Name: Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: تعلم إعداد شرائح العظام غير المفككة لدراسة البنية الدقيقة والمكونات المعدنية والخلوية. يوضح هذا الفيديو التحديات التقنية والحلول العملية للحصول على نتائج دقيقة في البحث والتطبيقات السريرية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أن نعترف بمساعدة السيدة سو كونيل لخبرتها في تضمين الراتنج ومقابر السيدة Stephania للخبرة مختبرها. فإن الكتاب أود أن أشكر الأستاذ الدكتور فرانك وKandziora Polboth ماري آن لنصائحهم.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع النسيج في حاوية مغلقة تحتوي على الفوسفات بنسبة 10 ٪ مخزنة حل الفورمالين 3. ضمان الحد الأدنى من التعرض للضوء ، وإذا كان التحليل هو ملون تألقي التي يتعين القيام بها ، كما fluorochromes خفيفة حساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أي اتجاه من النسيج ستكون مطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم لحجم العينة ، في الاتجاه الصحيح ، وذلك باستخدام الموجات رأى. وانضمت لضمان اجراءات السلامة. ثم يتم وضع العينة في وعاء غير شفاف ، يجب أن يكون حجم منها ما يقرب من عشرة أضعاف حجم العينة الكافي لتحقيق التثبيت. وينبغي أن العينة البقاء في حل ما مجموعه الفورمالين بين واحد وأسبوعين اعتمادا على حجمها. يقترح استخدام أنسجة السيطرة لأغراض الاختبار والتحسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الأنسجة يصب في قالب دمج ومكان النسيج في وعاء غير شفاف مختومة تحتوي على الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية النسيج في الصعود تركيزات الإيثانول ، التدريع من الضوء وتحت تحريض مستمر. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 ٪ الايثانول 1 أسبوع </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم مسح النسيج في لبيوتانول 1 أسبوع ، التدريع مرة أخرى من الضوء وتحت تحريض مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون كثافة العظم الراتنج والمتطابقة عن كثب ، ويمكن تغيير كثافة الراتنج (راجع الخطوة 8) ونحن نوصي تضمين عينة الاختبار الأول لضمان كثافة الصحيح. نستخدم Technovit 7100 (هيراوس Kulzer) للفحص المجهري والتحليل ضوء ملون تألقي. يجب إذا كان مطلوبا المناعية يمكن استخدام الراتنج بديلة مثل Technovit 9100 (هيراوس Kulzer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون مختلطة الحل Technovit 7100 مع إعداد aliquots صغير من الحل تليين المتوفرة مع هذه المجموعة ، إذا كان ذلك مطلوبا ، ولكن بما لا يزيد عن 5 ٪ من حجم الحل الإعداد ؛ في تجربتنا هو مطلوب نادرا ما الحل تلين. تختلط أجزاء متساوية من الإيثانول المطلق وقاعدة Technovit السائل 7100 وتطبيقه على أنسجة كحل قبل التسلل لمدة 24 ساعة والحد من التعرض للضوء مع الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ثم أدلى به حتى حل تسلل 1 تصليب ز الأول (= 1 كيس) وهو يذوب في 100 مل السائل القاعدة. يستبدل هذا الحل قبل التسلل ، ويسمح للتسلل ل1 أسبوع تحت التحريض المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان النسيج في القالب ، مع خفض سطح الوجه. ضمان وجود هامش (من الناحية المثالية لا يقل عن 5 ملليمترات) حول الأنسجة لالراتنج ، وهذا يضمن قوة الكتلة. مزيج من محلول 15mls Technovit إعداد 7100 مع 1 مل من الثانية تصليب وتصب حول العينة في القالب ، وتغطي ما لا يقل عن 5 millimietres. وسوف تبدأ المعالجة في غضون 2 ساعة ، ولكن سوف يكون كاملا بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تنفيذ متصاعدة من جانب تشكيل كتلة دعم استخدام Technovit 3040 (هيراوس Kulzer). مزيج Technovit 3040 في نسبة حجم 2 أجزاء مسحوق السائل إلى الجزء 1 للحصول على السائل اللزج. صب Technovit 3040 في عطلة في الجزء الخلفي من كتلة الى مستوى لا يقل عن 2 مم فوق قاعدة الكتلة. ويمكن بعد حوالي 10 دقائق يكون مقشر العفن بعيدا وكتلة جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كثافة وبالتالي خصائص القطع من راتنج ميتاكريليت عرضة للرطوبة الجو المحيط في الغرفة. ولذلك ينبغي أن تكون القطع المخزنة في dessicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sectioning الأرض تنتج أكبر أقسام بين 20-50 ميكرومتر في السمك. ومن المفيد للتحليل ملون تألقي (أنظر أدناه) ، وتنتج أكثر إشراقا أقسام سمكا مضان. تأمين شفرة الماس لmacrotome. إضافة مواد التشحيم ، مثل روح النفط الى الخزان على macrotome. تأمين كتلة في المشبك وتوجيه إلى النصل. السماح لطحن تحدث ببطء (حوالي 20-30 دقيقة لكل قسم) ضمان تزييت كاف. القسم الأول يعرض وجه القطع ويرشد المقطع يجب أن يكون التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع المقطع التالي على شريحة Superfrost بلس. المقطع لديه ميل لحليقة لذا ننصح بوضع جزء من كيس ساندويتش وعقد أكثر من ذلك ثم انها مسطحة مع شريحة أخرى علقت في المكان. ثم يوضع في حاضنة بين 60-80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. هذا يخفف من ميتاكريليت ويساعد القسم التمسك الشريحة بطريقة مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يكون تنظيف الأرض المقطع والمصقول على النحو المطلوب باستخدام الصنفرة غرامة الحصباء بأسلوب لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومشراح تمزلج خفض الشرائح الرقيقة ، والذي يوفر أفضل المقاطع لmicrosocopy الخفيفة. استخدام