قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

يوفر هذا البروتوكول طريقة عامة لقياس معدل الالتقام الخلوي لمعظم بروتينات الغشاء البلازمي باستخدام كواشف نفاذ الغشاء القابلة للاختزال؛ في هذا الإجراء، يتم وسم بروتينات سطح الخلية التي تحتوي على لايسينات خارج خلوية أو الموصومة تساهمياً عند درجة حرارة 4 °C باستخدام sulfo-NHS-SS-biotin الموضح هنا باللون الأخضر. بعد ذلك، يتم تدفئة الخلايا إلى 37 °C للسماح بالالتقام الخلوي لبروتينات السطح. ثم تُعاد الخلايا إلى 4 °C لإيقاف حركة الغشاء، ويتم إزالة البيوتين المتبقي على السطح باستخدام عامل مختزل يكسر الرابطة ثنائية الكبريتيد.

وبالتالي، فإن البروتينات المبيوتنلة الوحيدة التي تبقى هي تلك التي نشأت على سطح الخلية وتم استدخالها وحمايتها من إجراء عملية الإزالة. وفي الختام، يتم إذابة الخلايا وعزل البروتينات المبيوتنلة بواسطة كروماتوغرافيا الألفة وstrep avid. مرحباً، أنا لوك غابرييل من مختبر هيلي ميلك إيان في قسم الطب النفسي بجامعة ماساتشوستس كلية الطب.

سنعرض لكم اليوم إجراءً حول كيفية قياس معدلات الالتقام الخلوي أو الاستدخال باستخدام تقنية إزالة البيوتين العكوسة. نستخدم هذا الإجراء لقياس معدل استدخال ناقل الدوبامين. لذا، فلنبدأ.

قبل يوم واحد من التجربة، قم بتجهيز الخلايا والركائز لاستخدامها في اليوم التالي. ستختلف أنواع الخلايا والأوساط المستخدمة، ولكن إذا لم تكن الخلايا التجريبية شديدة الالتصاق، فاستخدم ركيزة مناسبة لالتصاق الخلايا مثل أطباق زراعة الأنسجة المطلية بالبولي ليسين في كل طبق سداسي الفجوات. قم بتمييز أربع فجوات في المجمل باستخدام طبقين منفصلين.

لكل بروتين يتم اختباره، سيتم استخدام بئرين في لوحة الضبط لبروتين السطح الكلي وضوابط الإزالة. قم بتجهيز بئر في اللوحة التجريبية لكل حالة استيعاب داخلي يتم اختبارها. قم بزراعة 1×10⁶ خلية في 2 mL من المزرعة الخلوية بحيث تصل الخلايا إلى حالة تلاقي بنسبة 80% تقريباً بحلول اليوم التالي.

بعد استزراع الخلايا، قم بتحضير المحاليل التالية وتخزينها عند درجة حرارة 4 °C لاستخدامها في اليوم الثاني. يتم تحضير محلول PBS 2+ من محلول الفوسفات المنظم الملحى عند pH 7.4، ويتم تدعيمه بـ 1.5 millimolar من كلوريد المغنيسيوم و 0.2 millimolar من كلوريد الكالسيوم. يتم تحضير محلول إخماد التنوير (tonation quench solution) باستخدام PBS 2+ المدعم بـ 100 millimolar من الغليسين. يتم تحضير منظم NT باستخدام 150 millimolar من كلوريد الصوديوم، و 1 millimolar من EDTA، و 0.2%BSA، و 20 millimolar من tris عند pH 8.6. يتم تحضير منظم Ripa باستخدام 10 millimolar من tris عند pH 7.4، و 150 millimolar من كلوريد الصوديوم، و 1 millimolar من EDTA، و 0.1%SDS، و 1%trite x 100، و 1% من sodium deoxy coate.

