجم متساو من البارد XPBS بعد الغسيل الثاني.

Resus ، الخرز في حجم متساو من بارد واحد XPBS وإضافة نانوغرامين من الجسم المضاد perion. قد تختلف هذه الكمية اعتمادا على الجسم المضاد ، لذلك قد يكون من الضروري إجراء التجارب لإيجاد الظروف المثلى لربط الجسم المضاد بالخرز. احتضان الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية على منصة دوارة.

في الصباح ، أضف ميكروغرامين لكل تفاعل من إجمالي الحمض النووي الريبي للخميرة الصوتية لمنع الارتباط غير المحدد وتدويرها لمدة 30 دقيقة إضافية عند أربع درجات مئوية. بمجرد الانتهاء من خطوة الحظر ، مرة أخرى ، استخدم الرف المغناطيسي لإزالة المادة الطافية. ثم اغسل الخرزات مرتين بواحدة باردة XPBS مع ترك PBS من الغسيل الثاني في الأنبوب aliquot 50 ميكرولتر من خليط الخرز في أنابيب جديدة.

أنبوب واحد لكل تفاعل مشترك IP. الخرزات جاهزة الآن ل coip. بعد ذلك ، قم بإعداد المزيج الرئيسي عن طريق الجمع بين تجمع الحمض النووي الريبي oligo ومستخلص الخلايا النووية.

كمصدر RNP ، خذ 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي كبادئات لحماية كاملة للعينة ، والتي هي إصدارات RNA من البادئات العالمية يمكن إضافتها لمنع ارتباط البروتين بالتسلسل التمهيدي أو إدخال بنية ثانوية إلى الحمض النووي الريبي. لبدء الترسيب المناعي المشترك ، قم بإزالة المادة الطافية من حبة الخرز وأعد تعليق الخرزات في 120 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المتبقي. هز ردود الفعل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.

في نهاية الحضانة ، يمكن إزالة Eloqua صغير ، بما في ذلك الخرز ، من كل ملكية مشتركة. لاختبار إضافي لكفاءة الربط أو خصوصيته، ضع ما تبقى من التفاعلات على المغناطيس وقم بإزالة المادة الطافية. يتبع ذلك غسلة واحدة أو غسلتين مع XPDS بارد.

الحمض النووي الريبي المرتبط بالجسم المضاد على الخرزات من خلال RNP هو عينة IP. أعد تعليق حبات IP في 50 ميكرولتر من 1٪ SDS في عازلة 0.1 XTE وتسخين العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتصفية الحمض النووي الريبي ، قم بإزالة المادة الطافية ، التي تحتوي الآن على الحمض النووي الريبي الذي كان مرتبطا سابقا بالخرز وتنظيفه عن طريق استخراج كلوروفورم الفينيل ، متبوعا بهطول الإيثانول ، أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من 0.1 XT عازلة.

بعد ذلك ، قم بنسخ العينات بعكس باستخدام الاشعال العالمية العكسية. ثم يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم العينات باستخدام البادئات العالمية ، والتي يجب أن يحتوي أحدها على محفز T seven. سيعتمد عدد الدورات المطلوبة لتضخيم المجمع على كفاءة الملكية الفكرية المشتركة.

باستخدام مجموعة نص السراويل القصيرة الضخمة من ambion ، قم بنسخ العينات مرة أخرى ، ولكن هذه المرة أضف ميكرولترين من الأليل الأميني UTP بدلا من T seven UTP الذي يأتي مع المجموعة. سيتم استخدام الأليل الأميني UTP لاحقا لتسمية الحمض النووي الريبي بالعينين الجانبية. عند اكتمال النسخ.

مستخلص كلوروفورم فينيل والإيثانول يترسب العينات. لا تستخدم جليكو بلو أو أسيتات الأمونيوم ، مما قد يتداخل مع تهجين العينات إلى المصفوفة. يقوم Resus بتعليق الحبيبات في 4.5 ميكرولتر من 0.1 كربونات الصوديوم المولارية.

لتسمية العينات أولا ، أضف 2.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى العينة الإجمالية. أضف ثلاثة ميكرولترات من S3 وإلى عينة IP عند ثلاثة ميكرولتر من SCI خمسة. احتضن في الظلام لمدة ساعة.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإنهاء التفاعل عن طريق إضافة ستة ميكرولترات من أربعة مولار هيدروكسيل لامين حمض الهيدروكلورايد إلى كل عينة ، واخلطها جيدا وقم بالدوران. احتضان لفترة وجيزة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتنقية العينات الموسومة عن طريق استخراج فينيل كلوروفورم ، متبوعا بهطول الإيثانول. يتم سحب معظم اللون إلى الطور العضوي باستخدام النيوكليوتيدات الحرة ، لذلك قد لا تكون الكريات ملونة بشكل واضح.