مشراح تمزلج كما زاد صلابة ، وهو الأمر المطلوب لقطع هذه الكتل الصلبة. بدلا من ذلك يمكن استخدام مشراح بالطاقة الدوارة. استخدام شفرة حادة من الصلب المقاوم للصدأ. فمن الأفضل أن يكون اثنين من ريش متوفرة كما يمكن شحذ واحد كما في غيرها من يستخدم. ينبغي أن تجعل شفرة زاوية 45 درجة مع الكتلة. سولا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق rface تليين ورقة مبللة إلى كتلة إذا لزم الأمر. قد يستغرق عدة أقسام لتحقيق الشروط المطلوبة للحصول على قطع قسم الجودة. ومن ثم طرح الجزء المتعلق حمام ماء وتوضع على شريحة كما في 16 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد في المواد الكاشفة تلطيخ أدناه. وتستند البروتوكولات المتعلقة بانكروفت 4 آخرون. نظرا لاختلاف سماكة فمن المستحسن لتحسين البقع على شرائح الاختبار. قد تسبب تلطيخ رف الأنسجة لتطفو قبالة الشريحة حتى البقع مباشرة إضافة إلى شريحة المسطحة قد تكون مطلوبة. بروتوكول مطابقة أو تلطيخ الرف هو ضروري من أجل تحقيق نتائج متسقة اللازمة لتلطيخ histomorphometry. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وHaematoxylin يوزين <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 5-10 دقائق Haematoxyilin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا بماء الصنبور سكوت ق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 5 دقائق يوزين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء الصنبور </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضح في الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = الوردي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متكلسة العظم = البني الأرجواني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوى = زرقاء </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فون كوسا <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في محلول نترات الفضة وفضح لضوء قوي حتى العظم المعدنية سوداء (حوالي 10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء مقطر ثلاث مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التهديد مع ثيوسلفات الصوديوم لمدة 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء مقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون مباين مع O Safrinin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضح في الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظم Mineralised = أسود </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = أحمر / وردي </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماسون Goldner ق ثلاثي الألوان <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع الكحول القلوية (90mls من الايثانول 80 ٪ من الأمونيا و10mls 25 ٪ لمدة 20 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع Haematoxylin Weigert ليالي لمدة 10 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الحل النهائي الشقائقية فوكسين - 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في الفسفومولبديك 5 دقائق حمض البرتقال حل G </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الضوء الأخضر 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 3 التغييرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظم Mineralised = أخضر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = أحمر / برتقالي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوى = الأزرق والرمادي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغضروف = الأرجواني </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون تألقي التحضير : </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدار من قبل هذه الحقن في الوريد ببطء ، على الأقل اسبوعين إربا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرعات <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein الخضراء 10 ملغ / كغ الرابع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسي تتراسكلين 50 ملغم / كغم الرابع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأليزارين Complexone 30 ملغ / كغ الرابع </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأخضر Calcein <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعاير غرام واحد من الأخضر Calcein مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 M المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 ٪ = 7،1-7،2 درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية والحفاظ على محمية من الضوء </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Complexone الأليزارين <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعاير ثلاثة غرامات من هيدروكسيد الصوديوم مع complexone الآليزارين M 1 حتى المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم 1 ٪ أو حتى درجة الحموضة = 7،1-7،2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية والحفاظ على محمية من الضوء </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أكسي تتراسكلين <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسي تتراسكلين يتوفر كما عقار مضاد للميكروبات من على الرف. لا يلزم الإعداد. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

