الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

يتم هضم بلازميدات WRN باستخدام خلية نوكلياز التقييد الأولى و MLU واحدة ويتم تنقية الشظايا من مادة هلامية. يتم بعد ذلك ربط متجهات التعبير هذه المهضومة بخلية واحدة إلى MLU واحدة من شظايا WN في الخلية واحدة إلى MLU مواقع واحدة من متجه الخميرة. يحتوي البلازميد متعدد النسخ أيضا على علامة TRP واحدة قابلة للتحديد.

يتم تحويل تركيبات W Rrn إلى خميرة باتباع البروتوكولات القياسية ويتم اختيار المحولات على وسائط الجلوكوز الاصطناعية الكاملة التي تفتقر إلى التربتوفان. ثم يتم ربط المحولات الفردية على وسائط الجلوكوز الاصطناعية الكاملة التي تفتقر إلى التربتوفان ويتم تحضين الألواح من اللوحة الرئيسية. لتحليل استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء في SGS المحولة WRN ، يتم وضع ثلاثة محولات مزدوجة متحولة على ألواح تحتوي على الجلوكوز أو الجالاكتوز.

لتحليل تأثير تعبير WRN على HU و MMS ، يتم إجراء اكتشاف الحساسية لتحديد توزيع دورة الخلية ل WRN التي تعبر عن خلايا الخميرة. يتم تنفيذ تلطيخ DAPI. يتم تحليل التعبير عن WRN في المضيف غير المتجانس بواسطة تحليل الدم الغربي.

مرحبا ، أنا روبرت بروخ من القسم الخاص بحالات الحمض النووي هيلا في مختبر علم الشيخوخة الجزيئية في المعهد الوطني للشيخوخة ، أحد معاهد المعاهد الوطنية للصحة. مرحبا ، أنا مونيكا أغاروال ، أيضا من قسم حالات الحمض النووي الهليكوبتر في مختبر علم الوراثة الجزيئي في المعاهد الوطنية للشيخوخة. يعد فهم أدوار بروتينات إصلاح الحمض النووي البشري والمسارات الجينية تحديا ميسور التكلفة للعديد من الباحثين.

كانت الدراسات الجينية في أنظمة الثدييات محدودة بسبب نقص الأدوات المتاحة بسهولة ، بما في ذلك خطوط الخلايا الجينية الطافرة ، وأنظمة التعبير التنظيمي ، والعلامات المناسبة القابلة للتحديد. سنعرض لك اليوم الإجراءات التي تنطوي على الخميرة كنظام نموذجي للتحقيق في الوظائف الجزيئية والخلوية لإنزيم فك الحمض النووي المعروف باسم الهليكياز في الوقاية من الشيخوخة المبكرة. نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لتوصيف دور منتج جين الموقد البشري المعيب وراثيا في إصلاح الحمض النووي والحفاظ على الاستقرار الجيني في اضطراب الشيخوخة المبكرة.

متلازمة فيرنر فيرنر هي واحدة من خمس حالات هليكوبتر عائلية بشرية في الشرق. لا يوجد سوى واحد يدعى sgs one لدراسة دور Werner البشري في استجابة الإجهاد النسخ المتماثل. لقد درسنا تأثير تعبير Werner في الخلفية الطافرة الشرقية على نقاط النهاية البيولوجية المختلفة.

لذلك دعونا نبدأ ، فلنبدأ. نظرا لأننا سنستخدم الخميرة كمضيف غير متجانس ، فإن خطوتنا الأولى ستكون استنساخ جين فيرنر البشري أو تباينه في ناقل الخميرة. تم هضم بلازميدات Werner مع تقييد Endonuclease Sal one و MLU واحد ويجب تنقية الشظايا في الداخل ثم ربطها في Sal one MLU مواقع واحدة من ناقل تعبير الخميرة الذي يخضع لتنظيم محفز محفز جالون.

البلازميد متعدد النسخ أيضا على علامة TRP واحدة قابلة للتحديد. ثم يتم تحويل بلازميد تعبير فيرنر إلى سلالات الخميرة الاستوائية التربتوفان المناسبة المستخدمة في هذه الدراسة. ويتم اختيار المحولات عن طريق طلاء التعليق على وسائط الجلوكوز الاصطناعية الكاملة.

