الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لتصور تكرار الحمض النووي عن طريق الفحص المجهري البصري واسع المجال لامدا الخطي والمعدل كيميائيا. يتم إرفاق الحمض النووي بزلة غطاء زجاجي وظيفية. يتم تمييز الطرف الحر للحمض النووي بالخرزة ويتم شد الحمض النووي عن طريق التدفق الصفحي.

عند بدء النسخ المتماثل ، يبدأ الخيط الرئيسي في الإطالة ويقصر الخيط المتأخر بسبب اللف. يسمح الاختلاف الكبير في الطول بين الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والمفرد الذي تقطعت به السبل عند قوى منخفضة بمراقبة مباشرة لتحويلات الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل. تتم مراقبة طول بنية الحمض النووي من خلال تتبع موضع الخرزة ، مما يسمح بالتحديد الدقيق لمعدل وعملية تكرار الحمض النووي.

مرحبا ، أنا آري أولريش من مختبرات أنتو ون فانيان وتشارلز ريتشاردسون في قسم الكيمياء البيولوجية وعلم الأدوية الجزيئية في كلية الطب بجامعة هارفارد. سنعرض لك اليوم إجراء لتصوير تكرار الحمض النووي على المستوى الجزيئي الفردي. نستخدم هذا الإجراء في مختبراتنا لدراسة الأنشطة الأنزيمية التي تحدث أثناء تخليق الحمض النووي.

لذلك دعونا نبدأ في بداية هذا الإجراء. يتم تعديل عاثية البكتيريا الخطية Lambda DNA بواسطة قليل النوكليوتيدات الراكعة لتشكيل شوكة النسخ المتماثل ، وذراع شوكة لامدا التكميلية ، وذراع الشوكة البيوتينيل ، وبرايمر الشوكة. يحتوي ساعد الشوكة الحيوية على مادة بيوتين متصلة بنهايته الأولية الخمسة ، مما يسمح بربط قالب الحمض النووي بسطح خلية التدفق.

يتم تعديل الحمض النووي لامدا بشكل أكبر عن طريق التلدين ، وهو قليل النوكليوتيد آخر يحتوي على حفار وشق يعمل كعلامة مناعية عالية التقارب لربط الخرزة. لإنشاء شوكة النسخ المتماثل ، احصل على حمض نواخت لامدا بالإضافة إلى العديد من قليل النوكليوتيدات التي يمكن العثور على تسلسلاتها في البروتوكول المكتوب المصاحب لهذا الفيديو. تشتمل هذه قليل النوكليوتيدات على ذراع شوكة بيوتينيل ، وذراع شوكة تكميلية لامدا ، وبرايمر شوكة ، وحفرة لامدا التكميلية والفوسفوريات الطرفية الخمسة لذراع الشوكة التكميلية لامدا ونهاية الجينين التكميلية لامدا باستخدام T أربعة عديد النوكليوتيدات كيناز.

بعد ذلك ، امزج ذراع شوكة لامدا التكميلية الفسفرية ، وذراع الشوكة الحيوية ، والتمهيدي للشوكة ، والحمض النووي لامدا بنسبة المولية من 10 إلى 10 إلى 100 إلى واحد. في T four DNA Ligase المؤقت ، سخني الخليط عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وتبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق إيقاف تشغيل كتلة الحرارة للسماح بالتلدين المناسب لقليل النوكليوتيدات و T four DNA ligase إلى الخليط واحتضانه لمدة ساعتين. في درجة حرارة الغرفة ، سيحفز T four DNA Ligase ختم الشقوق بين قليل النوكليوتيدات واللامدا.

الحمض النووي أخيرا ، قم بإزالة الحفرات التكميلية لامدا ونهاية قالب تكرار الحمض النووي عن طريق إضافة حفار لامدا التكميلي الفسفوري وينتهي في T أربعة Ligase buffer يحتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 45 درجة مئوية ومرة أخرى ، تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق إيقاف تشغيل كتلة الحرارة ، وربط الأكسجين التكميلي Lambda الملحوم بالفسفرة وإنهاء قالب تكرار الحمض النووي عن طريق إضافة T أربعة DNA ligase إلى الخليط و احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. قالب النسخ المتماثل النهائي للحمض النووي جاهز الآن للاستخدام. من أجل إرفاق الخرز المغناطيسي المنشط بشرابة بقالب تكرار الحمض النووي ، يجب تشغيلها باستخدام جزء FAB خاص ب digo genin.