المذيبات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت عادي 10 ٪ حمض الفورمالين ، والإيثانول ، والزيلين بيوتانول جميع الرتب الأنسجة ، حرر الكبريت. Grale العلمية بي تي واي المحدودة http://www.grale.com.au </li></ul> قوالب : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا ، والقوالب البلاستيكية Grale العلمية </li></ul> الشرائح : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر شرائح SUPERFROST PLUS ومب العلمية بي تي واي المحدودة <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> الراتنج : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Technovit GlycolMethacrylate 7100 هيراوس Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دعم كتلة صمغية - Technovit كتلة Histo 3040 هيراوس Kulzer </li></ul> بقع (الكواشف من العلم Grale) ثلاثي الألوان Goldner وصمة عار </li> 1. Weigert من حديد hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) حل Hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1G </td></tr><tr><td> الكحول المطلق </td><td> 100ML </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) الحديد الحل </td></tr><tr><td> 30 ٪ كلوريد الحديديك المائي </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك (تركيز) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> 95mL </td></tr></table> تمت تصفيتها ، وأضاف إلى حجم مساو من hemotoxylin تستخدم من قبل على الفور وصمة عار. 2. الشقائقية - فوكسين - azophloxin الأسهم حلول <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) حل الشقائقية دي زايليدين </td></tr><tr><td> الشقائقية دي زايليدين </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> حمض fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> حمض الخليك </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) حل azophloxin </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ج) العمل النهائية حل صمة عار </td></tr><tr><td> الشقائقية - فوكسين الحل </td><td> 5 - 10ML </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> 0.2 ٪ محلول حمض الخليك </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. ضوء أخضر الحل <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> الضوء الأخضر </td><td> 1G </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (500mL) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic حل G حمض البرتقال <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> حمض الفسفومولبديك </td><td> 3G </td></tr><tr><td> البرتقالي G </td><td> 2G </td></tr><tr><td colspan="2"> تذوب في الماء المقطر 500ml من الثيمول وإضافة الكريستال. </td></tr></table> فون كوسا اللطخة <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> مائي 1 ٪ نترات الفضة </td></tr><tr><td> ثيوسلفات الصوديوم 2.5 ٪ </td></tr><tr><td> 1 ٪ safranin O </td></tr></table> زرقة الألسيان صمة عار <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> زرقة الألسيان 8GX </td><td> 1G </td></tr><tr><td> 3 ٪ من محلول حمض الخليك </td><td> 100ML </td></tr></table> وصمة عار Hemotoxylin يوزين <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) هاريس hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5G </td></tr><tr><td> كحول مطلق </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> البوتاسيوم الشب </td><td> 50G </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> أكسيد الزئبق </td><td> 1.25g OR </td></tr><tr><td> يودات الصوديوم </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> الجليدية حمض الخليك </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) حل يوزين </td></tr><tr><td colspan="2"> وقد استخدم يوزين المنتجة تجاريا. </td></tr></table> كل مساحيق صبغ هي وصمة عار Gurr مساحيق صباغة. كل الكواشف والكواشف التحليلية ، وليس الكواشف المخبرية Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> الصانع </td><td> ملون تألقي </td><td> رقم كتالوج </td></tr><tr><td> سيغما الدريخ ، سيدني </td><td> Calcein الخضراء </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> سيغما الدريخ ، سيدني </td><td> الأليزارين Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> إنترفيت استراليا وفيكتوريا </td><td> أكسي تتراسكلين (قبالة الجرف المخدرات المضادة للميكروبات) </td><td> الاسم التجاري ؛ Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل histomorphometry ملون تألقي

