الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

يتم هضم بلازميدات WRN باستخدام إنزيمات القطع restrictone endonuclease cell one و MLU one، ثم تُنقى الشظايا من الجل. بعد ذلك، يتم ربط ناقلات التعبير هذه، التي تحتوي على شظايا WN المهضومة من cell one إلى MLU one، في مواقع cell one إلى MLU one الخاصة بناقل الخميرة. كما يحتوي البلازميد متعدد النسخ على علامة اختيار TRP one.

يتم تحويل بنى W Rrn إلى الخميرة وفقاً للبروتوكولات القياسية، ثم يتم اختيار المحولات على أوساط جلوكوز تخليقية كاملة تفتقر إلى التريبتوفان. بعد ذلك، يتم تخطيط المحولات الفردية على أوساط جلوكوز تخليقية كاملة تفتقر إلى التريبتوفان، ويتم تحضين الأطباق من الطبق الرئيسي. ولتحليل استعادة نمط النمو البطيء في سلالات SGS one top three الطافرة المزدوجة التي تم تحويلها بـ WRN، يتم تخطيط المحولات على أطباق تحتوي على الجلوكوز أو الجالاكتوز.

لتحليل تأثير تعبير WRN على الحساسية تجاه HU وMMS، يتم إجراء عملية التنقيط (spotting) لتحديد توزيع الدورة الخلوية لخلايا الخميرة التي تعبر عن WRN. كما يتم إجراء صبغ DAPI. ويتم تحليل تعبير WRN في المضيف غير المتجانس عن طريق تحليل Western Blot.

مرحباً، أنا روبرت بروش من قسم حالات DNA hela في مختبر الشيخوخة الجزيئية بالمعهد الوطني للشيخوخة، أحد معاهد المعاهد الوطنية للصحة. مرحباً، أنا مونيكا أغاروال، أيضاً من قسم حالات DNA Heli في مختبر الشيخوخة الجزيئية بالمعهد الوطني للشيخوخة. إن فهم أدوار بروتينات إصلاح DNA البشرية والمسارات الجينية يمثل تحدياً كبيراً للعديد من الباحثين.

لقد كانت الدراسات الجينية في أنظمة الثدييات محدودة بسبب نقص الأدوات المتاحة بسهولة، بما في ذلك الخطوط الخلوية الجينية الطافرة، وأنظمة التعبير التنظيمية، والعلامات الانتقائية المناسبة. سنعرض لكم اليوم إجراءات تتضمن استخدام الخميرة كنظام نموذجي لاستقصاء الوظائف الجزيئية والخلوية لإنزيم فك التواء DNA المعروف باسم الهيليكاز (helicase) في الوقاية من الشيخوخة المبكرة. نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا للتوصيف الجيني لدور ناتج جين burner البشري، والذي يعاني من خلل في إصلاح DNA والحفاظ على الاستقرار الجينومي في اضطراب الشيخوخة المبكرة.

تعد متلازمة ويرنر واحدة من خمس حالات لعائلة هليكازات Rec في الخميرة. هناك حالة واحدة فقط مسماة sgs1 لدراسة دور بروتين Werner البشري في الاستجابة لإجهاد التضاعف. لقد قمنا بفحص تأثير التعبير عن Werner في خلفية طافرة من الخميرة على نقاط نهاية بيولوجية مختلفة.

لذا، دعونا نبدأ. بما أننا سنستخدم الخميرة كمضيف متغاير، ستكون خطوتنا الأولى هي استنساخ جين Werner البشري أو أحد متغيراته في ناقل خميرة. تم هضم بلازميدات Werner باستخدام إنزيمات القطع Sal I و MLU I، ثم نُقيت الشظايا الناتجة ورُبطت في مواقع Sal I و MLU I الخاصة بناقل التعبير في الخميرة الذي يخضع لتنظيم محفز قابل للاستحثاث بالجالاكتوز.

يحتوي البلازميد متعدد النسخ أيضاً على علامة اختيار TRP1. ثم يتم تحويل بلازميدات التعبير من نوع Werner هذه إلى سلالات الخميرة المناسبة ناقصة التريبتوفان المستخدمة في هذه الدراسة. ويتم اختيار المتحولات عن طريق زرع المعلق على أوساط جلوكوز تركيبية كاملة.

