الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

يتم جمع خلايا الدم الحمراء للمتبرع بها أولا من أسماك الغلوبين GFP المعدلة وراثيا عن طريق ثقب قلب المتبرع وشفط خلايا الدم الحمراء. بمجرد تحضير الخلايا للحقن ، يتم حقن الأسماك المتلقية للحقن في الحجاج ثم يتم تصويرها لاحقا باستخدام الفحص المجهري الفلوري القياسي للحيوان الكامل للحقن الناجح للخلايا ذات العلامات الفلورية. وبالمثل ، يتم تحضير صبغة دكسترين ملونة مترافقة مع تكساس الأحمر وحقنها خلف الحجاج ويتم تصوير المحقون للحقن بنجاح.

مرحبا ، أنا إميلي أتش من مختبر ليونارد زان في قسم أمراض الدم والأورام في مستشفى الأطفال في بوسطن. سنعرض لك اليوم إجراء الحقن الرجعي الحجاجي في أسماك الزرد البالغة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم.

لذلك دعونا نبدأ. سنعرض الحقن القهقرية لخلايا GFP الغلوبين المعدلة وراثيا ودكسترين صبغة فلورية حمراء مترافقة مع تكساس الأحمر إلى أسماك كاسبر البالغة ، وهي سلالة شفافة من أسماك الحمار الوحشي لتحضير اللوبين المعدل وراثيا. تنزف خلايا GFP الأسماك المتبرعة البالغة باستخدام طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر مغطى بالهيبارين لثقب الأسماك خلف الخياشيم ، وشفط خلايا الدم الحمراء وتوزيعها في مخزن مؤقت للخلية.

بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية على شبكة 40 ميكرومتر. بعد تحديد تركيز الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي كما هو موضح سابقا بواسطة LeBlanc etal ، تنفق على الخلايا عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. يقوم Reus بتعليق الخلايا في المخزن المؤقت للخلية بالتركيز المطلوب بحيث لا يزيد حجم الحقن النهائي عن خمسة ميكرولترات.

في هذا العرض التوضيحي ، سنقوم بحقن 1.5 إلى 2 مليون خلية لكل متلقي لتحضير صبغة الفلورسنت الحمراء ، وإذابتها في DPBS للحصول على تركيز حقن نهائي من 10 إلى 12 ملليغرام لكل مليلتر. سنقوم بحقن أربعة ميكرولتر لكل سمكة لأن إجراء الحقن هو نفسه. بغض النظر عن المادة المحقونة ، سنعرض فقط حقن صبغة الفلورسنت الحمراء.

قبل حقن السمك ، اغسل حقنة هاميلتون ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 70٪ من الإيثانول. اشطفها ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 0.9 XDPS. بعد تخدير السمك في تريكا ، ضع الجانب الظهري للسمكة لأعلى وواجها اليمين على إسفنجة رطبة.

أمسك حقنة هاميلتون المحملة بيدك اليمنى وإصبعك السبابة على المكبس بيدك اليسرى لتثبيت جسم السمكة برفق. ضع الإبرة بحيث تكون الشطبة متجهة لأعلى ، بحيث إذا كانت عين السمكة عبارة عن ساعة ، فإن الإبرة تشير إلى موضع الساعة السابعة. وبزاوية 45 درجة على السمكة ، أدخل الإبرة برفق من ملليمتر إلى ملليمترين في موضع الساعة السابعة واضغط على المكبس ببطء.

اسمح للأسماك بالتعافي في الماء العذب E ثلاثة. حافظ على تدفق الأسماك لمدة أسبوع واحد مع تغييرات المياه اليومية لتجنب العدوى ، نحتفظ بالأسماك في مياه وحدة العناية المركزة لهذه الفترة. عندما يتم إجراء الحقن خلف الحجاج بشكل صحيح ، من الممكن تصور المواد المحقونة التي تم تصنيفها.

على سبيل المثال ، يمكن رؤية خلايا الدم الحمراء للجلوبين GFP المعدلة وراثيا تحت مجهر تشريح الفلورسنت المنتشر في الأوعية الدموية لذيل أسماك كاسبر البالغة المتلقية بعد ثلاثة أيام من الحقن ، وبالمثل الحقن الناجح لدكسترين 70 كيلودالتون مترافق مع تكساس الأحمر ينتج على الفور الأوعية الدموية الفلورية. في أسماك كاسبر البالغة الشفافة ، والتي يمكن تصورها بسهولة عن طريق الفحص المجهري القياسي للحيوانات الكاملة ، يمكن أيضا حقن خلايا نخاع الكلى ذات الثقب الفلوري من الأسماك المانحة بيتا أكتين GFP المعدلة وراثيا عن طريق الفم في سمكة متلقية كاسبر مشعة. ستكون هذه الخلايا في النهاية موطنا لنخاع المتلقي كما هو موضح هنا ، بعد ثلاثة أيام من الحقن ، وبعد أربعة أسابيع ، قد تستمر هذه الخلايا المانحة الخضراء في إعادة ملء الكلية المتلقية.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء الحقن القهقرية في أسماك الزرد البالغة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحقن بالإبرة بزاوية 45 درجة على مستوى السمكة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.