مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل علاج

يعتمد هذا الإجراء على النباتات التي تعبر عن GFP في أنواع معينة من الخلايا ، والتي يمكن بعد ذلك عزلها عن بقية الخلايا النباتية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو الحقائق. يستخدم هذا المثال خطين محددين يعبران في أنواع خلايا معينة من نبات الأرابيدوبسيس. تزرع شتلات جذر أليانا في صواني نباتية أو على أطباق أجار.

يتم حصاد جذورها ومعالجتها بإنزيمات هضم جدار الخلية. بعد ساعة واحدة ، يتم ترشيح المحلول لإزالة الحطام الكبير. ثم يتم طرد المحلول وإزالة المادة الطافية.

يتم فصل البروتوبلاستات الموجبة ل GFP لاحقا عن طريق الفاكس. يمكن استخدام المواد التي تم فرزها لتحليل نوع الخلية مثل ملفات تعريف النسخ على نطاق الجينوم. مرحبا ، أنا باسيان بارمان من مختبر كين بيرنباوم في قسم الأحياء بجامعة نيويورك.

سنعرض لك اليوم إجراء لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة للبروتوبلاستات النباتية. في هذا المثال، سنقوم بفرز نوعين محددين من الخلايا في مسار نبات الأرابيدوبسيس. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ملفات تعريف النسخ الخاصة بنوع الخلية.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة الشتلات البرية وكذلك الشتلات التي لها تعبير خاص بنوع الخلية عن GFP. يمثل محفز الفزاعة الذي يقود GFP الأدمة الباطنة الجذرية والمركز الهادئ في مجموعة واحدة من الشتلات.

وفي مجموعة أخرى ، يتم تمييز مركز سكون الجذر من خلال المشي خمسة مروجين يقودون GFP. تزرع الشتلات في الماء وصواني FIA فوق مرشح النايلون ، مما يسمح للجذور بالنمو في وسط النمو. بدلا من ذلك ، يمكن زراعة النباتات فوق شبكة من النايلون وألواح أجار 1٪ موضوعة عموديا.

بالإضافة إلى المساعدة في حصاد الجذور ، تسمح المرشحات بنقل الشتلات على كتلة إلى صواني نباتية جديدة أو ألواح أجار حيث يمكن استكمالها بمحفز ذي أهمية. يمكن القيام بذلك لدراسة الاستجابات النسخية الخاصة بنوع الخلية للمغذيات أو الهرمونات أو علاجات الإجهاد. تحقق تحت المجهر الفلوري للتحقق من التعبير عن علامة الفلورسنت كما هو متوقع.

تأكد من أن نمط التعبير عن العلامة متسق في ظل ظروف العلاج المطبقة لأنه يمكن أن يتغير نتيجة للعلاج. المضي قدما في حصاد وتحضير البروتوبلاست. ابدأ بتحضير محلول البروتوبلاست.

اجمع بين 1.25٪ من الوزن لكل حجم السليولاز 0.3٪ الوزن لكل حجم ، وزيم مازر 0.4 مولار D مانيتول 20 ملليمولار ، MES ، و 20 ملليمولار KCL في الماء منزوع المعادن واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.7 مع مولر واحد ثلاثي حمض الهيدروكلوريك عند الرقم الهيدروجيني 7.5. سيكون هذا الحل عكرا قليلا. ثم سخني المحلول إلى 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

سوف يتحول المحلول إلى اللون الواضح ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم أضف 0.1٪ من الوزن لكل حجم BSA 10 مللي مولار كلوريد الكالسيوم ، وخمسة مللي مولار بيتا مي كابتو الإيثانول حصاد شتلات عمرها أسبوع واحد من صينية نباتية واحدة. في حالة خط GFP الفزاعة أو ثمانية لوحات من شتلات 5G FP البالغة من العمر أربعة أيام. اكشط الجذور من شبكة النايلون بمشرط ، ثم أودعها في وعاء به محلول بروتوبلاست.

استخدم ما يقرب من 10 مل من محلول البروتوبلاست لكل 1500 شتلة. رج القوارير برفق عند 75 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قد يؤدي وقت الحضانة الأطول إلى زيادة غلة البروتوبلاست ، ولكنه سيضيف أيضا إلى تأثير البروتوبلاستات نفسها على التعبير الجيني.