في حال غياب التربتوفان، تُحضن الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تظهر المستعمرات. وبمجرد نمو المستعمرات، يتم تخطيط المحولات الفردية على وسط جلوكوز اصطناعي كامل، وتُحضن الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام. بعد ذلك، يتم فحص سلالات الخميرة الطافرة التي تعبر عن جين weer البشري ومتغيراته للكشف عن الأنماط الظاهرية الخلوية باستخدام التقنيات الموضحة في الأقسام التالية.

تظهر الطفرات الثلاث الأولى عيباً شديداً في النمو. ومع ذلك، فإن الطفرة في جين SGS1 تثبط النمط الظاهري للنمو البطيء في الطفرات الثلاث الأولى. لفحص تأثير تعبير Werner على نمو سلالات النوع البري S Gs one أو سلالات S Gs one ذات الطفرات الثلاث الأولى، يتم تخطيط السلالات المقابلة مع الناقل أو بلازميد تعبير Werner على أطباق وسط اصطناعي كامل يفتقر إلى التربتوفان ولكن يحتوي إما على 2%glucose أو 2%gala lactose كضابط موجب. تم تحديد تأثير تعبير SGS1 عن طريق تحضين الأطباق عند 30 درجة لمدة يومين.

لا تظهر السلالة من النوع البري وسلالة طفرة SGS one المحولة بالناقل أو بـ Werner أي اختلاف في نمط نموهما. ومع ذلك، فإن سلالة طفرة SGS one top three المزدوجة المحولة بـ Werner تنمو بشكل أبطأ بكثير من سلالة طفرة SGS one top three المزدوجة المحولة بالناقل، وذلك لتقييم المتطلبات الوظيفية لـ Werner لاستعادة نمط النمو البطيء. في خلفية sgs one top three، يتم تخطيط سلالات sgs one top three المحولة بطفرات النطاق الحفزي لـ Warner على أطباق اصطناعية كاملة تفتقر إلى التريبتوفان وتحتوي إما على 2% glucose أو 2% galactose لمدة يومين.

يؤدي تحضين طافرة إكسونوكلياز ويرنر (Werner Exonuclease) المشار إليها بـ E 84 A إلى استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء على غرار ويرنر، مما يوضح أن نشاط الإكسونوكلياز غير مطلوب لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء في الثلاثة الأعلى. أما طافرة هيليكاز ويرنر (Werner Helicase) فتنمو بشكل جيد، مما يثبت أن نشاط هيليكاز ويرنر مطلوب لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء في الثلاثة الأعلى. ولتحديد قدرة ويرنر على التأثير في معدل نمو sgs.

قم بتخطيط سلالة واحدة من أفضل ثلاث سلالات ذات مستويات منخفضة من التعبير البروتيني sgs1، بالإضافة إلى أفضل ثلاث سلالات محولة باستخدام ناقل Werner أو sgs1، على أطباق وسط تخليقي كامل يفتقر إلى التريبتوفان ولكن يحتوي على تركيزات متزايدة من الجالاكتوز. حضن جميع الأطباق عند 30 درجة Celsius لمدة يومين. يعمل Werner وطفرة Exonuclease mutant على استعادة النمط الظاهري top three slope عند جميع مستويات الجالاكتوز.

ومع ذلك، فإن طفرات Werner Helicase لا تفعل ذلك. فقد ثبت أن الطفرة المزدوجة SGS one top three أقل حساسية من الطفرة المفردة top three تجاه عامل ألكلة DNA وهو methyl methane SULFONATE أو MMS أو مثبط التضاعف hydroxyurea أو HU لتحديد تأثير تعبير Werner على حساسية سلالات SGS one أو S GS one top three تجاه MMS و HU. يتم تنمية سلالات الخميرة المحولة بواسطة vector أو Werner في أوساط synthetic complete raffinose الخالية من التربتوفان عند 30 درجة Celsius كعنصر تحكم.

