Name: بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: تعلم إنتاج Tetramer KLRG1 لتحليل التفاعلات المناعية باستخدام البكتيريا والتعبير عن البروتين. يوفر هذا البروتوكول إطاراً موثوقاً لدراسة KLRG1 في البحوث المناعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتور Naidenko للمساعدة في تحسين ظروف refolding. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة AI58181 منح البحوث لوران Brossay. سيندي تيا بانه معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA AI080230 F31. ستيفاني Terrizzi تيا بانه وسيندي أيضا أن تساهم في هذا العمل.

إعداد الأجهزة إدراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 4 × 500 مل من السل قوارير تحتوي كل منها على 50 ميكروغرام / مل من كربنيسيلين والكلورامفينيكول مع الثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا معربا عن بناء KLRG1 البلازميد. عندما تصل إلى 0.6 Å OD في 600 نانومتر ، وتحدث مع إضافة IPTG M 0.4 و احتضان الثقافة للحصول على 4 ساعات اضافية تهتز عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حصاد الخلايا في درجة الحموضة عازلة إعادة تعليق = 8.0 (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 25 ٪ (W / V) السكروز ، 1 ملم EDTA ، 10 ملي DTT). ملاحظة : يمكن تجميد الكريات في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع ما لا يزيد عن 60 مل من resuspensions الجرثومي في دورق البولي بروبلين. إذا كان ذلك ضروريا لضبط 60 مل مع الشركة المصرية للاتصالات 8.0 درجة الحموضة عازلة ويحرك الخليط بنصف السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى إثارة مزيج قطرة الحكمة : الليزوزيم (النهائي = 1 ملغ / مل) ، MgCl2 (النهائي = 5 ملم) ، 2 ملغ الدناز كنت في الجلسرين 50 ٪ الواردة 75 مم كلوريد الصوديوم ، تريتون - X100 (النهائي = 1 ٪) ، DTT ( النهائي = 10 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الحل على الثلج لمدة 1.5 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في 5000 دورة في الدقيقة في lysates لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب وطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من الحموضة عازلة غسل = 8.0 (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 0.5 ٪ تريتون X - 100 ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 1 ملم DTT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الجليد ، ويصوتن حل ل1.5 دقيقة حتى يتم معلق تماما بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينات في جهاز الطرد المركزي 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 5 مرات الغسيل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5B مع تكرار غسل العازلة دون الطرد المركزي تريتون ، X - 100 وresuspend في 4 مل من مخزن الشركة المصرية للاتصالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ الوزن الرطب إدراج الهيئات الطين وتخزينها في المخزن TE بتركيز من 30 إلى 100 ملغ / مل. </li></ol> Refolding من KLRG1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 1 لتر من الحموضة refolding العازلة = 8.0 (0.4 - M ارجينين حمض الهيدروكلوريك و 0.1 درجة الحموضة 8-8،3 M تريس ، EDTA 2 ملم ، 0.2 ملم PMSF ، 3 EDTA خالية اقراص مثبطات الأنزيم البروتيني ، 5 و 0.5 ملي GSH GSSG ملم) والبرد إلى 4 درجات مئوية مع التحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الهيئات إدراج للحقن في الخليط للطي : وهي مثالية لجعل 5 10 الحقن مع كل تركيز 0.25 ميكرومتر 0.5 بحيث تركز النهائي من البروتين سوف يكون 2 3 ميكرومتر. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب حجم 50 ملغ من الطين الهيئات إدراجها في GnHCl M 7 مع 10 ملي β - المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على إدراج الهيئات / خليط GnHCl عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق لضمان انصهار كامل (الطين سيتضح عندما ذابت تماما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى لمدة 30 دقيقة في microcentrifuge عند 4 درجة مئوية ، وطاف لنقل أنبوب الطرد المركزي 15 مل. لا لنقل أي من بيليه ومسود الصغيرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حجم المخزن المؤقت مع حقن (3 M GnHCl ، 10 NaAcetate ملي ، ودرجة الحموضة 4.2،10 ملي EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 1 مل من الهيئات إدراج المخفف كل ساعة. عندما بالحقن ، ويحرك بسرعة عالية ، إضافة 1 مل من المخفف إدراج الهيئات قطرة قطرة مع 2 ثانية بين كل قطرة. عندما يتم حقن ويحرك بسرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستمر التحريك بين عشية وضحاها على سرعة منخفضة في 4 درجات مئوية. </li></ol> تركيز ردود الفعل Refolding <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بروتوكول ميليبور ق ، والتركيز على رد الفعل L 1 (0.22 ميكرون تصفية) قبل تصفيتها refolding باستخدام خلية وحرك Amicon YM10 الفائق 10K NMWL غشاء (ميليبور) إلى 10 مل ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على 2 مل ≤ باستخدام Centriplus YM - 10 10K MWCO (ميليبور). </li></ol> تنقية tetramer KLRG1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد AKTAFPLC في 4 درجات مئوية وفقا للأدلة الرعاية الصحية GE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية شكل من مونومر KLRG1 بواسطة اللوني استبعاد حجم باستخدام Sephacryl S - 200 16/60 عالية الدقة العمود (جنرال الكتريك للرعاية الصحية) في HEPES ملي 20 و 150 مم كلوريد الصوديوم. (أنظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز إلى 1 مل باستخدام Centriplus YM - 10 10K MWCO (ميليبور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام انزيم البيرا وفقا لبروتوكول الطمع s لbiotinylate المونمر KLRG1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التخلص من البيوتين مجانا من حجم الاستبعاد اللوني كما في 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو tetramerized KLRG1 جزيء عن طريق خلط KLRG1 مونومر مع 4 أضعاف المولي streptavidin PE الزائدة مترافق دينار بحريني (العلوم البيولوجية). </li></ol> ممثل النتائج <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"></a> refolded الشكل 1. نتائج إيجابية من الممثل اللوني FPLC AKTA استبعاد حجم KLRG1. ويبين الرسم البياني انفصال الأحادي (83.52 مل) ، ديمر (56.36 مل) ، وmultimer (36.26 مل) شكل KLRG1 refolded. في ذروة 94.25 مل يمثل تبادل العازلة.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

