مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

تعتمد هذه العملية على نباتات تُعبر عن البروتين الفلوري الأخضر GFP في أنواع خلوية محددة، والتي يمكن بعد ذلك عزلها عن بقية خلايا النبات باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو تقنية facts. يستخدم هذا المثال خطين من العلامات التي يتم التعبير عنها في أنواع خلوية محددة من نبات Arabidopsis. تزرع بادرات جذور Aliana في صواني الزراعة أو على أطباق الآجار.

يتم حصاد جذورها ومعالجتها بإنزيمات هاضمة لجدار الخلية. وبعد مرور ساعة واحدة، يتم ترشيح المحلول لإزالة الحطام الكبير. ثم يُوضع المحلول في جهاز الطرد المركزي ويُزال الطافي.

يتم فصل البروتوبلاست الموجبة لـ GFP لاحقاً باستخدام تقنية FACS. ويمكن استخدام المواد التي تم فرزها لإجراء تحليلات خاصة بنوع الخلية، مثل توصيف الملفات النسخية على مستوى الجينوم كاملاً. مرحباً، أنا باسيان بارمان من مختبر كين بيرنباوم في قسم الأحياء بجامعة نيويورك.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لفرز الخلايا النباتية الأولية باستخدام تقنية الفرز الخلوي المنشط بالفلورة. في هذا المثال، سنقوم بفرز نوعين محددين من الخلايا في جذر نبات Arabidopsis. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ملفات النسخ الجيني الخاصة بأنواع معينة من الخلايا.

دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية بادرات من النوع البري بالإضافة إلى بادرات تتميز بتعبير محدد لنوع الخلية عن البروتين الفلوري الأخضر GFP. حيث يقوم محفز scarecrow الذي يوجه GFP بتمييز البشرة الداخلية للجذر والمركز الساكن في إحدى مجموعات البادرات.

وفي مجموعة أخرى، يتم تمييز مركز السكون في الجذر بواسطة محفز walks five الذي يقود GFP. وتُزرع الشتلات مائياً في صواني FIA فوق مرشح نايلون، مما يسمح للجذور بالنمو من خلاله إلى وسط النمو. وبدلاً من ذلك، يمكن زراعة النباتات فوق شبكة نايلون وفي أطباق أجار بتركيز 1% موضوعة بشكل رأسي.

بالإضافة إلى المساعدة في حصاد الجذور، تسمح المرشحات بنقل الشتلات بكميات كبيرة إلى صواني نباتية جديدة أو أطباق آغار حيث يمكن تزويدها بمحفز معين. وقد يتم ذلك لدراسة الاستجابات النسخية المحددة لنوع الخلية تجاه العناصر الغذائية أو الهرمونات أو علاجات الإجهاد. افحص تحت المجهر الفلوري للتحقق من أن الواسم الفلوري يتم التعبير عنه كما هو متوقع.

تأكد من أن نمط تعبير الواسم متسق في ظل ظروف المعالجة المطبقة، حيث يمكن أن يتغير نتيجة للمعالجة. انتقل بعد ذلك إلى حصاد وتحضير البروتوبلاستات. ابدأ بتحضير محلول البروتوبلاستات.

امزج cellulase بتركيز 1.25% وزن/حجم، وmaser zyme بتركيز 0.3% وزن/حجم، وD mannitol بتركيز 0.4 molar، وMES بتركيز 20 millimolar، وKCL بتركيز 20 millimolar في ماء منزوع المعادن، واضبط pH إلى 5.7 باستخدام tris HCL بتركيز one molar عند pH 7.5. سيكون هذا المحلول عكراً قليلاً. ثم سخن المحلول إلى 55 degrees Celsius لمدة 10 دقائق.

سيصبح المحلول رائقاً، اتركه ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة ثم أضف BSA بتركيز 0.1% وزن/حجم، وكلوريد الكالسيوم بتركيز 10 millimolar، وبيتا ميركابتويثانول بتركيز خمسة millimolar، وإيثانول. احصد شتلات بعمر أسبوع واحد من صينية زراعة واحدة. في حالة سلالة scarecrow GFP أو ثماني أطباق من شتلات 5G FP بعمر أربعة أيام. اكشط الجذور عن الشبكة النايلونية باستخدام مشرط، ثم ضعها في وعاء يحتوي على محلول البروتوبلاست.

استخدم ما يقرب من 10 milliliters من محلول البروتوبلاست لكل 1500 شتلة. رجّ الدوارق بلطف بسرعة 75 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قد يؤدي تمديد وقت الحضن إلى زيادة إنتاج البروتوبلاست، ولكنه سيزيد أيضاً من تأثير البروتوبلاست نفسها على التعبير الجيني.

