تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

مرحباً، اسمي سيليست بيترسون، وأنا زميلة في جامعة هارفارد أدرس مجتمعات الغشاء الحيوي الميكروبي. لذا، أقوم بتحليل المجتمعات البكتيرية من خلال فحص تسلسل 16S rRNA وكيفية تغير هذا التسلسل عبر الزمن والمكان. ولتحقيق ذلك، أستخدم تقنية DGGE.

هذا ليس تشغيلاً طبيعياً للعين، إذ يجب الحفاظ على درجة حرارة 60 درجة عند التشغيل، كما يجب ضخ المحلول المنظم باستمرار. لذا، سنقوم بتدفئة المحلول المنظم لمدة ساعة تقريباً حتى يصل إلى 60 درجة، ومن ثم يمكننا تشغيل المنشفة. سأقوم الآن بغسل هذه اللوحة بمحلول uc مخفف، مع البحث عن الشوائب، ومن ثم إضاءتها.

يمكن لأي شيء من هذا القبيل أن يتسبب في حدوث عدم انتظام. من المهم مسح جميع آثار المياه. لذا، عند تجميع الهلام، سأضع تلك الشريحة على الجانب الخارجي من الهلام.

وبذلك سيكون الهلام بين هاتين القطعتين من الزجاج، بينما تكون الشريحة في الخارج ولن تؤثر على الهلام الموجود بينهما. والآن سأقوم بتجميع الهلام في هذه المشابك، ثم أضغطهما معاً وأقوم بإحكامهما عن طريق التدوير جهة اليمين. وكما هو الحال مع أي هلام، من المهم التأكد من أن الجزء السفلي مستوٍ تماماً.

ولمنع التسرب، نقوم الآن بقلب الهلام ووضعه هنا ليتم إحكامه باستخدام الحاشية. لذا من المهم عند القيام بذلك أن تكون الصفائح محاذية تماماً للحاشية هنا. بعد ذلك، يتم إدخال هذه المقابض الجانبية والضغط لأسفل لإتمام عملية الإحكام.

هذه محقنة بحجم 30 mil. وهذا الجزء وهذا الجزء يأتيان مع مجموعة bio red ويتم تركيبهما بهذا الشكل. والغرض من ذلك هو مجرد التخلص من المياه الزائدة في الأنابيب.

ضع الأنابيب فوق الهلام لتحميل الهjLabel. أولاً، ضع محولاً في الأنبوب ثم إبرة باستخدام ذلك المحول الصغير وضعها في منتصف الهلام تماماً بحيث تكون أسفل الزجاج السفلي بقليل. بعد ذلك، يدخل هذا المحول السلكي في الأنبوب الطويل وسيتصل بمحقنتين تحتويان على المحلول عالي الكثافة والمحلول منخفض الكثافة.

هذه محاليل مُحضرة مسبقاً. لقد أضفتُ صبغةً إلى المحلول الأزرق للإشارة إلى أنه المحلول الأكثر إحداثاً للمسخ، بينما هذا هو المحلول الأقل إحداثاً للمسخ، وهو المحلول منخفض الكثافة. وكلاهما يحتويان على جميع المكونات.

والآن سأقوم بتحضير، في الواقع، ضعف الكمية لهذا الأسبوع. وبمجرد وصول درجة الحرارة إلى المستوى المطلوب، يكون لديك حوالي خمس إلى سبع دقائق لملء الهلام قبل أن ترتفع الأعمدة. والآن نملأ المحقنة بالمحلول.

سأقوم بملئه بنحو 15 µL من المحلول. ومن ثم، وللتخلص من أي فقاعات هوائية، سأقلبه رأساً على عقب وأضغط بلطف حتى تختفي الفقاعة الهوائية العلوية. الآن، سيتم وضع هذا المسمار الصغير هنا في هذا المجرى.

سوف يتم محاذاة هذا المهايئ مع هذا المشبك هنا، وسيتم تثبيته بإحكام شديد باستخدام مشبك C. وبعد ذلك، سيتم توصيل هذا الأنبوب بالمحقنة. ويتم تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الآخر مع المصفوفة عالية الكثافة حيث يحين وقت التوصيل.

لذلك، سأقوم بتدوير هذه العجلة بحركة منتظمة باتجاه عقارب الساعة. وسوف يخرج المحلول الأزرق أولاً لأنه الأكثر كثافة، ليشكل الجزء السفلي من الهلام. وبعد فترة وجيزة، سيبدأ المحلول الشفاف في ملء الهلام، وبذلك يتكون التدرج.

ضعها للحظة بميل طفيف، وبمجرد الانتهاء من صب الهلام (gel)، اغسل الأنابيب فوراً لأنها ستتخثر. ستنتقل المجموعة إلى هناك. ثم اضغط لأسفل. هكذا هذا الجزء الصغير، وسأفعل الشيء نفسه على الجانب الآخر. حسناً.

أهلاً بكم، اسمي سيليست بيترسون، وأنا زميلة في جامعة هارفارد حيث أدرس المجتمعات الحيوية الميكروبية. أقوم حالياً بتوصيف المجتمعات البكتيرية من خلال دراسة تسلسل 16S rRNA وكيفية تغير هذا التسلسل عبر الزمن والمكان. ولتحقيق ذلك، أستخدم تقنية DGGE.

يُقصد بـ DGE الترحيل الكهربائي للهلام الممسخ (Denaturing gel electrophoresis). وتعتمد الفكرة بشكل أساسي على وجود تدرج، حيث يتم ممسخة الحمض النووي DNA أثناء تحركه عبر هذا التدرج. وبناءً على ذلك، ستتوقف السلاسل المختلفة عند نقاط متفاوتة على طول هذا التدرج.

وبذلك ينتهي الأمر ليكون بمثابة بصمة لأنواع الـ sexiness المختلفة في المجتمع. لذا، فإن الهدف من تجربتي هو معرفة المكونات الموجودة في المجتمع وكيفية تغيرها عبر الزمان والمكان. ويمكنني تشغيل هلام sexiness DDD، ومن ثم قص النطاقات وتحديد الأنواع الممثلة في كل مجتمع.

لذا، فإن إحدى أكبر المشكلات عند إجراء هلام DDG هي تحديد التدرج الأفضل؛ وهذا الأمر يتطلب التجربة والبحث لمعرفة نوع التدرج المناسب لمجتمع معين. والتدرج الذي أستخدمه اليوم هو 35 إلى 55%urea.

تتمثل إحدى المشكلات الكبيرة التي قد تحدث في هذه التقنية في ظهور لطخات في المسارات. وقد وجدت أن أفضل السبل للتعامل مع ذلك، لأي سبب كان، هو تشغيل الهلام لفترة زمنية طويلة جداً، وعندها تختفي هذه اللطخات. حسنًا، أنا أستخدم هذه التقنية اليوم للمجتمعات البكتيرية العامة، ولكن يمكن استخدامها أيضاً لعائلة محددة من البكتيريا لمعرفة كيفية تغيرها بمرور الوقت، وعادةً ما تكون هذه الهلامات نظيفة جداً.

يمكنك أيضاً فحص الطفرات في جينات مفردة باستخدام تقنية DDGE.