تفتقر إلى التربتوفان تحتضن الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تظهر المستعمرات. بمجرد أن تنمو المستعمرات ، تقوم المحولات الفردية على وسائط الجلوكوز الاصطناعية الكاملة وتحتضن الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. ثم يتم فحص السلالات الطافرة التي تعبر عن الجين البشري ومتغيراته بحثا عن الأنماط الظاهرية الخلوية من خلال التقنيات الموضحة في الأقسام التالية.

تظهر الطفرات الثلاثة الأولى عيبا حادا في النمو. ومع ذلك ، فإن الطفرة في SGS الجين الواحد تثبط النمط الظاهري للنمو البطيء للمتحور الثلاثة الأوائل لفحص تأثير تعبير Werner على نمو النوع البري S Gs واحد أو S Gs ، وواحدة من السلالات الثلاث العليا تخطط السلالات المقابلة مع المتجه أو بلازميد تعبير Werner على ألواح وسائط كاملة اصطناعية تفتقر إلى التربتوفان ولكنها تحتوي إما على 2٪ جلوكوز أو 2٪ لاكتوز غالا كعنصر تحكم إيجابي. تم تحديد تأثير تعبير SGS الواحد لاحتضان الألواح عند 30 درجة لمدة يومين.

لا يظهر النوع البري و SGS سلالة متحولة واحدة تم تحويلها بناقل أو فيرنر أي فرق في نمط نموها. ومع ذلك ، قام Werner بتحويل SGS بثلاثة سلالات متحولة مزدوجة تنمو بشكل أبطأ بكثير من S GS واحدة من أفضل ثلاثة متحولات مزدوجة تم تحويلها مع المتجه لتقييم المتطلبات الوظيفية لشركة Warner لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء. في sgs ، تحولت إحدى السلالات الثلاثة الأولى من الخلفية مع طفرات المجال التحفيزي من وارنر إلى صفائح كاملة اصطناعية تفتقر إلى التربتوفان الذي يحتوي إما على 2٪ جلوكوز أو 2٪ جالاكتوز بعد يومين.

حضانة Werner Exonuclease متحولة المشار إليها على أنها E 84 A يعيد النمط الظاهري للنمو البطيء مثل Werner ، مما يدل على أن نشاط نوكلياز خارجي غير مطلوب لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء الثلاثة. ينمو متحولة Werner Helicase بشكل جيد ، مما يدل على أن نشاط Werner helicase مطلوب لاستعادة النمط الظاهري البطيء للنمو. لتحديد قدرة Werner على التأثير على معدل نمو sgs.

سلالة واحدة من أعلى ثلاث سلالات في مستويات أقل من خط التعبير عن البروتين تحولت واحدة من السلالات الثلاثة الأولى مع ناقل Werner أو sgs واحدة على صفائح اصطناعية كاملة تفتقر إلى التربتوفان ، ولكنها تحتوي على تركيزات متزايدة من الجالاكتوز. احتضن جميع الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. يستعيد متحولة نوكلياز خارجي وارنر ووارنر المنحدرات الثلاثة الأولى مع النمط الظاهري على جميع مستويات الجالاكتوز.

ومع ذلك ، فإن طفرات وارنر هيليكاز لا تفعل ذلك. لقد ثبت أن SGS ، وهو واحد من الطفرات الثلاثة المزدوجة ، أقل حساسية من الطفرة الفردية الثلاثة الأولى لعامل إيلكلة الحمض النووي ، ميثيل ميثان سلفونات أو MMS أو مثبط النسخ المتماثل هيدروكسي يوريا أو HU لتحديد تأثير تعبير وارنر على حساسية MMS و HE ل SGS واحد أو S GS واحد من السلالات الثلاثة الأولى. تنمو سلالات الخميرة التي تحولت مع ناقل أو فيرنر في وسائط رافينوز كاملة اصطناعية تفتقر إلى التربتوفان عند 30 درجة مئوية كعنصر تحكم.