بعد تحرير البروتوبلاستات، استخدم مصفاة خلايا بقطر 40 ميكرومتر لترشيح المحلول، ثم قم بتوزيع معلق البروتوبلاستات على أنابيب مخروطية سعة 15 مل. من المهم الحصول على معلق بروتوبلاستات نظيف وخالٍ من الشوائب قدر الإمكان لمنع انسداد الفوهات وتقليل الوقت اللازم لفرز الخلايا. قم بطرد الأنابيب مركزياً في جهاز طرد مركزي ذي دلاء متأرجحة بسرعة 500 G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لاحظ أن سرعة الطرد المركزي تعتمد على تكوين الجزء النباتي المستخدم لاستخلاص البروتوبلاست وكمية الحطام الخلوي الناتج أثناء المعالجة الإنزيمية. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة معظم السائل الطافي وأعد تعليق الراسب الذي يحتوي على البروتوبلاست برفق في الحجم الصغير المتبقي من محلول البروتوبلاست. وأخيراً، قم بعد البروتوبلاست باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) وتحديد كثافتها لحساب الإنتاجية وتحديد معايير التشغيل الفعلية.

بعد العد، قم بفحص البروتوبلاستات. تحقق من سلامتها، ومستوى تعبير GFP، ومحتوى الحطام الخلوي الملوث. بعد ذلك، انتقل إلى عملية الفرز الخلوي بالفلورة (fax).

في حال عدم الانتقال مباشرة إلى مرحلة الفرز، يمكن غسل البروتوبلاست وإعادة تعليقها وتخزينها في محلول حضانة، مثل محلول صب البروتوبلاست بدون إضافة الإنزيمات أو محلول W5. قم بتشغيل فارز الخلايا وجهاز الكمبيوتر الخاص بمحطة العمل.

نستخدم هنا جهاز fari من تصنيع شركة Becton Dixon and Company. استخدم XPBS واحدًا كسائل غلاف وقم بتشغيل إجراء بدء التشغيل الموائع. قم بتركيب فوهة بحجم 100 micrometer واضبط ضغط الغلاف على 20 PSI.

قم بإعداد تدفق مستقر ومعايرة تأخير القطرة. يرجى ملاحظة أن عملية المعايرة غير موضحة في هذا الإجراء. يمكن فرز معلقات البروتوبلاست بنجاح حتى بكثافة تصل إلى 10 million cells per mil.

لمنع تَرَسُّب البروتوبلاست، استخدم خيار تحريك العينة في أجهزة الفصل. وفي حال حدوث انسداد في أجهزة الفصل، هناك ثلاث خطوات محتملة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها؛ أولاً، قم بإجراء غسيل عكسي لخط العينة.

ثانياً، قم بتخفيف معلق البروتوبلاست لتقليل الكثافة. ثالثاً، قم بتنقية محلول البروتوبلاست عن طريق تكرار خطوة الترشيح بعد عملية الطرد المركزي وإعادة التعليق. تُستخدم أربعة معايير فقط لتمييز البروتوبلاست الإيجابية لـ GFP عن البروتوبلاست السلبية لـ GFP وبقايا الخلايا بعد الإثارة بواسطة ليزر بطول موجي 488 nanometer؛ حيث يُعد التشتت الأمامي (forward scatter) مؤشراً على حجم الجسيمات، والتشتت الجانبي (side scatter) مؤشراً على حبيبية الجسيمات.

الانبعاث عند 530 نانومتر كمقياس للفلورة الخضراء، والانبعاث عند 610 نانومتر كمقياس للفلورة الذاتية ذات الطيف الأحمر. ابدأ بإعداد مخطط نقطي للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي. طبق إعداد الجهد بحيث تكون الأحداث المقاسة متمركزة في المخطط.

يمكن تمييز البروتوبلاست (PROTOPLASTS) الإيجابية لـ GFP من خلال زيادة نسبة الانبعاث الأخضر إلى الأحمر مقارنة بالأحداث ذات الفلورة الذاتية. قم بإعداد مخطط نقطي (dot plot) يوضح الفلورة الخضراء مقابل الفلورة الذاتية للطيف الأحمر فقط. قم بتطبيق إعدادات الجهد بحيث تؤدي الأحداث المقاسة إلى ظهور مجموعة قطرية واحدة في المخطط.