استخدم سلالة أبوية من النوع البري مُحوّلة بناقل، وأعد تلقيح جميع المزارع في وسط رافينوز اصطناعي كامل يفتقر إلى التريبتوفان، وقم بتنميتها عند درجة حرارة 30 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكر. عندما تصل المزارع إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكر، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف وصولاً إلى 10,000 ضعف لهذه السلالات باستخدام وسط اصطناعي كامل يفتقر إلى التريبتوفان، ثم ضع أربع ميكرولترات من كل تخفيف على أطباق وسط GAL اصطناعي كامل يفتقر إلى التريبتوفان ويحتوي على 10 millimolar HU أو 0.0025%MMS، ثم قم بحضن الأطباق عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. طافرة مزدوجة sgs1 top3 مُحوّلة بـ sgs من النوع البري.

يتأخر أحدها في المرحلة الثانية المتأخرة من S/G في دورة الخلية، مما يؤدي إلى ظهور شكل مورفولوجي يشبه الدمبل. وفي المقابل، تكتمل عملية انقسام الخلايا في خميرة النوع البري، مما يترك عدداً أقل من الخلايا التي تشبه الدمبل لدراسة توزيع دورة الخلية في سلالة sgs one top three المحولة بواسطة Werner. أولاً، يتم استنبات مزارع في طور النمو اللوغاريتمي للسلالات التالية في وسط synthetic complete RAF الخالي من التريبتوفان عند درجة حرارة 30 درجة Celsius طوال الليل.

يتم إعادة تلقيح مزارع سلالات SGS one الثلاث الأولى المحولة باستخدام ناقل Werner، أو سلالات SGS one، والسلالة الأبوية البرية المحولة باستخدام الناقل عند كثافة ضوئية OD 0.05. وبمجرد إعادة التلقيح، تُنمى المزارع حتى تصل إلى كثافة ضوئية OD 0.5 ثم تُجمع عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، يتم تحفيز تعبير Werner بإضافة جالاكتوز بتركيز 2%. تُترك المزارع لتنمو عند درجة حرارة 30 degrees Celsius لمدة ست ساعات.

بعد مرور ست ساعات، يتم حصاد المزارع وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تُنقل المزارع إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة بعد عملية الطرد المركزي، وتُغسل الخلايا مرة واحدة بـ PBS. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا في 70% ethanol لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد غسل الخلايا المثبتة مرتين بـ PBS، يُعاد تعليق الخلايا في XPBS واحد.

ضع معلق الخلايا على شريحة وأضف سائل Vector shield. أوساط التثبيت مع DAPI بتركيز 1 µg/mL. افحص الشرائح تحت مجهر XI Saxo vert للبحث عن خلايا ذات نوى تشبه دمبل، وهو أمر مميز لخلايا الخميرة في طور SG two من الدورة الخلوية.

لتحديد تعبير بروتين Werner أو تباينه في سلالات الخميرة المتحولة SGS one أو SGS one top three. ابدأ بزراعة السلالات لمدة ست ساعات في وسط يحتوي على الجالاكتوز لتحفيز تعبير بروتين Werner. بعد جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، اغسلها باستخدام PBS ثم أعد تعليقها.

محلول منظم للتحلل القلوي. تُغلى الخلايا لمدة خمس دقائق، ثم يتم تصفيتها عن طريق الطرد المركزي ومعادلتها باستخدام حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 molar. وتصبح هذه المحللات الآن جاهزة للرحلان الكهربائي في هلامات poly acrylamide SDS بتركيز 8 إلى 16% لتحديد مستوى تعبير بروتين Warner تحت تأثير تركيزات متفاوتة من الجالاكتوز.

أولاً، قم بتحفيز المستنبتات بتركيزات متفاوتة من الجالاكتوز لمدة ست ساعات. بعد ذلك، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في محلول منظم يحتوي على مثبطات البروتياز. أضف حبيبات زجاجية بحجم 425 إلى 600 ميكرون إلى الخليط وقم بتحليل الخلايا باستخدام جهاز الرج (vortex) بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة، يليه وضعها على الثلج لمدة دقيقة واحدة.

