قياس الفولتية المستحثة الأغشية مع ثنائي ANEPPS - 8

بالنسبة لعالم الأحياء، تمثل الخلية لبنة بناء الحياة التي تحتوي على عدد من العضيات المختلفة، حيث تؤدي كل منها مهاماً محددة، وتسمح مجتمعة للخلية بأداء وظائفها الحيوية من منظور كهربائي. ومع ذلك، فإن البنية الداخلية ليست ذات أهمية كبيرة، ويمكن النظر إلى الخلية على أنها سيتوبلازم موصل محاط بغشاء عازل ومحاط بوسط خارجي موصل. ويؤدي وجود خلل بسيط في التركيزات الأيونية، مع تراكم الأيونات الزائدة بالقرب من الغشاء، إلى نشوء جهد الغشاء وقت الراحة.

يؤدي وضع الخلية في مجال كهربائي إلى إعادة توزيع الشحنات محلياً على كلا جانبي الغشاء. والنتيجة هي جهد الغشاء المستحث، الذي يتراكب مع جهد الراحة ويختفي بعد إيقاف المجال. وفي حالات أشكال الخلايا البسيطة، يمكن حساب جهد الغشاء المستحث تحليلياً للخلية الكروية.

يتم تحديد ذلك بواسطة معادلة شوان (Schwan's equation)، والتي تنص على أن الجهد يتناسب طردياً مع قوة المجال وحجم الخلية، ويتبع دالة جيب التمام (cosign function) على طول الغشاء. وبالنسبة لأشكال الخلايا الأكثر تعقيداً، يمكن أن ينحرف الجهد المستحث بشكل كبير عن دالة جيب التمام، ويجب تحديده إما عددياً باستخدام حاسوب قوي أو تجريبياً باستخدام صبغة قياس الجهد. ومن صبغات قياس الجهد المستخدمة على نطاق واسط لهذا الغرض صبغة DiBAC₄(3).

تعتبر AIPs صبغة سريعة تعتمد أطياف الإثارة والانبعاث الخاصة بها على جهد الغشاء، حيث تصبح هذه الصبغات فلورية بقوة عند ارتباطها بالغشاء، وتكون التغيرات في شدة الفلورة متناسبة مع التغير في جهد الغشاء. يوضح هذا الفيديو البروتوكول المستخدم لقياس جهد الغشاء المستحث باستخدام D AIPs. في هذا المثال، تم استخدام خلايا مبيض هامستر الصين، حيث وُزعت الخلايا في غرف بمعدل 100,000 خلية لكل غرفة.

في مزرعة HAMF 12، يتم تدعيم الوسط بمصل جنين العجل و L glutamine والمضادات الحيوية، ثم تُحضن الخلايا في وسط المزرعة لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات للحصول على خلايا ملتصقة ذات شكل كروي، أو من 16 إلى 20 ساعة للحصول على خلايا ملتصقة مفردة ذات أشكال أكثر تعقيداً. يتم تحضير محلول مخزون بتركيز 10 million MO من diet aaps المذاب في DMSO في العبوة الأصلية. قد تتطلب بعض السلالات الخلوية إضافة onic لتسهيل دمج الصبغة في الغشاء. يتم نقل 1 milliliter من spinners، وهو تعديل للوسط الأساسي الأدنى SMEM، إلى أنبوب EOL مع إضافة 2.5 µL من 20%onic وثلاثة µL من 10 mM diet aaps.

ينتج عن ذلك محلول تحميل يحتوي على ما يقرب من 30 micromolar من diet aaps و 0.05% من onic. استبدل الوسط الزرعي في الحجرة بمحلول التحميل. انقل الحجرة إلى الثلاجة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

يتم تثبيط استيعاب الصبغة داخلياً عبر الغشاء البلازمي بشكل كبير بعد عملية التلوين، لذا اغسل الصبغة الزائدة بعناية عدة مرات باستخدام SMEM نقي. أخيراً، اترك 1.5 milliliters من SMEM في الحجرة. يتم فحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري مزود بعدسة شيئية غمر زيتية، وموحد لون (monochromator)، وكاميرا CCD.

في برنامج الحصول على البيانات، اضبط طول موجة الاستثارة على 419 nanometers واختر مرشح تمرير نطاق مضبوط عند 605 nanometers تقريبًا، رغم عدم تطبيقه هنا. يتيح برنامج Diet aaps أيضًا قياسات نسبية لجهد الغشاء. ضع الحجرة التي تحتوي على الخلايا على منصة المجهر، وحدد موقع الأقطاب الكهربائية في قاع الحجرة وقم بتوصيلها بمولد النبضات.

في هذا المثال، يتم توليد نبضة مربعة بجهد 35 volts ومدة 50 millisecond. باستخدام مزود جهد تيار مستمر ومبدّل يتم التحكم فيه بواسطة معالج دقيق، يتم توصيل النبضة إلى زوج من الأقطاب الكهربائية، مما يؤدي إلى إنشاء مجال كهربائي بينهما وتحفيز جهد الغشاء. كما يجب أن يكون توصيل النبضة متزامناً مع عملية الحصول على الصور.

حدد الخلايا المستهدفة، ثم طبق نبضة كهربائية واحدة أو سلسلة من النبضات لكل نبضة. التقط صورتين فلوريتين، صورة التحكم مباشرة قبل النبضة وصورة النبضة أثناء النبضة نظراً للاستجابة المنخفضة للصبغة. يصعب تمييز التغييرات في الفلورة ولا تصبح واضحة إلا بعد معالجة الصور المفتوحة لكل نبضة.

اطرح الخلفية من كل من الصورة الضابطة وصورة النبضة. اختر خلية واحدة وحدد المنطقة المستهدفة (region of interest) بحيث تتوافق مع الغشاء. قم بقياس الفلورة على طول هذه المنطقة في الصورة الضابطة وصورة النبضة، ثم انقل القيم إلى جدول بيانات لكل نبضة.

اطرح بيانات الضابطة من بيانات النبضة واقسم النتيجة على بيانات الضابطة للحصول على تغيرات الفلورة النسبية. وفي حال تطبيق سلسلة من النبضات، يمكن حساب متوسط قيم التغيير النسبي المحددة لكل نبضة. وللحصول على قياس أكثر موثوقية، قم بتحويل تغيرات الفلورة النسبية إلى جهد الغشاء المستحث.

باستخدام منحنى معايرة، يمكن الحصول على تقدير تقريبي لهذا المنحنى من الأدبيات العلمية، ولكن لتحقيق دقة أعلى، يجب قياسه لكل إعداد تجريبي محدد. قم برسم الجهد كدالة لطول القوس النسبي. كما يمكن تنعيم المنحنى باستخدام مرشح مناسب للخلايا الكروية.

الرسم البياني الناتج يقترب من شكل جيب التمام، وهو ما يتفق مع معادلة شوان (Schwan's equation). وبالنسبة لأشكال الخلايا الأكثر تعقيداً، فإن اتباع الإجراء نفسه يؤدي إلى توزيعات مكانية أكثر تعقيداً لجهد الغشاء.