لبدء هذه العملية ، قم بتعليق محلول مخزون الخرز ونقل 400 ميكرولتر إلى أنبوب einor. ضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي واحتضنه حتى يزول المحلول. ثم قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة لتنشيط مجموعات التوال لاقتران الأجسام المضادة ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للجسم واخلطه برفق عن طريق سحب العينات.

مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية بمساعدة فاصل مغناطيسي. بعد ذلك ، أضف 240 ميكرولتر من جزء FAB وأعد تعليق الخرزات في 400 ميكرولتر من عازلة البورات. تخلط جيدا وتترك الحضانة على دوار لمدة 16 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، افصل الخرزات باستخدام الفاصل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرزات بملليلتر واحد من عازلة الغسيل واحتضانها لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام الفاصل المغناطيسي. يتكرر هذا الغسيل مرتين.

لمنع مجموعات tosil الحرة ، أضف ملليلترا واحدا من BSA الذي يحتوي على عازلة تريس واحتضنه لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الخرزات باستخدام فاصل مغناطيسي يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت والتخزين. للاستخدام ، يتم إرفاق الحمض النووي المراد تكراره بزلات الغطاء الزجاجي التي تعمل مع Amil lane.

ترتبط مجموعة الأوكسجين في ممر أميل بالزجاج تاركة أمينا متاحا للارتباط بجزيئات الوتد الحيوية. يساعد هذا الطلاء على تقليل الارتباط غير المحدد بالسطح. لتنظيف زلات الغطاء الزجاجي تماما ، ضعها في برطمانات تلطيخ واملأ البرطمانات بسونيكات الإيثانول.

لمدة 30 دقيقة ، اشطف البرطمانات واملأها بصوت هيدروكسيد البوتاسيوم المولار لمدة 30 دقيقة وكرر كلا الغسيلتين. بالنسبة لتفاعل الوظيفية الأول ، يجب إزالة جميع آثار الماء. املأ برطمانات التلوين بالأسيتون والسونيكات لمدة 10 دقائق.

أفرغي البرطمانات واملأها مرة أخرى بالأسيتون. استمر في إضافة الكاشف الجيبي إلى البرطمانات وحركها لمدة دقيقتين. ثم قم بإخمادها بكمية كبيرة من الماء.

ثم جفف زلات الغطاء عن طريق خبزها على حرارة 110 درجة مئوية في الفرن لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط الوتد بحوالي 0.2٪ وزن لكل حجم. سيسمح الوتد الحيوي ، بما في ذلك فاصل انزلاق الغطاء الزجاجي ، بفصل زلات الغطاء ، ماصة 100 ميكرولتر على زلة غطاء جافة منعزلة.

ضع زلة غطاء ثانية في الأعلى. احتضان زلات الغطاء في محلول PEG لمدة ثلاث ساعات. ثم افصل كل زوج من زلات الغطاء واغسلها على نطاق واسع بالماء.

احرص على إبقاء زلات الغطاء تعمل لأعلى حيث سيتم طلاء جانب واحد فقط بالوتد. أخيرا ، جفف زلات الغطاء بالهواء المضغوط وقم بتخزينها تحت الفراغ في الجفاف ، تظل الأسطح مستقرة لمدة شهر على الأقل. لذلك يمكن عمل العشرات من قسائم الغطاء دفعة واحدة واستخدامها حسب الحاجة.

الآن بعد أن أصبحت زلات الغطاء جاهزة ، يمكن للمرء تجميع غرفة التدفق لتجربة الجزيء الفردي. يتم إجراء تجربة الجزيء الفردي باستخدام غرفة تدفق بسيطة مبنية مع زلة غطاء وظيفية وشريط على الوجهين وشريحة ربع جالون وأنبوب. يتم إعداد غرفة تدفق واحدة لكل تجربة جزيء فردي.

ابدأ بخلط خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت المانع و 20 مل من المخزن المؤقت العامل ووضع الخليط في مجفف لإزالة أي فقاعات هواء للخطوات اللاحقة. بعد ذلك ، انشر 100 ميكرولتر من محلول عمل strp din في PBS على سطح احتضان انزلاق الغطاء الوظيفي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح ل strp din بربط البيوتين السطحي. في هذه الأثناء ، قم بقص قطعة من الشريط على الوجهين لتتناسب مع حجم شريحة الكوارتز ، وحدد موضع فتحات الأنابيب على الشريط.