في هذا البروتوكول ، فإنه يظهر كيفية تنقية ، biotinylate وKLRG1 tetramerize. يمكن أن تستخدم لتسمية KLRG1 tetramer KLRG1 يغاندس بواسطة التدفق الخلوي. على الرغم من الظروف refolding سيتعين اختبارها تجريبيا لكل من البروتين ، يمكن tetramerized غيرها من نوع C - lectins باستخدام بروتوكول مماثل. ويمكن استخدام البروتينات tetramerized وتحقيقات ، يغاندس لمستقبلات اليتيم lectin نوع C - يحتمل أن يتم التعرف عليها.

<table><tbody><tr><td>إنزيم BirA ومحلول منظم</td><td>طقم البيوتينيل</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>أقراص مثبط البروتياز المصغر الكاملة، خالية من EDTA</td><td>كاشف</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>خلية Amicon ذات التحريك</td><td>معدة</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>أو ما يعادلها</td></tr><tr><td>غشاء الترشيح الفائق YM10 NMWL 10K</td><td>مستلزمات الترشيح</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>مركز YM10 سعة 15 ml</td><td>مستلزمات الترشيح</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>معدة</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>عمود Sephacryl S-200 16/60 عالي الدقة</td><td>معدة</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidin PE</td><td>كاشف</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>أو ما يعادلها</td></tr></tbody></table>

