Name: الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: تعلم مراقبة تضاعف الحمض النووي في الوقت الفعلي باستخدام المجهر الضوئي الواسع المجال وحمض لامدا. تتيح هذه الطريقة تحديد معدل وعملية التضاعف بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد ساعد تطور الحمض النووي التي تمتد مقايسة بلايني بول جونغ بونغ لي ، وسمير حمدان. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح لتشارلز ريتشاردسون (GM54397) ، وأنطوان فان Oijen (GM077248).

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

من المهم التأكد من أن قوة السحب التي تمارس على تدفق الصفحي الخرز التي لا تؤثر على الأنشطة الأنزيمية للبروتينات تكرارها. على سبيل المثال ، قوة PN 3 الذي يتوافق مع معدل تدفق 0.012 مل / دقيقة لا تؤثر على تكرار حبلا الحمض النووي الرائدة. ومع ذلك فإنه لا يؤثر على الأنشطة الأنزيمية التي تحدث أثناء تركيب الحمض النووي منسقة ، وبالتالي له أن ينخفض ​​إلى 1.5 PN. يمكن أن تكون قوة السحب السيطرة عليها بسهولة من خلال تغيير معدل التدفق أو عرض القناة تدفق 5. <p class="jove_content"...

<table><tbody><tr><td>الحمض النووي DNA لـ Bacteriophage &amp;#955;</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>قليل النيوكليوتيد DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-digoxigenin Fab</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>خرزات منشطة بالتوسيل Tosyl Activated Beads</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>فاصل مغناطيسي Magnetic Separator</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>يمكن استخدام أمينوسيلانات أخرى أو خلطها مع سيلانات غير تفاعلية مع الأمين للحصول على أسطح أكثر تباعداً</td></tr><tr><td>Succinimidyl propionate PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>يمكن شراء أنواع مماثلة من PEG من Nanocs أو CreativePEGWorks أو غيرهما</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>يمكن شراء أنواع مماثلة من PEG من Nanocs أو CreativePEGWorks أو غيرهما</td></tr><tr><td>شريط لاصق مزدوج الوجه</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>سُمك 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>شريحة كوارتز</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td><td>الحجم بحيث يناسب شرائح التغطية. تُثقب الفتحات باستخدام ريش ثقب ماسية (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>أنابيب بولي إيثيلين</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>القطر الداخلي 0.76 mm، القطر الخارجي 1.22 OD&lt;br/&gt;يمكن استبدالها بأنابيب ذات أحجام أخرى.</td></tr><tr><td>ستريبتاديفين Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>تحضير محلول بتركيز 1 mg/mL، في حصص مقدارها 25 &amp;#x03BC;L في محلول PBS بـ pH 7.3</td></tr><tr><td>مزيج محلول ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>مجهر بصري مقلوب مع عدسة شيئية 10X</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>مغناطيس دائم من الأتربة النادرة</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>مضخة حقنة Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>تُشغل في وضع إعادة التعبئة لتسهيل تغيير المحاليل</td></tr><tr><td>مضيء ليفي Fiber Illuminator</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها. تم تعديل خطي λ الحمض النووي لديهم البيوتين على نهاية واحدة حبلا ، وشاردة digoxigenin على الطرف الآخر من نفس حبلا. ويرد في نهاية biotinylated إلى ساترة الزجاج functionalized ونهاية digoxigeninated إلى حبة صغيرة. تجميع هذه الحبال حبة الحمض النووي على سطح خلية تدفق يسمح ليتم تطبيقها على تدفق الصفحي لممارسة القوة اسحب على حبة. نتيجة لذلك ، ويمتد على مقربة من الحمض النووي وموازية لسطح ساترة في القوة التي يحددها معدل التدفق (الشكل 1). ويتم قياس طول الحمض النووي عن طريق رصد موقف حبة. وتستخدم طول الخلافات بين الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ، ومضاعفة للحصول على معلومات في الوقت الحقيقي على النشاط المتماثل من البروتينات عند مفترق الطرق. قياس موقف يسمح حبة التحديد الدقيق لمعدلات وprocessivities من الحمض النووي الفك والبلمرة (الشكل 2).

نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها.

نصف طريقة لمراقبة تضاعف جزيئات DNA الفردية في الوقت الفعلي، بتوسط بروتينات نظام التضاعف في العاثية (البكتيروفاج)....