حدد غرفة التدفق عن طريق رسم قناة مركزية بعرض ثلاثة ملليمترات ومستطيلات تحتوي على كلا الفتحتين. يمكن تصميم غرف التدفق بقناتين على شكل مدخل ومخرج على شكل حرف Y. الآن قم بقص الشريط المميز على طول المخطط المرسوم ، وقم بعمل قطع نظيفة مستقيمة للتأكد من عدم بروز مادة لاصقة في القناة.

قم بتنظيف شريحة الكوارتز جيدا باستخدام الأسيتون لإزالة المادة اللاصقة من بنية خلايا التدفق المستخدمة في التجارب السابقة. ابحث عن أفضل محاذاة لمخطط القناة. قم بإزالة جانب واحد من الدعامة اللاصقة وضع الشريط بعناية على شريحة الملعب.

احرص على محاذاة الشريط بشكل صحيح حيث يجب أن تظل فتحات المدخل والمخرج غير مسدودة. بعد ذلك ، قم بإعداد أطوال قطع الأنابيب بقطر داخلي 0.76 ملم لمدخل ومخرج خلية التدفق. قم بقص نهاية الأنبوب بزاوية 30 درجة تقريبا حتى لا يضغط الأنبوب بشكل مسطح على قاع الغرفة.

قم بتعليق الأنبوب على رفوف أنبوب الاختبار لسهولة التثبيت بخلية التدفق في الخطوات التالية. الآن ، يجب الانتهاء من حضانة زلة الغطاء. اشطف الغطاء وانزلقه جيدا بالماء وجففه باستخدام الهواء المضغوط.

احرص على عدم قلب انزلاق الغطاء حيث يعمل جانب واحد فقط باستخدام الوتد. أكمل تجميع غرفة التدفق عن طريق إزالة الجانب الآخر من دعامة الشريط ووضع شريحة الكوارتز على زلة الغطاء اضغط برفق على زلة الغطاء لدفع أي هواء محاصر في المادة اللاصقة. سيساعد ذلك في منع دخول أي فقاعات هواء إلى قناة التدفق.

ختم جوانب الغرفة بالإيبوكسي. أدخل الأنبوب المقطوع في فتحات الكوارتز وأغلقه في مكانه بالإيبوكسي. اتركه يجف لبضع دقائق.

بمجرد أن يجف ، استخدم إبرة قياس 21 لسحب بعض DGAs التي تسد المخزن المؤقت من خلال أحد الأنابيب من أجل سد سطح الغرفة. اشطفها عدة مرات لإزالة فقاعات الهواء والسماح للغرفة بالتحضين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الانتقال إلى تجربة تكرار الجزيء الفردي. بمجرد أن يتم إعداد الخرز الوظيفي لقالب الحمض النووي وغرفة التدفق ، يمكن إجراء تجربة جزيء واحد.

للبدء ، ضع خلية التدفق على مرحلة المجهر. أمسك الغرفة في مكانها باستخدام مشابك المسرح وتأكد من وضع قناة التدفق في محاذاة مع كاميرا CCD. قم بتوصيل الهواء الذي تم إنشاؤه مسبقا إلى مضخة الحقنة وأنابيب مخرج خلية التدفق.

باستخدام أنبوب موصل بقطر أكبر ، ضع أنابيب مدخل خلية التدفق في عازلة مانعة واسحب المحقنة للخلف لإزالة أي فقاعات هواء من الأنابيب ، وقم بنقر أنابيب المخرج برفق لمسح أي فقاعات هواء محاصرة في خلية التدفق. بمجرد إزالة جميع فقاعات الهواء ، قم بتوصيل أحد أنابيب المدخل بإبرة وأغلق أحد أنابيب المخرج عن طريق ثنيه 180 درجة وتثبيته بشريط لاصق قبل إضافة الحمض النووي إلى الخلية ، قم بتخفيف قالب الحمض النووي للمخزون إلى 10 بيكومولار في مليلتر واحد من DGAs واحد × مانع المخزن المؤقت. قم بتدفق القالب إلى الغرفة بمعدل تدفق معتدل للسماح بتغطية سطحية جيدة للحمض النووي.

خفف محلول حبة المرق إلى ما بين اثنين وأربعة أضعاف 10 من الخرزات السادسة لكل مليلتر. في مليلتر واحد من DGAs ، مخزن مؤقت واحد × حظر. ثم دوامة الخليط وصوتنة لمدة 20 ثانية.

تدفق محلول الخرزة المخفف إلى الغرفة. بمجرد إضافة الخرزات ، قم بإيقاف تشغيل التدفق والسماح للغرفة بالوصول إلى التوازن. ثم أغلق كلا أنبوبي المخرج.

