التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

يصف هذا الفيديو الإجراء المستخدم للحث على تكاثر السموم في بعض الأنواع في هذه الحالة وبروتوكول استخراج البروتين الكامل المستخدم في الدراسات البروتينية في مختبرنا. طول الإجراء ، 16 يوما ، أربعة أيام لنمو الفطريات ، 10 أيام لتكاثر السموم ، ويومين لاستخراج البروتين. بعد أربعة أيام ، لا تزال المستعمرات تنمو بنشاط باتجاه حافة اللوحة.

يتم تشكيل الفطريات الهوائية النموذجية ويتم جمعها باستخدام شفرة ستيرويد أسفل صندوق تدفق الصفيحة عن طريق خدش سطح الصفيحة برفق. يتم تقطيع الفطريات إلى خمس قطع صغيرة وتضاف إلى قارورة مبكرة تحتوي على 25 مل من الوسائط المحفزة للسموم. تحريض السموم أكثر كفاءة من الغبار الداكن.

القارورة مغطاة بالألمنيوم. ثم تهتز الثقافات لمدة 10 أيام ، 150 طلقة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية. الوسيط من SAPH ويحتوي على محلول صف S عالي التركيز.

المعروف أن السرير مع الظلام يسهل تكاثر السموم في ريا. ثم يتم فصل الفطريات عن السم المحتوي على السائل عن طريق الترشيح على الأنسجة القريبة من MI. يمكن استخدام السائل لقياس محتوى السم بينما يتم استخدام الفطريات لاستخراج البروتين.

لتجنب ترحيل الوسائط ، يتم غسل السقف ثلاث مرات بالماء المعقم. يجب التخلص من الماء الزائد بعد ذلك ، مثل إضافة النيتروجين السائل ، ويمكن تخزين العينات عند 80 تحت الصفر أو استخدامها لاستخراج البروتين. يعتمد إجراء استخراج البروتين على استخدام SDS و TCA ويتكون من خطوات تحلل مختلفة.

سيقترح طريقة تضم العديد من المشغلين لتنفيذها. في نفس الوقت ، يقوم استخراج التكرارات البيولوجية ، يقوم مشغل مختلف بتنفيذ كل تكرار. يأخذ هذا الإجراء في الاعتبار الاختلافات في إجراء الاستخراج التي يمكن إنشاؤها بواسطة مشغلين مختلفين يقومون بمعالجة النسخ المتماثلة.

لذلك يجب أن يظهر متانة أعلى عند مقارنة التكرارات البيولوجية حيث يتم تضمين متغير المشغل في التكرار. في الوقت نفسه ، يقلل استخدام مشغلين متعددين من وقت المعالجة. يتم طحن العينة في ملاط معقم باستخدام النيتروجين السائل حتى تصبح الفطريات مسحوقا ناعما.

هذه الخطوة حاسمة لجودة وكمية البروتينات. يتم جمع الفطريات في أنابيب تفلون 10 ملي بنسبة أربعة أعشار الحجم الكلي للأنابيب. ثم يتم إضافة المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على SDS ومثبطات مختلفة للبروتياز.

ثم تهتز الأنابيب حتى يتم الحصول على محلول متجانس. ثم يتم اهتزاز العينات لمدة 30 دقيقة في غرفة الكود ليتم غليها بشكل أكبر ، ويتم غلي العينات من أجل إذابة جدران الخلايا والبروتينات الكارهة للماء. يمنع وجود SDS تكوين القلة التي تجهض ترسيب البروتينات.

تفصل خطوة الطرد المركزي بين ثلاث مراحل. يتم تعليق البروتينات في المحلول الشفاف الذي يتم جمعه في أنبوب جديد محفوظ على الجليد. ثم يتم استخدام اللوحة لأداء خطوة ثانية ، وتكرار الدوامة والغليان والطرد المركزي.

يتم الجمع بين snat من التحلل من أجل أداء هطول الأمطار مع هطول الأمطار الجليدية ، والمخزن المؤقت الذي يحتوي على نغمة حمضية ، وحمض ثلاثي حمضي ، و DTT. ثم يتم تخزين العينات طوال الليل لمدة 16 ساعة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للسماح بالبروتين. توجد بروتينات الترسيب في قاع الأنابيب لتحسين هطول الأمطار.

الأنابيب هي أجهزة طرد مركزي بسرعة عالية لمدة 45 دقيقة. الحنك مرئي الآن جيدا. يمكن التخلص من المواد الطافية باستخدام وسادة أنابيب سعة خمسة ملليلتر.

ثم تتم إزالة TCA عن طريق إضافة 25 مليلتر من محلول الغسيل الجليدي الذي يحتوي على الأسيتون و DTT. ثم يتم اهتزازها بدقة وبقوة. ثم يتم تنفيذ خطوة طرد مركزي جديدة.

يطفو الحنك البروتيني الآن ، لذلك يجب دفع توتر للقضاء على الضربة. يتم تنفيذ خطوة الغسيل الثانية ، مع إضافة الغسيل والمخزن المؤقت والاهتزاز والطرد المركزي. يتم التخلص من عامل SUP وتجفيف العينة باستخدام كيس السرعة.

عندما تكون العينة جافة ، يكون البروتين من الاتساق مثل المسحوق. للتخزين. يجب جمع عينة البروتين من الأنبوب لتقليل التداخل الكهروستاتيكي للبلاستيك.

يتم استخدام مسدس إلكتروستاتيكي ويتم جمع مسحوق البروتين باستخدام ملعقة معدنية. ثم يتم تعليق البروتينات مباشرة في المخزن المؤقت لوضع العلامات. تستخدم لمدة 2D dash 30 دقيقة بمعدل 800 جرام في الدقيقة.

يكفي للذوبان. البروتين قبل الشروع في وضع العلامات على اندفاعة ثنائية الأبعاد باهظة الثمن. يتم اختبار جودة البروتين على صفحة SDS جل أحادي البعد كما يتضح.

يشير عدم وجود مسحات كبيرة على حافة الممر إلى جودة جيدة للعينة.