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

DT40 ، وهو نظام الفقاريات نموذج الجيني ، ويوفر أداة قوية لتحليل وظيفة البروتين. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تسمح التحليل النوعي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة - S DT40 في الخلايا على مستوى جزيء واحد.

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

تقدم هذه الدراسة إجراء التجارب مفصلة لقياس ديناميكية حلقات من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام جزيء واحد نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). يصف البروتوكول أيضا كيفية استخراج كثافة الاحتمال حلقات يسمى عامل J.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

ويبين هذا البروتوكول مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها (1-د) أحادي الأبعاد للجزيئات على طول الحمض النووي.

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

ويصف هذا البروتوكول وصف توليف دنا بوليميريز الحمض النووي تم التعديل من خلال مراقبة التغيرات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي القريبة من الأشعة تحت الحمراء باستخدام هلام التفريد وتصوير جل. المواد الهلامية الاكريلاميد تستخدم لتصوير عالية الدقة لفصل الأحماض النووية القصيرة، التي تهاجر بمعدلات مختلفة اعتماداً على حجم.

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

ويرد وصف لطريقة متوازية للغاية لقياس الانقسام الموقع محددة من الحمض النووي في مستوى جزيء واحد. يوضح هذا البروتوكول الأسلوب باستخدام NdeI قيد endonuclease. يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة لدراسة أي عملية تؤدي إلى شق الحمض النووي في الموقع.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

باستخدام الحمض النووي المسمى بالنقاط الكمومية والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي ، يمكننا التحقيق في آلية تفاعل نوكلياز التقييد أثناء استخدام البروتين غير المسمى. تسمح تقنية الجزيء الواحد هذه بمراقبة متعددة الإرسال على نطاق واسع لتفاعلات البروتين والحمض النووي الفردية ، ويمكن تجميع البيانات لتوليد توزيعات وقت مكوث مكتظة بالسكان.

تحليل وقت السكون أحادي الجزيء لانقسام الحمض النووي بوساطة نوكلياز التقييد

تساعد المنهجية في تحليل التباين في ديناميكيات تكرار الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية. يمكن اعتماد منهجيات مختلفة بناء على مستوى السمية الخلوية للمادة ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف لتحليل الصورة للمساعدة في تحليل ألياف الحمض النووي.

عرض توضيحي لمقايسة ألياف الحمض النووي للتحقيق في تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح التي تسببها الجسيمات النانوية

تم تطوير إثراء وتسلسل الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين (eSPAN) للكشف عن الوفرة النسبية لبروتين مرتبط بالكروماتين على سلسلتين من الحمض النووي المتكاثرين، مما يكشف عن رؤية جزيئية لتكرار الكروماتين وعملياته المترابطة. يصف هذا البروتوكول إجراءات eSPAN في خلايا الجذع الجنينية للخميرة والفئران.

تحليل خاص بالخيوط للبروتينات عند تكرار سلاسل الحمض النووي من خلال إثراء وتسلسل طريقة الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين

يوضح هذا البروتوكول إجراء اختبار أحادي الجزيء للتصور المباشر لفك الحمض النووي بواسطة CMG helicase. يصف (1) تحضير ركيزة الحمض النووي ، (2) تنقية ذبابة الفاكهة السوداء CMG helicase المسمى بالفلورسنت ، (3) إعداد خلية تدفق الموائع الدقيقة للفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) ، و (4) مقايسة فك الحمض النووي أحادي الجزيء.

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

يحدد هذا البروتوكول مقايسة تكرار الحمض النووي أحادي الجزيء القائم على الفحص المجهري الفلوري ، مما يتيح التصور في الوقت الفعلي للتفاعلات بين بوليميرات الحمض النووي والعقبات مثل هياكل G-quadruplex.

تصور مضان أحادي الجزيء لديناميكيات بوليميراز الحمض النووي في G-Quadruplexes

تعلم مراقبة تضاعف الحمض النووي في الوقت الفعلي باستخدام المجهر الضوئي الواسع المجال وحمض لامدا. تتيح هذه الطريقة تحديد معدل وعملية التضاعف بدقة عالية.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

استكشف المزيد من الفيديوهات