الآن بعد أن تم إطلاق البروتوبلاستات ، استخدم مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتصفية المحلول وتقسيم تعليق البروتوبلاست بين أنابيب مخروطية سعة 15 مل. من المهم إنشاء تعليق نظيف للبروتوبلاست بدون الكثير من الحطام لمنع انسداد الحقائق وتقليل الوقت اللازم لفرز الخلايا. قم بالطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 500 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لاحظ أن سرعة الطرد المركزي تعتمد على تكوين قسم النبات الذي ينتج عنه البروتوبلاست وكمية بقايا الخلية الناتجة أثناء المعالجة الأنزيمية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة معظم المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على البروتوبلاستات برفق في الحجم الصغير لمحلول البروتوبلاست المتبقي. أخيرا ، قم بحساب البروتوبلاستات باستخدام مقياس الخلوي الدموي وحدد كثافتها لحساب العائد وتحديد معلمات تشغيل الحقائق.

بعد العد ، افحص البروتوبلاست. تحقق من سلامتها ومستوى تعبير GFP ومحتوى بقايا الخلايا الملوثة. بعد ذلك ، انتقل إلى الفاكس.

إذا لم يكن المتابعة مباشرة إلى الفاكس. يمكن غسل البروتوبلاست وإعادة تعليقه وتخزينه في محلول حضانة مثل محلول الطلاء الأولي بدون الإنزيمات المضافة أو محلول W الخمسة. قم بتشغيل فارز الخلايا وكمبيوتر محطة العمل.

هنا نستخدم فريا المصنعة من قبل Becton Dixon and Company. استخدم XPBS واحدا كسائل غمد وقم بتشغيل إجراء بدء التشغيل السائل. قم بتركيب فوهة 100 ميكرومتر واضبط ضغط غمد 20 رطل لكل بوصة مربعة.

قم بإعداد تيار تدفق مستقر ومعايرة تأخير السقوط. لاحظ أن المعايرة غير معروضة في هذا الإجراء. يمكن فرز معلقات Protoplasts بكثافة تصل إلى 10 ملايين خلية لكل مل بنجاح.

من أجل منع ترسيب البروتوبلاستات ، استخدم خيار تحريك العينة على الحقائق. إذا كان انسداد الحقائق يمثل مشكلة ، فهناك ثلاث خطوات ممكنة للتصوير. أولا ، قم بإجراء نموذج لتدفق الخط الخلفي.

ثانيا ، قم بتخفيف تعليق البروتوبلاست لتقليل الكثافة. ثالثا ، قم بتنظيف محلول البروتوبلاست عن طريق تكرار خطوة الترشيح بعد الطرد المركزي وتعليق إعادة التماس. يتم استخدام أربع معلمات فقط لتمييز البروتوبلاستات الموجبة ل GFP عن البروتوبلاستات السلبية GFP وحطام الخلية بعد الإثارة بواسطة مبعثر أمامي بالليزر 488 نانومتر هو مؤشر على حجم الجسيمات ، والتشتت الجانبي كمؤشر على حبيبات الجسيمات.

الانبعاث عند 530 نانومتر كمقياس للتألق الأخضر والانبعاث عند 610 نانومتر كمقياس للتألق الذاتي للطيف الأحمر. ابدأ بإعداد مخطط نقطي للتبعثر الأمامي مقابل التشتت الجانبي. قم بتطبيق إعداد الجهد بحيث يتم توسيط الأحداث المقاسة في المؤامرة.

يمكن تمييز PROTOPLASTS الإيجابية GFP من خلال زيادة نسبة الانبعاث الأخضر إلى الأحمر مقارنة بالأحداث ذات التألق الذاتي. قم فقط بإعداد مخطط نقطي مع التألق الأخضر مقابل التألق الذاتي الطيف الأحمر. قم بتطبيق إعدادات الجهد بطريقة تؤدي فيها الأحداث المقاسة إلى ظهور مجموعة قطرية واحدة في المؤامرة.