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified الأنسجة العظمية يوضح الهيكل الصغير للعظم. ويعرض كل من المكونات المعدنية للعظم والخلوية ، التي توفر معلومات حيوية عن دوران العظم أو تكوين العظام وارتشاف. هذا له أهمية كبيرة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. أنها تعود الصور الجميلة (1) ويسمح لتقنيات مثل تقييم ملون تألقي وhistomorphometry 2. ملون تألقي التحليل هو تقنية حيث يتم حقن الأصباغ الفلورية التي تربط إلى الكالسيوم في نقطة زمنية معينة ، والذي يسمح لتقدير حجم كمية تمعدن في ذلك الوقت بعينه. Histomorphometry هو عملية تقدير العظام على المستوى المجهري. أداء undecalcified الأنسجة العظمية يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. فهي تتطلب تغييرات في أسلوب من تلك المستخدمة في البارافين القياسية جزءا لا يتجزأ من الأنسجة. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها. وتتحقق إعداد العينات ، وتجهيز مع تثبيت بطريقة مماثلة لغيرها من الأنسجة اللينة ، ولكن نظرا لكثافة وأقل نفاذية للعظم كبير تعد مطلوبة تثبيت وتجهيز مرات ، مع الأخذ في كثير من الأحيان عدة أسابيع. ويتم تحقيق دمج باستخدام وسيلة دعم مماثل مع صلابة وكثافة أو يساوي حتى العظم مثل ميتاكريليت مقرها راتنجات ، ولكن خلافا تسلل البارافين والتضمين ، وهذا هو خطوة لا رجعة فيها. لا يمكن أن يتحقق عن طريق طحن Sectioning التي تنتج أكثر سمكا المقطع ، الذي هو الأمثل لمثل هذه الدراسات والتحليل ملون تألقي. هو أفضل طريقة لتحقيق ذلك باستخدام شفرة الماس على macrotome. بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج أرق أقسام للالمجهر الضوئي ويتحقق هذا باستخدام مشراح تمزلج بشفرة حادة جدا. ومشراح تمزلج يوفر قوة إضافية والاستقرار المطلوبة لكتل ​​كبيرة وصعبة. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من المقاطع ملون الراتنج مع مجموعة متنوعة من البقع ، والتي أظهرت.