بتعليق كل بيليه في 50 ميكرولتر من 0.1 XTE. اتبع تعليمات مجموعة تهجين المصفوفة Agilent لإعداد عينة المصفوفة الدقيقة مع الاستثناء التالي. لا تقم بتجزئة الحمض النووي الريبي: بعد إضافة المخزن المؤقت للتجزئة ، أضف المخزن المؤقت للتهجين على الفور لإيقاف التجزئة.

ضع العينات على المصفوفة وقم بتهجينها عند 50 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات أثناء دوران المصفوفة. قم بإعداد المحاليل التالية سعة 50 مليلتر في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. أنبوب واحد من اثنين من المخزن المؤقت SC الزائد ، وأنبوبان من عازلة بحرية زائدة وأنبوب واحد من الماء منزوع الأيونات.

بعد الحضانة لمدة ثلاث ساعات ، قم بفك شطيرة شريحة المصفوفة بعناية وضعها في المخزن المؤقت XSSC. باستخدام زوج من الملقط. افصل المصفوفة برفق عن شريحة الغطاء.

قم بإزالة شريحة الغطاء برفق ، مع الحرص على عدم لمس المصفوفة. عندما يتم سحب الشريحة للخارج ، أغلق المخروطي واقلبها برفق لمدة 60 ثانية. باستخدام الملقط ، انقل المصفوفة إلى حل XSSC واحد.

قم بتغطية الأنبوب وقلبه برفق لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المصفوفة إلى الحل الثاني XSSC ومرة أخرى ، اقلبها برفق لمدة دقيقة أخرى. أخيرا ، انقل المصفوفة إلى أنبوب الماء منزوع الأيونات واقلبها برفق لمدة 30 ثانية.

جفف المصفوفة عن طريق وضع حواف الشريحة على مسحة كيم. استمر في تدوير المصفوفة على المسح، مع التأكد من عدم تعطيل الجانب الذي يحتوي على oligos. ضع المصفوفة في أنبوب مخروطي فارغ واستمر في مسح المصفوفة.

تابع لفحص المصفوفة. هنا مصفوفة تمثيلية. يتم تلوين كل ميزة أو oligo إما باللون الأخضر لإجمالي التجمع غير المخصب أو الأحمر للتجمع المخصب بعنوان IP.

يتم تطبيع الإشارة في كل معلم إلى الشدة الإجمالية في تلك القناة. الناتج النهائي هو نسبة السجل للقناة الحمراء عبر القناة الخضراء. في كل ميزة في المصفوفة ، يتم تعيين متوسط النتيجة في كل إحداثيات جينومية إلى الموقع المحدد.

يتم إعطاء رسم توضيحي لخطوة المتوسط هذه لثلاثة أوليغوس 30 نيوكليوتيدات متداخلة بدرجات اثنين وأربعة و0.5 ، حيث يتم عرض متوسط درجة التخصيب لكل نافذة 10 نيوكليوتيدات. فيما يلي مثال على مخطط ربط لبروتين الربط المتعقب بولي بيرين PTB في ميزات جين CLTA يتم تقديمها على طول الجزء السفلي ويتم تمثيل متوسط درجات التخصيب اللوغاريتمي ل PTP S المرتبط بشرائط عمودية حمراء داكنة. تظهر الأشرطة الحمراء الفاتحة المناطق غير المخصبة لربط PTP.

لقد أوضحت لك للتو كيفية إنشاء تجمع قليل النوكليوتيدات بسرعة وكفاءة يتقاطع عبر مناطق الاهتمام ، مثل المحاور المقطعة بدلا من ذلك. نقوم بتحليل حمامات السباحة الخاصة بنا عن طريق المصفوفة الدقيقة ، ولكن من الممكن أيضا تسلسلها إما عن طريق تسلسل Lexi أو تسلسل Sanger التقليدي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن إنشاء المسبح مفتوح للتعديل إما على مستوى الحمض النووي الريبي أو البروتين.

على مستوى الحمض النووي الريبي ، يمكننا إدخال مناطق ذاتية المنشأ ، أو طفرات مرضية ، أو تعدد أشكال ، أو طفرات عشوائية في تسلسل قليل النوكليوتيدات. على مستوى البروتين ، يمكن تعديل عامل ربط الحمض النووي الريبي عن طريق الفسفرة أو غيرها من التعديلات اللاحقة للترجمة. أيضا ، يمكن التلاعب ببيئة الربط إما لزيادة أو تقليل مستويات العوامل الإضافية التي تتنافس أو تتفاعل مع بروتين ربط الحمض النووي الريبي ذي الأهمية.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.