بروتوكول لإنتاج tetramer klrg1

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

قاتل مستقبلات الخلية G1 lectin مثل (KLRG1) هي عبر الغشاء مستقبلات بروتين سكري من النوع الثاني المثبطة ينتمون إلى الفصيلة C lectin تشبه النوع. KLRG1 موجود بوصفه على حد سواء ونتيجة لمونومر homodimer ثاني كبريتيد مرتبطة. تم العثور على هذه المستقبلات جيدا الحفاظ على خلايا NK الأكثر نضجا وتفعيلها مؤخرا فضلا عن مجموعة فرعية من خلايا تي المستجيب / الذاكرة. باستخدام KLRG1 tetramer فضلا عن أساليب أخرى ، E ، N ، وحددت R - cadherins كما KLRG1 يغاندس. هذه كا + التي تعتمد على خلية خلية التصاق جزيئات تتكون من خارج الخلية التي تحتوي على مجال يكرر كادهيرين الخمسة المسؤولة عن الخلية الخلية والتفاعلات ، ومجال وعبر الغشاء مجال هيولي مرتبط إلى الهيكل الخلوي أكتين 2 وكان جيل من tetramer KLRG1 ضرورية لتحديد يغاندس KLRG1. KLRG1 tetramer هو أيضا أداة فريدة لإلقاء الضوء على الأدوار واللعب كادهيرين KLRG1 في تنظيم الاستجابة المناعية وسلامة الأنسجة.

يصف هذا البروتوكول إنتاج tetramer KLRG1 ، الذي هو أداة قوية لتحليل KLRG1 يغاندس.

بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1

يُعد مستقبل مستقبلات الخلايا القاتلة الشبيهة بالليكتين G1 (KLRG1) مستقبلًا مثبطًا من البروتينات السكرية العابرة للغشاء من النوع الثاني، وينتمي إلى العائلة الفائقة للمستقبلات الشبيهة بالليكتين من النوع C.