Undecalcified الأنسجة العظام يوفر معلومات هامة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. فإنه يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها.

Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

يُظهر الفحص النسيجي للعظام غير منزوعة الكالسيوم البنية المجهرية للعظم، حيث يوضح المكونات المعدنية والخلوية للعظم على حد سواء، مما يوفر...

ويُظهر الفحص النسيجي للعظام منزوعة الكالسيوم البنية المجهرية للعظم، حيث يوضح كلًا من المكونات المعدنية والخلوية، مما يوفر معلومات حيوية حول عملية تجدد العظام أو تكوين العظام وامتصاصها. ولهذا الأمر أهمية بالغة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحثية؛ إذ يوفر صورًا دقيقة ويسمح باستخدام تقنيات مثل تقييم الفلور والقياسات النسيجية.يمثل إجراء الفحص النسيجي أسفل العظم المتكلس تحدياً تقنياً، لا سيما مع العينات ذات الحجم الكبير. سيوضح هذا الفيديو الصعوبات التقنية والطرق المتبعة للتغلب عليها في الحصول على مقاطع نسيجية من أسفل العظم المتكلس. ولن يتطرق الفيديو إلى تقييم القياسات النسيجية المورفومترية لهذه المقاطع.لهذا الغرض، نحيلكم إلى المنشور الهام التالي. سيتناول هذا الفيديو تحضير العينات ومعالجة التثبيت، والصب والتقطيع بنوعيهما (البري والقطعي)، وتحضير الشرائح والصباغة بعد عملية جمع الأنسجة. العينة.في هذه الحالة، يتم وضع الفقرات العنقية للخروف في حاوية معتمة ومحكمة الإغلاق تحتوي على محلول صيغة فوسفاتية منظمة بتركيز 10%. يجب تقليل التعرض للضوء إلى أدنى حد إذا كان سيتم إجراء تحليل الفلوروكروم. ونظراً لأن الفلوروكرومات حساسة للضوء، يتم نقل العينة بعد ذلك إلى المختبر وتقليمها لتصل إلى الحجم المطلوب، مما يحسن عملية التثبيت ويضمن ملاءمتها داخل القالب.على الرغم من ضرورة معرفة توجيه النسيج على الشريحة في هذه المرحلة حتى يمكن تحضير القالب في المستوى الصحيح. تعد السلامة أمراً بالغ الأهمية، ويجب استخدام الأدوات بحيث تظل اليدان بعيدتين عن الشفرة. يتم الآن تشذيب المنطقة ذات الاهتمام إلى الحجم المطلوب.يتم بعد ذلك إجراء التشذيب النهائي باستخدام منشار شريطي أصغر، مما يؤدي إلى تقليل فقدان الأنسجة. وبمجرد قطع الكتلة إلى الحجم المطلوب، توضع في حاوية معتمة ومحكمة الإغلاق تحتوي على محلول تثبيت جديد لإتمام عملية التثبيت. يجب أن يكون حجم الحاوية أكبر بحوالي 10 مرات من حجم العينة.لتحقيق تثبيت مناسب، يجب أن تظل العينة في التركيبة والمحلول لمدة تتراوح بين أسبوع وأسبوعين، اعتماداً على حجمها، وبعد ذلك يتم نقلها إلى 70%Ethanol. يتم بعد ذلك إجراء المعالجة ببطء، حيث إن الحجم الكبير للكتل وانخفاض نفاذية العظام يؤديان إلى بطء انتشار المذيبات. ثم يتم إجراء عملية إزالة المياه باستخدام تركيزات تصاعدية من الإيثانول، تليها عملية الترويق في البوتانول. تُحفظ العينة محمية من الضوء وتحت تقليب مستمر.نوصي بالبقاء في كل محلول لمدة أسبوع واحد تقريبًا. وبناءً على ذلك، تستغرق عملية المعالجة من أربعة إلى ستة أسابيع. يجب عدم استعجال هذه العملية لأن ذلك سيؤثر سلبًا على الجودة النهائية للمقاطع.تتوفر خيارات متنوعة من التضمين للعظام المتكلسة. ويعتمد اختيار الراتنج أو الميثاكريلات على طبيعة الاختبار المراد إجراؤه؛ فعلى سبيل المثال، لا يمكن إجراء الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام جميع أنواع الراتنجات.تتطلب راتنجات الإيبوكسي الضوء فوق البنفسجي (UV) للتصلب، وهو ما قد يتداخل مع تحليل الفلوروكروم. ونوصي بمراجعة مواصفات الشركة المصنعة قبل اتخاذ اختيار دقيق. نحن نستخدم TEVI 7, 100 لأن ذلك يسمح بالحصول على مقاطع مقطوعة ومصقولة بشكل جيد للفحص بالمجهر الضوئي وتحليل الفلوروكروم، كما أنه فعال من حيث التكلفة.إن الاعتبار المهم عند عملية الطمر هو ضرورة التقارب الشديد بين كثافة العظام وكثافة وسط الطمر. وهذا أمر بالغ الأهمية عند تقطيع القوالب لاحقاً، خاصة في حالة التقطيع المجهري؛ حيث يتم تحضير الخليط وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة ورجه بقوة. وقد يكون من المفيد طمر عينات تجريبية لتحسين البروتوكول.