عند النظر إلى تعليق البروتوبلاست من النوع البري ، يجب أن تنتج PROTOPLASTS الإيجابية GFP مجموعة واضحة من أحداث الفلورسنت الخضراء التي لم يسبق لها مثيل في عينات النوع البري. قم بتعيين قيود التعويض لضبط التداخل الطيفي بين التألق الأخضر والتألق الذاتي للطيف الأحمر. باستخدام تعليق PROTOPLASTS الإيجابي GFP ، ستسمح إعدادات قيود التعويض المناسبة بفصل أفضل للبروتوبلاستات الموجبة ل GFP عن البروتوبلاستات غير GFP والحطام الذي يضع بوابة لتحديد الأحداث الإيجابية ل GFP.

ينصح بأخذ PROTOPLASTS غير GFP معك في كل مرة تقوم فيها بإعداد تجربة فرز للمساعدة في تحديد حدود البوابة. أخيرا ، قم بتعيين حد عتبة التشتت الأمامية لترك الحطام الصغير خارج التحليل. سيساعد تصور الأحداث الإيجابية ل GFP في مخطط الانتثار الأمامي مقابل مخطط الانتثار الجانبي في تحديد المكان الذي يجب تعيين العتبة.

يمكن إعادة استخدام المعلمات التي تم إعدادها في تشغيل الحقائق الأولية هذه للأنواع المستقبلية. ستكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة للاستخدام اليومي للحقائق. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد أنابيب التجميع التي تحتوي على مخزن مؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي على الأكثر ، استخدم حجم فرز 100 ميكرولتر إلى مخزن مؤقت لاستخراج 350 ميكرولتر كدليل.

ينتج عن 20 ، 000 حدث فرز حجم فرز إجمالي يبلغ حوالي 100 ميكرولتر. الآن بعد أن تم تعيين معلمات الفاكس وأوضاع التشغيل وأصبحت أنابيب التجميع جاهزة ، ابدأ في فرز البروتوبلاست عند اكتمال الفرز. امزج أنابيب جمع العينات حيث يمكن أن يتجمع تعليق الخلية في الأعلى ، ويمكن استخدام أقل من 500 حدث مصنف لتحليل المصفوفات الدقيقة بعد استخراج الحمض النووي الريبي وتضخيم CD NA.

هنا نستخدم مجموعة الاستخراج الدقيقة RNEZ ، ونظام تضخيم WT ovation PICO RNA ووحدة البيوتين CD NA v two. فيما يلي نتائج الفاكس النموذجية للبروتوبلاست المشتقة من شتلات فزاعة غير GFP و GFP و W 5G FP يتم تقديم 100 ، 000 حدث في كل مخطط نقطي من التألق الأخضر على المحور x مقابل التألق الأحمر. على المحور Y ، يتم تمييز الأحداث التي تقع داخل بوابة فرز GFP باللون الأخضر.

هذا ملخص لمحصول البروتوبلاست النموذجي من الشتلات التي تعبر إما عن فزاعة GFP التي تشير إلى الأدم الباطن الجذري ومركز الهدوء أو يمشي 5G FP بمناسبة مركز هدوء الجذر. يوجد عدد أقل من الخلايا في مركز سكون الجذر مقارنة بأدمة الجذر. لذلك ، على الرغم من البدء بمزيد من البروتوبلاست ، فإن إنتاجية الخلايا التي تعبر عن GFP أصغر في فرز 5G FP مقارنة بفرز GFP الفزاعة الموضح هنا هي نتائج استخراج الحمض النووي الريبي النموذجية لعينات ثلاثية.

تتوافق كل عينة مع الحمض النووي الريبي المستخرج من 10،000 حدث. يتم تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج على محلل حيوي يوضح القمم الريبوسومية لعينات GFP الفزاعة في الأعلى ويمكن استخدام عينات 5G FP أسفل الحمض النووي الريبي المستخرج لتحليل المصفوفات الدقيقة. يوضح مخطط التبعثر هذا لمستويين من السجل اثنين من التكرار التشابه بين اثنين من النسخ المتماثلة.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة للبروتوبلاستات النباتية لتحليل نوع الخلية المحدد. هذه التقنية قابلة للتطبيق على العديد من الأنسجة والأنواع النباتية المختلفة. ستعطي العوائد الجيدة ذات المحتوى المنخفض من الحطام والبروتوبلاستات الصحية نتائج أفضل في المصب في النسخ بالإضافة إلى التحليلات الأخرى.

تذكر أيضا أنه من المهم الحفاظ على ظروف نمو المادة النباتية متطابقة للمقارنة بين العينات التي تم فرزها. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.