مرحباً، أنا ستيفاني ريزي من مختبر لورين بارس في قسم الميكروبيولوجيا الجزيئية وعلم المناعة بجامعة براون. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتوليد K LRG one Tetramers. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تفاعلات K LRG one coherent.لنبدأ العمل. أولاً، يتم تلقيح أربع دوارق سعة 500 ملليلتر من منظم TB يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة ببكتيريا تعبر عن بنية بلازميد K LRG one، وتُنمى عند 37 درجة مئوية مع الرج. عندما تصل الكثافة الضوئية OD إلى 0.6 أنجستروم عند 600 نانومتر، يتم تحفيز التعبير عبر محفز T7 بإضافة 0.4 مولار من IPTG، ثم تُحضن المزرعة لأربع ساعات إضافية مع الرج عند 37 درجة مئوية. بعد فترة الحضن التي استمرت أربع ساعات، تُنقل البكتيريا إلى أنابيب طرد مركزي وتُفصل المزارع بالدوران لمدة 20 دقيقة بسرعة 3000 RPM وعند 4 درجة مئوية.إذا لزم الأمر، يمكن تجميد الكريات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية في هذه المرحلة لاستخدامها في وقت لاحق. أعد تعليق الخلايا المحصودة في 30 ملليلتر من منظم تعليق Resus. بعد ذلك، اجمع تعليقات البكتيريا Resus حتى يصل الحجم إلى 60 ملليلتر في دورق بولي بروبيلين.إذا لزم الأمر، أكمل الحجم الإجمالي إلى 60 milliliters باستخدام المزيد من te buffer PH eight وحرك الخليط بنصف السرعة على لوح تحريك ساخن، بينما يتم تحريك pooled Resus suspension، أضف المحاليل التالية قطرة تلو الأخرى إلى الخليط: Lysozyme وmagnesium chloride وD NS one وTRITTON X 100، وأخيراً DTT.انقل المحلول إلى أنابيب طرد مركزي فائقة باستخدام مجزئ شقي مزود بمحول فوق صوتي عند سعة 30%. قم بمعالجة المحلول بالموجات فوق الصوتية على الثلج لمدة 1.5 دقيقة، ثم قم بطرد المستخلص مركزياً بسرعة 5,000 RPMs لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم اسكب السائل الطافي وأضف 15 milliliters من محلول الغسيل المنظم. كرر المعالجة بالموجات فوق الصوتية كما سبق حتى يتم إعادة تعليق الراسب تماماً، وكرر عملية الطرد المركزي؛ كرر خطوات الغسيل والمعالجة بالموجات فوق الصوتية والترسيب خمس مرات.أخيراً، أعد تعليق الراسب باستخدام محلول غسيل لا يحتوي على Triton X 100. قم بالطرد المركزي مرة أخرى ثم أعد التعليق في أربعة ملليلتر من محلول TE المنظم. هذه هي أجسام الاشتمال الخاصة بك.قم بتحديد كمية أجسام الاحتواء الخاصة بك عن طريق الوزن الرطب. يمكن الاحتفاظ بمعلق أجسام الاحتواء عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في مخزونات من المنظم بتركيزات تتراوح من 30 إلى 100 milligram per milliliter. بعد تجهيز أجسام الاحتواء، يمكنك الآن الاستعداد لعملية إعادة الطي.ابدأ إجراء إعادة الطي بتحضير زجاجة جديدة سعة لتر واحد من محلول إعادة الطي المنظم (Refolding buffer)، وقم بالتحريك بسرعة منخفضة عند درجة حرارة 4 °C للتبريد. بعد ذلك، ستقوم بتحضير سبع حقنات من الأجسام الاشتمالية لحقنها في محلول إعادة الطي المنظم. أولاً، قم بإذابة مخزون ملاط الأجسام الاشتمالية في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على حجم نهائي قدره 1.4 mL من guine hydrochloride بتركيز 7 M بالإضافة إلى 10 mM من beam mercaptoethanol، وذلك في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 30 إلى 40 دقيقة.الرج بالدوامة كل خمس دقائق. ستعرف أن عملية الصهر قد اكتملت عندما يصبح المعلق صافياً.قم بطرد الخليط المذاب مركزياً بالسرعة القصوى لمدة 30 دقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ثم، مع الحرص على عدم جمع أي جزء من الراسب الأسود الصغير، انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.اضبط الحجم إلى 7 mL باستخدام محلول الحقن المنظم (injection buffer) تمهيداً للحقن. أولاً، ارفع سرعة تحريك خليط الطي (folding mixture) إلى السرعة العالية. ثم أضف 1 mL من الأجسام الاشتمالية (inclusion bodies) المخففة.أضف المحلول قطرة تلو الأخرى مع ترك فاصل زمني مدته ثانيتان فقط بين كل قطرة. أضف واحد ملليلتر من الأجسام الاشتمالية المخففة في كل مرة، مع ترك ساعة واحدة بين كل عملية حقن وأخرى. ثم أعِد سرعة التقليب إلى الدرجة المنخفضة.استمر في التقليب بسرعة منخفضة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ستصبح البروتينات بعد ذلك جاهزة للتركيز والتنقية. للبدء في تركيز رباعيات KLRG one المعاد طيها.أولاً، قم بترشيح التفاعل أولياً باستخدام مرشح بمسامية 22 micrometer. ثم قم بتركيز التفاعل من لتر واحد إلى حوالي 10 milliliters باستخدام خلية تقليب Millipore Amon وغشاء ترشيح فائق بحد وزن جزيئي اسمي قدره 10 kilodalton وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، وباستخدام غشاء ترشيح فائق من Millipore بحد وزن جزيئي قدره 10 kilodalton، قم بالتركيز بشكل إضافي ليصل الحجم إلى أقل من أو يساوي 2 milliliters.قم بإعداد نظام الكروماتوغرافيا الخاص بك وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. نحن نستخدم نظام GE healthcare ACTA للكروماتوغرافيا السائلة السريعة للبروتينات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية باستخدام عمود عالي الدقة. قم بتنقية الشكل أحادي القسيمة (monomer) من K lrg، في 20 millimolar heaps و 150 millimolar sodium chloride عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.يجب أن يكون حجم العينة المحقونة أقل من 2% من الحجم الإجمالي للهلام في العمود. ومرة أخرى، باستخدام غشاء ترشيح فائق من نوع Millipore بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10 kilodalton، قم بتركيز KLG one monomer بشكل أكبر حتى الوصول إلى حجم نهائي قدره 1 milliliter وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تخلص من البيوتين الحر عن طريق التنقية كما سبق باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على الرباعي (tetramer).امزج مونومرات KL LRG one مع فائض مولي بمقدار أربعة أضعاف من رباعيات الستريبتفيدين المقترنة بـ FICO rine، وهي متاحة الآن لوصم ربيطات المستقبلات. يوضح هذا الرسم البياني نتيجة إيجابية لفصل بروتينات K lrg one المعاد طيها باستخدام كروماطوغرافيا استبعاد الحجم من اليسار إلى اليمين. وتوضح القمم أشكال المتعددات والثنائيات والمونومرات لبروتين K LRG one.تمثل القمة الموجودة في أقصى اليمين عملية تبديل المنظم. وبالرغم من ضرورة اختبار ظروف إعادة الطي تجريبيًا لكل بروتين، إلا أنه من المفترض أن تكون مستقبلات الليكتين من النوع C الأخرى قابلة للتكوين كرباعيات باستخدام بروتوكول مماثل، مما يتيح إمكانية تحديد ربيطات أخرى. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إنشاء رباعي KLRG عند القيام بهذا الإجراء.من المهم تذكر التحقق من مستويات الحث والالتزام الصارم بشروط إعادة الطي. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