على عكس البارافين، تعد هذه الخطوة غير عكسية. توضع القوالب بحيث يكون سطح القطع متجهاً للأسفل داخل القالب. يكون القالب أكبر من الكتلة لتوفير الدعم والقوة.يجب إجراء عملية ترشيح الميثاكريليت ببطء للسماح بأقصى قدر من تغلغل الميثاكريليت داخل العظم. ومرة أخرى، يجب تقليل التعرض للضوء إلى أدنى حد. وبعد مرور أسبوع واحد من استخدام محلول الترشيح، يتم استبدال محلول الترشيح وإضافة محلول التصلب.يتم بعد ذلك تجهيز لوحة دعم، ونستخدم لهذا الغرض tevit 30 40. ثم يتم نزع القالب، وبذلك تصبح الكتلة جاهزة الآن.ينتج التقطيع بالتجليخ مقاطع أكبر يتراوح سمكها بين 20 إلى 50 ميكرون. وتعد هذه الطريقة مفيدة في التحليل الفلوري لأن المقاطع الأكثر سمكاً تعطي وميضاً فلورياً أكثر سطوعاً. ولإنتاج المقطع المجلي، يلزم استخدام ميكروتوم، ويفضل أن يكون مزوداً بشفرة ألماسية. نحن نستخدم شفرة ألماسية منحنية بمقاس 0.6 مليمتر.يُعد استخدام مادة تشحيم أمراً ضرورياً. ونحن نفضل استخدام مادة تشحيم ذات أساس بترولي، رغم أن مواد التشحيم ذات الأساس السيليكوني تعمل بشكل جيد أيضاً. بعد ذلك، يتم وضع القالب في المشبك.يتم تثبيتها في الملقط الكبير (macro term)، ومن ثم تُدفع القطعة باتجاه الشفرة. يكشف المقطع الأول عن وجه القطع ويحدد اتجاه المقطع، لذا يجب التخلص منه.تُعد عملية التجليخ عملية بطيئة ولا ينبغي الاستعجال فيها. كما يجب ضمان التزييت الكافي أثناء تجليخ المقطع، ثم يُوضع بعد ذلك على شريحة.يمكن تنظيف القطاع وتلميعه حسب الحاجة. يميل القطاع إلى الانحناء، لذا نوصي بوضع جزء من كيس تخزين بلاستيكي فوقه وتثبيته بشكل مسطح باستخدام شريحة أخرى مثبتة بمشبك.يتم بعد ذلك وضعه في حاضنة تتراوح درجة حرارتها بين 60 إلى 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يعمل ذلك على تليين مادة الميثاكريلات ويساعد المقطع على الالتصاق بالشريحة بشكل مسطح. نرى هنا صورة فلورية مركبة لثلاثة فلوروكروما مختلفة تم حقنها على فترات شهرية.يتيح ذلك تحديد موقع التمعدن في نقطة زمنية محددة. يمكن العثور على الجرعات وطرق تحضير هذه العلامات في النص. يوفر المصطلح المجهري (micro term) مقاطع رقيقة، وهو الأمر الأفضل للفحص بالمجهر الضوئي.تعد هذه العملية صعبة من الناحية التقنية. لذا نقترح استخدام الميكروتوم المطرقي (sledge microtone) لما يوفره من قوة إضافية لقطع هذه الكتل الصلبة. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الشفرات، بما في ذلك شفرات كربيد التنجستن.ومع ذلك، نوصي باستخدام شفرة من الفولاذ المقاوم للصدأ حيث يمكن إعادة شحذها بسهولة وبشكل متكرر حسب الحاجة. يجب توجيه الشفرة لتشكل زاوية 45 درجة مع الكتلة. وتتأثر كثافة الميثاكريلات بالعديد من العوامل، بما في ذلك الرطوبة المحيطة في الغرفة.لذلك، يجب تخزين القالب في سطح مجفف. ويمكن تحقيق التليين عن طريق وضع ورقة مبللة على القالب إذا لزم الأمر، وقد يتطلب الأمر أخذ عدة مقاطع للوصول إلى ظروف القطع المناسبة للحصول على مقطع عالي الجودة. ومرة أخرى، يتم تثبيت كيس الساندوتش والشريحة الإضافية لتسطيح المقطع قبل وضعه في الحاضنة.تتشابه عملية التلوين مع التلوين النسيجي القياسي للعينات المدمجة في البارافين، باستثناء أن عملية التشميع غير مطلوبة بوضوح. وتشمل الأصباغ الشائعة المستخدمة للعظام صبغة VSA مع صبغة الزعفران المضادة، والزعفران، والأخضر الفاتح الزيتي، وmass on golden as trione. ويتم الرجوع إلى بروتوكولات هذه الأصباغ في النص.يتم اختيار الكواشف وتصفيتها قبل الاستخدام. Golden. تُستخدم هذه الصبغة بشكل متكرر في قياسات الأنسجة البصرية. نوصي بتحسين الصبغات على شرائح اختبار أولاً.بعد كل خطوة، يمكن فحص الشريحة تحت المجهر للتأكد من دقة التلوين، مما يسمح بتحديد الأوقات الصحيحة لكل صبغة من المكونات. وبمجرد تحسين معيار التلوين، تُصبغ جميع شرائح التجربة في وقت واحد داخل حامل شرائح باتباع البروتوكول نفسه، وذلك لتجنب تأثير تباين التلوين على هندستها الحرارية.بعد ذلك، يتم تغطية الشرائح بغطاء الشرائح بالطريقة القياسية. نتمنى لكم التوفيق في تجربتكم.