كرر العملية لثماني مرات إجمالاً. بعد ذلك، قم بطرد المتجانس الناتج مركزياً لمدة خمس دقائق عند 15,000 Gs واجمع جزء السائل الطافي. بعد قياس كمية البروتين في أجزاء المستخلص باستخدام طريقة Bradford، قم بفصل تركيزات متساوية من البروتين على هلامات Poly acrylamide SDS بتركيز يتراوح بين 8 إلى 16%. ثم يتم تحديد تعبير Werner عن طريق لطخة ويسترن Werner expression in sgs.

يعيد One top three النمط الظاهري للنمو البطيء لـ top three كما هو موضح في هذه الصور. عندما تم تحويل سلالات sgs one top three باستخدام ناقل Werner أو sgs one وتم تخطيطها على طبق SC tryptophan يحتوي إما على 2% glucose أو 2% galactose. يؤدي التعبير الناجم عن galactose لـ Werner إلى جعل سلالة SGS one top three تنمو بشكل أبطأ.

في المقابل، لم تتأثر سلالة النوع البري الأبوية أو سلالة SGS one المحولة بـ Werner في نموها، مما يشير إلى أن بطء النمو الذي يسببه Werner خاص بخلفية sgs. One top three. وعندما تم تخطيط سلالات SGS one top three المحولة بمتغيرات Werner على أطباق SC tryptophan التي تحتوي إما على 2%glucose أو 2%galactose فقط.

كان إنزيم Werner فاقد النشاط الإكسونوكليازي لا يزال قادراً على استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء. وهذا يوضح أن نشاط Werner ATPase helicase هو المطلوب لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء لـ top three، وليس نشاط الإكسونوكلياز. وفي خلفية SGS one top three، استعاد Werner النمط الظاهري للنمو البطيء لـ SGS one top three عبر نطاق تركيز GAL بالكامل.

تشير هذه النتائج إلى أن استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء في خلفية طفرة sgs one top three تحدث عند مستويات منخفضة من تعبير بروتين Werner. وعندما تم وضع مزارع نامية لوغاريتمياً من سلالات sgs one top three المحولة ببروتين Werner أو متغيراته في تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف على أطباق SC trytophan تحتوي على الجلوكوز أو الجالاكتوز وإما MMS أو HU، لاحظنا أن تعبير Werner زاد من حساسية سلالة SGS one top three لـ MMS و HU. علاوة على ذلك، فإن هذا التأثير على الحساسية لـ MMS و HU في خلفية SGS one top three يتطلب نشاط الهيليكيز لـ Werner ATP، ولكن ليس نشاط exon clease.

وأخيرًا، يعيد تعبير Werner أيضًا استعادة تأخير SG two المميز لـ top three، كما يتضح من ارتفاع تعداد الخلايا ذات النهايات العريضة. في خلايا طفرة sgs one top three التي تعبر عن Werner، وبالمقارنة مع خلايا sgs one top three المحولة باستخدام ناقل (vector)، تم صبغ الخلايا بـ Dabi.

لتصور النوى، وتشير الأسهم إلى تعبير Werner في النوى غير المنقسمة. في سلالات sgs المحولة، تم تحفيز الخلايا الثلاث الأولى في الأعلى عن طريق إضافة تركيزات الجالاكتوز المحددة، وتم حصاد الخلايا بعد ست ساعات من التحفيز. تم تحميل كميات متساوية من مستخلص الخلايا الكلي على هلامات SDS poly acrylamide بتركيز 8 إلى 16%، متبوعة بالكشف عن طريق western blood باستخدام جسم مضاد لـ Werner.

لقد أوضحنا لكم كيفية استقصاء الأنماط الظاهرية الخلوية المرتبطة بخلفيات طافرة محددة من الخميرة لتوضيح الوظائف الخلوية والجزيئية لجين learner البشري التي تتوسطها أنشطته التحفيزية وتفاعلاته البروتينية. يمكن استخدام الخميرة ككائن نموذجي لدراسة وظائف الجين في مسارات محددة. وعند القيام بهذه الإجراءات، من المهم اختيار خلفية طافرة مناسبة من الخميرة لتمييز دور الجين قيد البحث في مسارات محددة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.