استخدم سلالة أبوية من النوع البري تم تحويلها مع ناقل إعادة تلقيح جميع الثقافات في وسائط الرافينوز الاصطناعية الكاملة التي تفتقر إلى التريتوفان وتنمو عند 30 درجة مئوية إلى مرحلة السجل المبكرة. عندما تكون الثقافات في مرحلة السجل المبكرة ، قم بإعداد التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف حتى 10 ، 000 أضعاف من هذه السلالات باستخدام وسائط كاملة اصطناعية تفتقر إلى بقعة التريفان أربعة ميكرولتر من كل تخفيف على وسائط GAL اصطناعية كاملة تفتقر إلى ألواح التربتوفان التي تحتوي على 10 ملليمولار HU أو 0.0025٪ MMS تحتضن الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. SGS واحد من أفضل ثلاثة متحولات مزدوجة يتم تحويلها باستخدام sgs من النوع البري.

يتأخر أحدهما في أواخر المرحلة الثانية من دورة الخلية مما يؤدي إلى مورفولوجيا على شكل دمبل. في المقابل ، تكمل الخميرة البرية انقسام الخلايا ، تاركة عددا أقل من الخلايا على شكل دمبل لدراسة توزيع دورة الخلية لتحويل Werner إلى سلالة واحدة من أعلى ثلاث سلالات. أولا ، تنمو الثقافات التي تنمو لوغاريتميا للسلالات التالية في وسائط سلاح الجو الملكي البريطاني الاصطناعية الكاملة التي تفتقر إلى التربتوفان عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

SGS واحدة أعلى ثلاثة يحول مع ناقلات [ورنر] أو [سغس] واحدة والناقل يحول [ولندستيف] سلالة أبوية إعادة تلقيح الثقافات في OD 0.05. بمجرد إعادة تلقيح المزارع تنمو إلى OD 0.5 والحصاد عن طريق الطرد المركزي ، يتم تحفيز تعبير Werner عن طريق إضافة gala lactose بتركيز 2٪. اسمح للثقافات بالنمو عند 30 درجة مئوية لمدة ست ساعات.

بعد ست ساعات ، حصاد الثقافات ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. نقل الثقافات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بعد الطرد المركزي ، وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. ثم قم بإصلاح الخلايا في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد غسل الخلايا الثابتة مرتين باستخدام PBS إعادة تعليق الخلايا في XPBS واحد.

ضع تعليق الخلية على شريحة وأضف درعا ناقل. تركيب الوسائط باستخدام DAPI بتركيز ميكروغرام واحد لكل مليلتر. افحص الشرائح تحت مجهر XI Saxo vert للبحث عن الخلايا ذات النوى على شكل دمبل ، وهي سمة من سمات خلايا الخميرة في SG على مرحلتين من دورة الخلية.

لتحديد التعبير عن بروتين [فيرنر] أو تباينه في تحويل [سغس] واحدة أو [سغس] واحدة أعلى ثلاثة خميرة سلالات. ابدأ بزراعة السلالات لمدة ست ساعات في وسائط تحتوي على الجالاكتوز للحث على التعبير عن بروتين فيرنر. بعد جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، اغسلها باستخدام PBS وإعادة تعليقها.

عازلة تحلل قلوي. قم بغلي الخلايا لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتوضيحها بالطرد المركزي وتحييدها بحمض الهيدروكلوريك المولاري. هذه المحللات جاهزة الآن للرحلان الكهربائي في ثمانية إلى 16٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد لتحديد مستوى التعبير عن بروتين وارنر تحت تأثير تركيزات متفاوتة من الجالاكتوز.

أولا ، قم بتحفيز الثقافات بتركيزات مختلفة من الجالاكتوز لمدة ست ساعات. ثم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في البخاخ الذي يحتوي على مثبطات البروتين. أضف حبات زجاجية من 425 إلى 600 ميكرون إلى الخليط وكسر الخلايا عن طريق دوامة الدوامة بسرعة عالية لمدة دقيقة ، متبوعة بالجليد لمدة دقيقة.

كرر لمدة ثماني مرات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي المتجانس الناتج لمدة خمس دقائق عند 15 ، 000 جي ثانية وجمع الكسر الطافي. بعد قياس كمية البروتين في كسور المحللة بطريقة برادفورد ، قم بحل تركيزات متساوية من البروتين على ثمانية إلى 16٪ من المواد الهلامية Poly acrylamide SDS ، ثم يتم تحديد تعبير Werner عن طريق تعبير Western blot Werner في sgs.