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تحديد Immunocytochemical الطرفية من الألياف العصبية الحسية فرعية (والكشف عن بروتين تعبير فيها) هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الإحساس الطرفية. نحن هنا تصف طرق تحضير عينات الأنسجة المحيطية / الحشوية ، مثل العظام والجلد أطرافهم ، لimmunostaining محددة من الألياف العصبية الطرفية الحسية.

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

يتم تقديم استراتيجية لتحليل البيانات النسيجية كميا في نخاع العظام. ينتج عن الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا المصنفة بالفلورسنت في أقسام الأنسجة صور ثنائية الأبعاد ، والتي يتم تحليلها تلقائيا. تتم مقارنة تحليلات التوطين المشترك لأنواع الخلايا المختلفة بالبيانات من الصور المحاكاة ، مما يعطي معلومات كمية حول التفاعلات الخلوية.

الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

وضعنا مجموعتين من تتبع مجموعات في Rosa26 tdtomato (أعرب بتواجد مطلق في جميع الخلايا) / لجنة المساواة العرقية (أعرب تحديدا في غضروفية) الفئران: واحد مع 2.3Col1a1-GFP (محدد لبانيات) واحد مع المناعي (محددة لخلايا العظام). وتظهر البيانات أن التحول المباشر من غضروفية في خلايا العظام.

شارك في توطين علامات النسب خلية والطماطم الإشارة

يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.

قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry

هنا، نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن وقياس مستويات البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض عن طريق التلطيخ المناعي باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف طريقة لإعداد واستئصال التبريد من الأنسجة الصلبة undecalcified من الفئران الشباب لتلطيخ المناعة.

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

توجد الخلايا الأديبية في مستودعات منفصلة ولها أدوار متنوعة داخل بيئاتها الدقيقة الفريدة. ومع الكشف عن الاختلافات الإقليمية في طابع ووظيفة الخلايا الأديبية، فإن تحديد المستودعات وعزلها بشكل موحد أمر حاسم للنهوض بالميدان. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للختان من مختلف مستودعات الماوس الدهنية.

تحديد وتشريح مستودعات الماوس المتنوعة

يصف هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإنشاء كسر حاجز في عظم الفخذ للفئران ، والذي يتم تثبيته بسلك داخل النخاع ، لدراسات التئام الكسور.

إنشاء نموذج كسر عظم الفخذ الحجابي في الفئران

يقدم هذا البروتوكول نموذجا موحدا لفأر توسيع الخياطة وطريقة تصور 3-D لدراسة التغيرات الميكانيكية البيولوجية للخياطة وإعادة تشكيل العظام تحت تحميل قوة الشد.

تقنية التصور 3-D لإعادة عرض العظام في نموذج الماوس توسيع خياطة

يقدم هذا البروتوكول طريقة اقتصادية وفعالة للتقييم الكمي للهندسة المعمارية الدقيقة للعظام في نموذج فأر لهشاشة العظام من خلال الجمع بين تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين (HE) وتقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT).

تقييم العمارة الدقيقة للعظام التربيقية في نموذج فأر هشاشة العظام

هنا ، نصف طريقة تسمح بإزالة الكلس من أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا والحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة. كما تم توضيح طريقة لتقسيم عينات الفورمالين الثابتة من البارافين (FFPE) للعظام غير المنزوعة المعادن للحصول على نتائج جيدة النوعية إذا لم تكن الأنسجة الطازجة متوفرة أو لا يمكن جمعها.

طرق لتمكين النسخ المكاني لأنسجة العظام

يتضمن هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة للعينات الوعائية المتكلسة: معالجة الأنسجة، إزالة الكلس، التحقق من صحة الحمض النووي الريبي، كشف مستوى التكلس، واستراتيجيات اختيار المناطق ذات الاهتمام باستخدام جهاز Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). الهدف هو تقديم طريقة شاملة للحفاظ على شكل نسيج الأوعية الدموية والحمض النووي الريبي لتحليل النسخ المكاني الموثوق.

تحضير ومعالجة الشريان المتكلس مع مورفولوجيا محفوظة وRNA للتحليل المكاني الرقمي

تعلم إعداد شرائح العظام غير المفككة لدراسة البنية الدقيقة والمكونات المعدنية والخلوية. يوضح هذا الفيديو التحديات التقنية والحلول العملية للحصول على نتائج دقيقة في البحث والتطبيقات السريرية.

Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

استكشف المزيد من الفيديوهات