بعد ذلك، قم بتحضير المحلول المخزون لـ SULF N-H-S-S-S biotin عن طريق إذابته في SULFOXIDE أو DMSO حتى يصل التركيز إلى 200 mg/mL. قم بتقسيم المحلول إلى حصص حجم كل منها 500 µL واحفظها عند درجة حرارة -20 °C. يمكن لهذه الحصص أن تخضع لعدة دورات من التجميد والإذابة بعد هذه الخطوة.

يتم تحضير المحلول المخزون من ثنائي كاربوكسي إيثيل فوسفين هيدروكلوريد (TCEP) بتركيز 500 millimolar مذاباً في tris بتركيز 50 millimolar، ويتم ضبط الـ pH ليكون 7.4. ونظراً لأن TCEP حمضي للغاية، فسيحتاج الـ pH الخاص بالمحلول إلى ضبط ليصل إلى 7.4؛ ثم يُغطى TCEP بورق القصدير قبل تخزينه في درجة حرارة minus 20 degrees Celsius. وفي اليوم الثاني، يتم تحضير PBS two plus مدعماً بـ 0.18% glucose و 0.2% IgG protease free bovine serum albumin أو PBS two plus GBSA، ويُسخن مسبقاً إلى 37 degrees Celsius في حمام مائي.

قم بإذابة المحلول المخزون من SFO N-H-S-S-S biotin في درجة حرارة الغرفة. قم بتحضير محلول sulfur N-H-S-S-S biotin طازج مباشرة قبل الاستخدام، ثم قم برج المحلول بقوة باستخدام جهاز vortex لإذابة DMSO.

ضع كلا اللوحين في حمام ثلجي داخل غرفة باردة، واشطف كل بئر ثلاث مرات باستخدام 2 mL من محلول PBS 2+ المثلج، مع إبقاء الألواح بزاوية مائلة قليلاً لضمان التصريف الكامل للمحلول المنظم. بعد الغسلة الأخيرة، أضف 0.75 mL من محلول sulfa N-H-S-S-S biotin الطازج إلى كل بئر. حضّن الألواح لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C في الحمام الثلجي مع الرج القوي باستخدام هزاز منصي قبيل نهاية فترة التحضين.

قم بتحضير محلول SUHO N-H-S-S-S biotin طازج آخر، وعند مرور 15 دقيقة استبدل المحلول القديم بالمحلول الطازج. قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة إضافية عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius مع الرج القوي باستخدام هزاز منصي (platform shaker). بعد التحضين الثاني، اغسل الخلايا ثلاث مرات بسرعة باستخدام 2 mL من محلول الإخماد (quenching solution) لإخماد جميع جزيئات NHS biotin غير المتفاعلة. ثم قم بالتحضين في 2 mL من محلول الإخماد لمدة 15 دقيقة.

استبدل محلول الإخماد بمحلول جديد عند الدقيقة 15، ثم حضن العينات لمدة 15 دقيقة إضافية. حافظ على الأطباق عند درجة حرارة 4 °C مع الرج الخفيف باستخدام هزاز منصي خلال كل فترة تحضين، بينما يوضع طبق التحكم في محلول الإخماد على سطح العمل في الغرفة الباردة. قم بإخراج الطبق التجريبي من الغرفة الباردة ووضعه في حمام ثلجي عند هذه النقطة.

في حالة اختبار العلاجات الدوائية، تُضاف تركيزات الدواء المناسبة إلى محلول PBS two المسخن مسبقاً والمضاف إليه GBSA. نستخدم هنا إما ناقلاً من الإيثانول أو 1 µM من PMA أو Myristate acetate لتنشيط مسار PKC. تُغسل كل بئر في اللوحة التجريبية ثلاث مرات باستخدام 2 mL من محلول PBS two المسخن مسبقاً والمضاف إليه GBSA، مع إضافة العلاجات الدوائية المناسبة بعد عملية الغسل الأخيرة.