أي تغييرات في الأنابيب دون إغلاق الغرفة ستؤدي إلى تقلبات في الضغط من شأنها أن تمارس قوة قوية على الخرز وتقص جزيئات الحمض النووي المربوطة. قم بتوصيل أنبوب المدخل الذي تم استخدامه لتحميل الخرزات بإبرة باستخدام أنبوب المدخل الثاني. ابدأ في غسل خلية التدفق باستخدام DGAs ، حل واحد x لمنع الغسيل العازل على نطاق واسع.

قم بتحريك المسرح عن طريق النقر لإزالة أي خرز غير عالق على السطح للتحقق منه. الخرزات مرتبطة بالحمض النووي. حاول تغيير اتجاه التدفق.

بمجرد إزالة الخرزات الحرة بشكل كاف ، قم بإيقاف تشغيل التدفق والسماح للغرفة بالوصول إلى التوازن. تحضير خليط تفاعل طازج يحتوي على بروتينات النسخ المتماثل كما هو موضح في بروتوكول النص. أغلق أنبوب المخرج المفتوح وقم بتبديل خزان المدخل إلى خليط التفاعل المحضر حديثا.

فتح المخرج ببطء لتجنب تغيرات الضغط السريعة للمضي قدما في التفاعل الأنزيمي. أولا ، قم بتدفق محلول البروتين إلى الغرفة بمعدل تدفق معتدل للسماح بالارتباط الفعال بالحمض النووي. قم بإيقاف تشغيل التدفق والسماح للغرفة بالوصول إلى التوازن.

أغلق أنابيب المخرج واستبدل الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل. باستخدام الأنبوب الذي يتكون من مخزن غسيل DGAs ، اغسل الغرفة لإزالة البروتينات الحرة بعد الغسيل. مرة أخرى ، قم بإيقاف تشغيل التدفق واسمح للغرفة بالوصول إلى التوازن.

أغلق أنابيب المخرج واستبدل الأنبوب الذي يحتوي على عازلة الغسيل. مع الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت للنسخ المتماثل T سبعة ، يحتوي المخزن المؤقت للنسخ المتماثل T سبعة على كلوريد المغنيسيوم الذي يؤدي إلى بدء تفاعل النسخ المتماثل. استخدم معدل تدفق يبلغ 0.012 مل في الدقيقة يتوافق مع ثلاثة قوة سحب بيكو نيوين على حبال الحمض النووي باستخدام الشروط الموضحة في هذا البروتوكول.

ضع مغناطيسا دائما أرضيا نادرا فوق خلية التدفق قبل التصوير لمنع التفاعلات غير المحددة بين الخرزات والسطح. ضع مصباح ألياف بزاوية سقوط تتراوح بين 10 درجات وبالتوازي مع مرحلة المجهر بالقرب من مجال رؤية المجهر باستخدام هدف 10 × وكاميرا CCD. تستخدم إضاءة المجال المظلم لزيادة التباين في تركيز تصوير الخرزة باستخدام حبة مربوطة.

ابدأ الحصول على البيانات لمدة 20 إلى 30 دقيقة بمعدل إطارات بطيء. في تجربة ناجحة ، يمكن ملاحظة 100 حبة في وقت واحد. يجب أن تسفر التجربة عن العديد من الآثار التي تعرض تخليق الحمض النووي للخيوط الرائدة.

من أجل قياس معدلات وعملية فك الحمض النووي والبلمرة ، يجب تحديد المواضع الدقيقة للخرز لتحقيق ذلك. تناسب هذه المواضع مع وظائف غاوسية ثنائية الأبعاد. تصور المسار من خلال تتبع موضع الخرزة في كل إطار باستخدام برنامج التتبع.

ثم ارسم موضع الخرزة كدالة للوقت باستخدام أي برنامج رسومي للحصول على بيانات المعدل. قم بتركيب المخططات ذات الانحدار الخطي واحسب المنحدر للعملية. حدد الطول الإجمالي للحمض النووي من بداية حدث التقصير إلى نهايته.

اجمع بين جميع القياسات الفردية ومعدل الرسم وتوزيعات الإنتاجية تناسب البيانات باستخدام الدوال الأسية الغوسية والمفردة على التوالي. لقد أوضحنا لك للتو كيفية قياس معدلات تكرار الحمض النووي وعملية تكراره على مستوى جزيء واحد. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن القوة وبعض الرهانات الناتجة عن تدفق الصفيحة لا تؤثر على الأنشطة الأنزيمية لبروتينات النسخ المتماثل.

هذا كل شيء. شكرا لمشاهدتك واستمتع بتجاربك.