القدرة على إنتاج لالجينات...

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء التي هي مناسبة لتحليل الهيكلية التي كتبها صدى حل المغناطيسي النووي (NMR) والتطبيقات التحليلية الأخرى.

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

البروتين كريسبر المرتبطة Cpf1 يمكن أن تسترشد رنا كريسبر المصممة خصيصا (الحمض النووي الريبي النووي) لتلتصق الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في المواقع المطلوبة، وتوليد نهاية لزجة. واستنادا إلى هذه الخاصية، تم إنشاء معيار تجميع الحمض النووي (C- الطوب)، ويرد وصف بروتوكول بالتفصيل استخدامه هنا.

بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1

هنا، فإننا نقدم سلسلة الجمعية جرنا الاستنساخ (ستأجر)، أسلوب متعدد ناقلات جرنا بسهولة لنهج كريسبر/Cas9. ستأجر يجعل الإرسال المتعدد جرنة بسيطة وفعالة وقابلة للتخصيص.

بروتوكول قابل للتخصيص "الجمعية سلسلة" جرنة الاستنساخ (ستأجر)

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام مراسل التي يمكن استخدامها لتحديد وتقدير حجم التفاعلات مستقبلات-يجند.

نظام مراسل الحرب البيولوجية لدراسة التفاعلات مستقبلات-يجند

يعرض هنا بروتوكول لتنفيذ جزيء واحد Förster نقل الطاقة الرنين لدراسة قرار HJ. يتم استخدام الإثارة بالتناوب بلونين لتحديد ثوابت التفكك. ثم يتم تطبيق smFRET الفاصل الزمني لون واحد في الاختبارات الانقسام في الوقت الحقيقي للحصول على توزيع الوقت يسكن قبل قرار HJ.

واحد جزيء Förster الرنين أساليب نقل الطاقة للتحقيق في الوقت الحقيقي من قرار تقاطع هوليداي من قبل GEN1

هنا ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن جين eGFP كجين تحوير متكامل مستقر باستخدام نظام pLEXSY. تم استنساخ الطفيليات المنقولة عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان في كلا النوعين لاستخدامها مرة أخرى في فحوصات فحص الأدوية.

تطوير سلالات أنواع الليشمانيا مع التعبير التأسيسي ل eGFP

تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة يوضح كيف يمكن تكييف الاستنساخ المعياري (MoClo) لاستنساخ الأوبرونات متعددة السترون.

التجميع المعياري القياسي لمشغلات Polycistronic مع الاستنساخ المعياري (MoClo) باستخدام مجموعة أدوات الاستنساخ

أسست هذه الدراسة طريقة تستخدم توسع الشيفرة الجينية لدمج اللاكتيل-ليسين (Klac) بنجاح في مواقع محددة من الإنولاز-1 البشري (hENO1) والسوبرفولد GFP (sfGFP) في الخلايا الإشريكية القولونية والثدييات.

لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع عبر توسع الشيفرة الجينية في الإشريكية القولونية وخلايا الثدييات

تعلم إنتاج Tetramer KLRG1 لتحليل التفاعلات المناعية باستخدام البكتيريا والتعبير عن البروتين. يوفر هذا البروتوكول إطاراً موثوقاً لدراسة KLRG1 في البحوث المناعية.

بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1

استكشف المزيد من الفيديوهات