أضف 2 mL من محاليل PBS 2+ GBSA المناظرة واملأ أي آبار فارغة بوسط زراعي مسخن مسبقاً لضمان توزيع متساوٍ لدرجة الحرارة عبر الطبق. انقل الخلايا إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق مباشرة قبل نهاية فترة الحضن. قم بتحضير محلول غسل (stripping solution) طازج باستخدام محلول TCEP بتركيز 50 mM في منظم NT واحتفظ به على الثلج.

قم بتحضير كمية كافية بمعدل واحد مليلتر لكل بئر. بعد فترة الحضانة التي تستمر لمدة 10 دقائق، انقل لوحة التجربة بسرعة إلى حمام ثلجي ثم أعدها إلى الغرفة الباردة. اغسل آبار التجربة ثلاث مرات باستخدام اثنين مليلتر لكل بئر من محلول NT buffer المبرد بالثلج لوقف عملية الالتقام الخلوي.

بعد ذلك، يتم غسل بئر ضابط الإزالة ثلاث مرات باستخدام 2 mL من منظم NT المبرد بالثلج. تُترك آبار الضابط الكلي في محلول الإخماد. يُضاف 1 mL من محلول الإزالة إلى كل بئر تجريبي وبئر ضابط الإزالة، ثم تُحضن على الثلج لمدة 15 دقيقة.

أربع درجات مئوية مع رج خفيف قبل نهاية فترة التحضين. مرة أخرى، قم بتحضير نفس الحجم من محلول الغسل (stripping solution) الطازج كما سبق. بعد 15 دقيقة، استبدل محلول الغسل القديم بمحلول طازج وحضّن لمدة 15 دقيقة إضافية عند أربع درجات مئوية مع رج خفيف لتحليل الخلايا أولاً.

اغسل جميع الآبار التي تعرضت لمحلول الإزالة ثلاث مرات باستخدام 2 mL من منظم NT. ثم اغسل جميع الآبار، بما في ذلك ضوابط الإجمالي، ثلاث مرات باستخدام 2 mL من محلول pbs البارد. بعد الغسلة الأخيرة، أضف 300 µL من منظم RIPPA الذي يحتوي على مثبطات بروتياز حديثة إلى كل بئر، ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق الرج لمدة 20 دقيقة عند 4 °C.

انقل المستخلص إلى أنابيب دقيقة سعة 1.5 milliliter وقم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 18, 000 GS في درجة حرارة أربع درجات Celsius. استخدم مقايسة بروتينية متوافقة مع ظروف التحلل المستخدمة، على سبيل المثال، مقايسة BCA البروتينية من Pierce لتحديد تركيز البروتين في المستخلص مقارنة بمنحنى قياسي لألبومين المصل البقري. بعد ذلك، قم بتجهيز المستخلصات لكروماتوغرافيا الألفة وكروماتوغرافيا strep.

املأ أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter بكميات متكافئة من البروتين من كل عينة. في هذه التجربة، نقوم بعزل البروتينات المرتبطة بالبيوتين من 50 microgram من نواتج تحلل الخلايا. أضف ripa buffer المحتوي على مثبطات البروتياز للوصول إلى حجم نهائي قدره 200 microliters لكل عينة.

بعد ذلك، قم برجّ خرزات الستريبتيفيدين (strep avid) وخرزات الأجرو (agro beads) بقوة باستخدام جهاز الـ vortex قبل الاستخدام، ثم استخدم ماصة سعة 200 microliter مع قص طرف الماصة لنقل 20 microliters من خرزات الستريبتيفيدين والخرزات إلى كل أنبوب. رجّ الأنابيب باستخدام الـ vortex وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على جهاز تدوير الأنابيب. وفي اليوم التالي، قم بجمع الخرزات عن طريق طرد العينات مركزياً عند 18,000 Gs لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب السائل التحليلي بحذر مع تجنب الاقتراب من كتلة الخرزات بالشفاط، وأضف 0.75 milliliters في درجة حرارة الغرفة.