يستعيد أحد المراكز الثلاثة الأولى النمط الظاهري للنمو البطيء للمراكز الثلاثة الأولى كما هو موضح في هذه الصور. عندما تحولت السلالات الثلاثة العليا مع ناقل Werner أو sgs خط واحد على صفيحة التربتوفان SC تحتوي إما على 2٪ جلوكوز أو 2٪ جالاكتوز. يتسبب التعبير الناجم عن الجالاكتوز عن Werner في نمو سلالة SGS واحدة من الثلاثة الأوائل بشكل أبطأ.

في المقابل ، فإن السلالة الأبوية من النوع البري أو SGS سلالة واحدة تحولت مع Werner لا تتأثر في نموها ، مما يشير إلى أن النمو البطيء الذي منحه Werner خاص ب sgs. خلفية واحدة من الثلاثة الأعلى. عندما تم تحويل السلالات الثلاث الأولى مع متغيرات من Werner على ألواح التربتوفان SC التي تحتوي إما على 2٪ جلوكوز أو 2٪ جالاكتوز فقط.

فيرنر الميت من نوكلياز خارجي لا يزال قادرا على استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء. يوضح هذا أن نشاط هيليكاز Werner ATPase ولكن ليس نشاط نوكلياز خارجي مطلوب لاستعادة النمط الظاهري للنمو البطيء للثلاثة الأوائل. في خلفية SGS واحدة من الثلاثة الأوائل ، أعاد Werner النمط الظاهري للنمو البطيء ل SGS أحد المراكز الثلاثة الأولى في جميع أنحاء نطاق تركيز GAL.

تشير هذه النتائج إلى أن استعادة النمط الظاهري للنمو البطيء في الخلفية الطافرة الثلاثة الأولى تحدث عند مستويات تعبير بروتين فيرنر المنخفضة. عندما تنمو ثقافات sgs لوغاريتميا ، تم رصد واحدة من السلالات الثلاث الأولى التي تحولت مع Werner أو متغيراتها في تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف على ألواح التريتوفان SC التي تحتوي على الجلوكوز أو الجالاكتوز وإما MMS أو HU. لاحظنا أن تعبير فيرنر زاد من حساسية MMS واثنين من SGS واحدة من السلالات الثلاثة الأولى. علاوة على ذلك ، فإن هذا التأثير على حساسية MMS و HU في خلفية SGS الثلاثة الأولى تتطلب نشاط هليكوبتر Werner ATP ، ولكن ليس نشاط clease exon.

أخيرا ، يستعيد تعبير Werner أيضا التأخير المميز SG الثاني من المراكز الثلاثة الأولى كما يتضح من ارتفاع عدد الخلايا الكبيرة ذات النطح. في sgs واحدة أعلى ثلاثة خلايا طفرة التعبير عن [ورنر]. بالمقارنة مع sgs ، تم تلطيخ واحدة من الخلايا الثلاث العلوية التي تحولت بالخلايا المتجهة ب Dabi.

لتصور النوى والأسهم تشير إلى النوى غير المقسمة تعبير فيرنر. في sgs المحولة ، تم تحفيز واحدة من الخلايا الثلاث العلوية عن طريق إضافة تركيزات الجالاكتوز المشار إليها وتم حصاد الخلايا بعد ست ساعات من الحث. تم تحميل كميات متساوية من محللة الخلايا الكلية على ثمانية إلى 16٪ من المواد الهلامية SDS بولي أكريلاميد متبوعة بالكشف عن الدم الغربي باستخدام الجسم المضاد لوارنر.

لقد أوضحنا لك كيفية التحقيق في الأنماط الظاهرية الخلوية المرتبطة بالخلفيات المتحولة للخميرة المحددة لتوضيح الوظائف الخلوية والجزيئية لجين المتعلم البشري بوساطة أنشطته التحفيزية وتفاعلات البروتين. يمكن استخدام الخميرة ككائن حي نموذجي لدراسة وظائف الجين في مسارات محددة. عند القيام بهذه الإجراءات ، من المهم تحديد خلفية خميرة متحولة مناسبة لتمييز دور الجين قيد التحقيق في مسارات محددة.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.