عند فحص معلق من البروتوبلاستات من النوع البري، يجب أن تنتج البروتوبلاستات الموجبة لـ GFP مجموعة واضحة من أحداث الفلورة الخضراء التي لا تظهر أبداً في عينات النوع البري. قم بضبط قيود التعويض لمعالجة التداخل الطيفي بين الفلورة الخضراء والفلورة الذاتية للطيف الأحمر. باستخدام معلق من البروتوبلاستات الموجبة لـ GFP، ستسمح إعدادات قيود التعويض المناسبة بفصل أفضل للبروتوبلاستات الموجبة لـ GFP عن البروتوبلاستات غير الموجبة لـ GFP والحطام؛ ثم قم بضبط بوابة لتحديد الأحداث الموجبة لـ GFP.

يُنصح باصطحاب بروتوبلاستات غير GFP في كل مرة تقوم فيها بتحضير تجربة فرز للمساعدة في تحديد حدود البوابة. وأخيرًا، قم بضبط حد قطع لتشتت الضوء الأمامي لاستبعاد الحطام الصغير من التحليل. وسوف يساعد تصور الأحداث الموجبة لـ GFP في مخطط تشتت الضوء الأمامي مقابل تشتت الضوء الجانبي في تحديد المكان الذي يجب ضبط الحد عنده.

يمكن إعادة استخدام المعلمات التي تم ضبطها في تشغيل الحقائق الأولي هذا لعمليات الفرز المستقبلية. ستكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة للاستخدام اليومي للحقائق. لاستخلاص RNA، قم بتجهيز أنابيب جمع تحتوي على محلول استخلاص RNA، مع استخدام حجم فرز بحد أقصى 100 microliter إلى 350 microliter من محلول الاستخلاص كدليل.

تنتج 20, 000 عملية فرز حجماً إجمالياً للفرز يبلغ حوالي 100 microliters. الآن وبعد ضبط معاملات الـ fax وأوضاع التشغيل وتجهيز أنابيب الجمع، ابدأ في فرز البروتوبلاست عند اكتمال عملية الفرز. اخلط أنابيب جمع العينات لأن معلق الخلايا قد يتجمع في الأعلى، علماً أنه يمكن استخدام 500 حدث فرز فقط لتحليل المصفوفات الدقيقة بعد استخلاص RNA وتضخيم CD NA.

نستخدم هنا مجموعة الاستخلاص الدقيق RNEZ، ونظام تضخيم RNA WT ovation PICO، ووحدة fl ovation CD NA biotin V two. تظهر هنا نتائج FACS نموذجية لبروتوبلاستات مشتقة من شتلات non GFP Scarecrow، وGFP، وW 5G FP؛ حيث يتم عرض 100,000 حدث في كل مخطط نقطي، يمثل المحور السيني الفلورة الخضراء مقابل الفلورة الحمراء. أما على المحور الصادي، فقد تم تمييز الأحداث التي تقع ضمن بوابة فرز GFP باللون الأخضر.

هذا ملخص للعائد النموذجي للبروتوبلاست من الشتلات التي تعبر إما عن scarecrow GFP التي تميز البشرة الداخلية للجذر والمركز الساكن، أو walks 5G FP التي تميز المركز الساكن للجذر. يوجد عدد أقل من الخلايا في المركز الساكن للجذر مقارنة بالبشرة الداخلية للجذر. لذلك، وعلى الرغم من البدء بعدد أكبر من البروتوبلاست، فإن عائد الخلايا المعبرة عن GFP يكون أقل في فرز walks 5G FP مقارنة بفرز scarecrow GFP. تظهر هنا نتائج استخلاص RNA النموذجية لعينات مكررة ثلاث مرات.

تقابل كل عينة الـ RNA المستخلص من 10,000 حدث. يتم تحليل الـ RNA المستخلص بواسطة محلل حيوي (bioanalyzer) يظهر القمم الريبوزومية لعينات scarecrow GFP في الأعلى وعينات walks 5G FP في الأسفل، ويمكن استخدام الـ RNA المستخلص لاحقاً في تحليل المصفوفات الدقيقة (microarray analysis). يوضح مخطط التشتت هذا لمستويات التعبير اللوغاريتمية (log two) التشابه بين مكررين.

لقد استعرضنا للتو كيفية إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة لبروتوبلاستات النباتات لإجراء تحليل خاص بنوع الخلية. وتطبق هذه التقنية على العديد من الأنسجة والأنواع النباتية المختلفة. ومن شأن الحصول على عوائد جيدة مع محتوى منخفض من الحطام وبروتوبلاستات سليمة أن تؤدي إلى نتائج أفضل في التحليلات النسخية وغيرها من التحليلات اللاحقة.

تذكر أيضاً أنه من المهم الحفاظ على ظروف نمو المادة النباتية متماثلة لإجراء المقارنة بين العينات المفروزة. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.