أضف محلول التمزق (Rip buffer) إلى كل أنبوب وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس بأقصى سرعة لغسل الخرزات. قم بالطرد المركزي عند 18, 000 GS لمدة دقيقتين. في درجة حرارة الغرفة لجمع الخرزات وكرر دورة الغسل والرج والطرد المركزي هذه مرتين إضافيتين، ليصبح المجموع ثلاث غسلات بعد الغسلة النهائية.

قم بسحب أكبر قدر ممكن من المحلول المنظم دون تحريك كتلة الخرزات. بعد ذلك، أضف من 20 إلى 25 µL من محلول لامي المختزل بتركيز 2x إلى كل أنبوب. سيعمل العامل المختزل على كسر رابطة ثنائي كبريتيد biotin N-H-S-S-S، مما يؤدي إلى تحرير البروتينات المعزولة في المحلول.

نظرًا لأن معظم بروتينات الغشاء لا تتحمل الغليان، يتم تحضين الأنابيب على جهاز تدوير لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد عملية الاختزال والمسخ لفصل البروتينات. باستخدام تقنية SDS PAGE القياسية، تُنقل البروتينات من الهلام إلى غشاء لإجراء عملية اللطخة المناعية (immunoblotting)، ثم يتم التفاعل مع جسم مضاد مناسب. في هذه التجربة، استخدمنا جسماً مضاداً من جرذ ضد DAT من شركة Checon رقم 360 9 بتخفيف 1:2000. يتم التقاط الحزم ذات التفاعل المناعي باستخدام نظام توثيق الهلام بكاميرا CCD، مع التأكد من عدم وجود بكسلات مشبعة. وفي هذه التجربة، استخدمنا نظام التصوير BioRad VersaDoc مع برنامج Quantity One لتقدير كثافة كل حزمة كمياً.

يظهر هنا مربع مناعي تمثيلي من إجراء الإزالة العكسية على ناقل الدوبامين. وتتمثل أقوى إشارة في الكمية الإجمالية للبروتين السطحي قبل الاستدخال، والتي تظهر في المسار الإجمالي أو T. ومن المفترض أن تكون عينة التحكم في الإزالة أو S قريبة من الفراغ وأن تظهر كفاءة إزالة عالية. يتم حساب كفاءة الإزالة باستخدام قياسات كثافة النطاق وفقاً للصيغة التالية.

كانت كفاءة هذا الشريط في هذه التجربة 99.8%؛ وتعتبر الأشرطة التي تبلغ كفاءتها 90% أو أكثر مثالية، بينما يجب استبعاد النتائج التي تقل عن هذا المستوى. يظهر هذا المثال لشريط مسامي حزمة مرئية في مسار الشريط بكفاءة تبلغ 34%. هنا، تمثل الحزم ذات الكثافة الأقل مسارات الاستدخال من اللوحة التجريبية. عولجت الخلايا إما بمحلول ناقل أو بـ 1 µM من PMA خلال فترة استدخال مدتها 10 دقائق، ثم تم قياس معدلات استدخال ناقل الدوبامين.

يتم حساب معدل الاستدخال باستخدام قياسات كثافة النطاقات على النحو التالي، كما يظهر في هذا الرسم البياني، حيث تم استدخال 10.4% من بروتين DAT السطحي على مدار 10 دقائق تحت ظروف المعالجة بالناقل. أما المعالجة بـ PMA فقد رفعت معدلات استدخال DAT إلى 23.2% من إجمالي DAT السطحي. وبذلك، تكون قد شاهدت للتو كيفية قياس معدلات استدخال بروتينات الغشاء البلازمي باستخدام تقنية التوسيم الحيوي العكوس.

من المهم تذكر أمرين: تحضير كاشف bio tonation حديثاً، وكذلك تحضير TCP مباشرة قبل الاستخدام. وإذا لاحظت فقدان عدد كبير من الخلايا أثناء البروتوكول، فاستخدم ركيزة التصاق الخلايا على أطباقك. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم.