Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

ويُظهر الفحص النسيجي للعظام منزوعة الكالسيوم البنية المجهرية للعظم، حيث يوضح كلًا من المكونات المعدنية والخلوية، مما يوفر معلومات حيوية حول عملية تجدد العظام أو تكوين العظام وامتصاصها. ولهذا الأمر أهمية بالغة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحثية؛ إذ يوفر صورًا دقيقة ويسمح باستخدام تقنيات مثل تقييم الفلور والقياسات النسيجية.

يمثل إجراء الفحص النسيجي أسفل العظم المتكلس تحدياً تقنياً، لا سيما مع العينات ذات الحجم الكبير. سيوضح هذا الفيديو الصعوبات التقنية والطرق المتبعة للتغلب عليها في الحصول على مقاطع نسيجية من أسفل العظم المتكلس. ولن يتطرق الفيديو إلى تقييم القياسات النسيجية المورفومترية لهذه المقاطع.

لهذا الغرض، نحيلكم إلى المنشور الهام التالي. سيتناول هذا الفيديو تحضير العينات ومعالجة التثبيت، والصب والتقطيع بنوعيهما (البري والقطعي)، وتحضير الشرائح والصباغة بعد عملية جمع الأنسجة. العينة.

في هذه الحالة، يتم وضع الفقرات العنقية للخروف في حاوية معتمة ومحكمة الإغلاق تحتوي على محلول صيغة فوسفاتية منظمة بتركيز 10%. يجب تقليل التعرض للضوء إلى أدنى حد إذا كان سيتم إجراء تحليل الفلوروكروم. ونظراً لأن الفلوروكرومات حساسة للضوء، يتم نقل العينة بعد ذلك إلى المختبر وتقليمها لتصل إلى الحجم المطلوب، مما يحسن عملية التثبيت ويضمن ملاءمتها داخل القالب.

على الرغم من ضرورة معرفة توجيه النسيج على الشريحة في هذه المرحلة حتى يمكن تحضير القالب في المستوى الصحيح. تعد السلامة أمراً بالغ الأهمية، ويجب استخدام الأدوات بحيث تظل اليدان بعيدتين عن الشفرة. يتم الآن تشذيب المنطقة ذات الاهتمام إلى الحجم المطلوب.

يتم بعد ذلك إجراء التشذيب النهائي باستخدام منشار شريطي أصغر، مما يؤدي إلى تقليل فقدان الأنسجة. وبمجرد قطع الكتلة إلى الحجم المطلوب، توضع في حاوية معتمة ومحكمة الإغلاق تحتوي على محلول تثبيت جديد لإتمام عملية التثبيت. يجب أن يكون حجم الحاوية أكبر بحوالي 10 مرات من حجم العينة.

لتحقيق تثبيت مناسب، يجب أن تظل العينة في التركيبة والمحلول لمدة تتراوح بين أسبوع وأسبوعين، اعتماداً على حجمها، وبعد ذلك يتم نقلها إلى 70%Ethanol. يتم بعد ذلك إجراء المعالجة ببطء، حيث إن الحجم الكبير للكتل وانخفاض نفاذية العظام يؤديان إلى بطء انتشار المذيبات. ثم يتم إجراء عملية إزالة المياه باستخدام تركيزات تصاعدية من الإيثانول، تليها عملية الترويق في البوتانول. تُحفظ العينة محمية من الضوء وتحت تقليب مستمر.

نوصي بالبقاء في كل محلول لمدة أسبوع واحد تقريبًا. وبناءً على ذلك، تستغرق عملية المعالجة من أربعة إلى ستة أسابيع. يجب عدم استعجال هذه العملية لأن ذلك سيؤثر سلبًا على الجودة النهائية للمقاطع.

تتوفر خيارات متنوعة من التضمين للعظام المتكلسة. ويعتمد اختيار الراتنج أو الميثاكريلات على طبيعة الاختبار المراد إجراؤه؛ فعلى سبيل المثال، لا يمكن إجراء الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام جميع أنواع الراتنجات.

تتطلب راتنجات الإيبوكسي الضوء فوق البنفسجي (UV) للتصلب، وهو ما قد يتداخل مع تحليل الفلوروكروم. ونوصي بمراجعة مواصفات الشركة المصنعة قبل اتخاذ اختيار دقيق. نحن نستخدم TEVI 7, 100 لأن ذلك يسمح بالحصول على مقاطع مقطوعة ومصقولة بشكل جيد للفحص بالمجهر الضوئي وتحليل الفلوروكروم، كما أنه فعال من حيث التكلفة.

إن الاعتبار المهم عند عملية الطمر هو ضرورة التقارب الشديد بين كثافة العظام وكثافة وسط الطمر. وهذا أمر بالغ الأهمية عند تقطيع القوالب لاحقاً، خاصة في حالة التقطيع المجهري؛ حيث يتم تحضير الخليط وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة ورجه بقوة. وقد يكون من المفيد طمر عينات تجريبية لتحسين البروتوكول.

على عكس البارافين، تعد هذه الخطوة غير عكسية. توضع القوالب بحيث يكون سطح القطع متجهاً للأسفل داخل القالب. يكون القالب أكبر من الكتلة لتوفير الدعم والقوة.

يجب إجراء عملية ترشيح الميثاكريليت ببطء للسماح بأقصى قدر من تغلغل الميثاكريليت داخل العظم. ومرة أخرى، يجب تقليل التعرض للضوء إلى أدنى حد. وبعد مرور أسبوع واحد من استخدام محلول الترشيح، يتم استبدال محلول الترشيح وإضافة محلول التصلب.

يتم بعد ذلك تجهيز لوحة دعم، ونستخدم لهذا الغرض tevit 30 40. ثم يتم نزع القالب، وبذلك تصبح الكتلة جاهزة الآن.

ينتج التقطيع بالتجليخ مقاطع أكبر يتراوح سمكها بين 20 إلى 50 ميكرون. وتعد هذه الطريقة مفيدة في التحليل الفلوري لأن المقاطع الأكثر سمكاً تعطي وميضاً فلورياً أكثر سطوعاً. ولإنتاج المقطع المجلي، يلزم استخدام ميكروتوم، ويفضل أن يكون مزوداً بشفرة ألماسية. نحن نستخدم شفرة ألماسية منحنية بمقاس 0.6 مليمتر.

يُعد استخدام مادة تشحيم أمراً ضرورياً. ونحن نفضل استخدام مادة تشحيم ذات أساس بترولي، رغم أن مواد التشحيم ذات الأساس السيليكوني تعمل بشكل جيد أيضاً. بعد ذلك، يتم وضع القالب في المشبك.

يتم تثبيتها في الملقط الكبير (macro term)، ومن ثم تُدفع القطعة باتجاه الشفرة. يكشف المقطع الأول عن وجه القطع ويحدد اتجاه المقطع، لذا يجب التخلص منه.

تُعد عملية التجليخ عملية بطيئة ولا ينبغي الاستعجال فيها. كما يجب ضمان التزييت الكافي أثناء تجليخ المقطع، ثم يُوضع بعد ذلك على شريحة.

يمكن تنظيف القطاع وتلميعه حسب الحاجة. يميل القطاع إلى الانحناء، لذا نوصي بوضع جزء من كيس تخزين بلاستيكي فوقه وتثبيته بشكل مسطح باستخدام شريحة أخرى مثبتة بمشبك.

يتم بعد ذلك وضعه في حاضنة تتراوح درجة حرارتها بين 60 إلى 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يعمل ذلك على تليين مادة الميثاكريلات ويساعد المقطع على الالتصاق بالشريحة بشكل مسطح. نرى هنا صورة فلورية مركبة لثلاثة فلوروكروما مختلفة تم حقنها على فترات شهرية.

يتيح ذلك تحديد موقع التمعدن في نقطة زمنية محددة. يمكن العثور على الجرعات وطرق تحضير هذه العلامات في النص. يوفر المصطلح المجهري (micro term) مقاطع رقيقة، وهو الأمر الأفضل للفحص بالمجهر الضوئي.

تعد هذه العملية صعبة من الناحية التقنية. لذا نقترح استخدام الميكروتوم المطرقي (sledge microtone) لما يوفره من قوة إضافية لقطع هذه الكتل الصلبة. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الشفرات، بما في ذلك شفرات كربيد التنجستن.

ومع ذلك، نوصي باستخدام شفرة من الفولاذ المقاوم للصدأ حيث يمكن إعادة شحذها بسهولة وبشكل متكرر حسب الحاجة. يجب توجيه الشفرة لتشكل زاوية 45 درجة مع الكتلة. وتتأثر كثافة الميثاكريلات بالعديد من العوامل، بما في ذلك الرطوبة المحيطة في الغرفة.

لذلك، يجب تخزين القالب في سطح مجفف. ويمكن تحقيق التليين عن طريق وضع ورقة مبللة على القالب إذا لزم الأمر، وقد يتطلب الأمر أخذ عدة مقاطع للوصول إلى ظروف القطع المناسبة للحصول على مقطع عالي الجودة. ومرة أخرى، يتم تثبيت كيس الساندوتش والشريحة الإضافية لتسطيح المقطع قبل وضعه في الحاضنة.

تتشابه عملية التلوين مع التلوين النسيجي القياسي للعينات المدمجة في البارافين، باستثناء أن عملية التشميع غير مطلوبة بوضوح. وتشمل الأصباغ الشائعة المستخدمة للعظام صبغة VSA مع صبغة الزعفران المضادة، والزعفران، والأخضر الفاتح الزيتي، وmass on golden as trione. ويتم الرجوع إلى بروتوكولات هذه الأصباغ في النص.

يتم اختيار الكواشف وتصفيتها قبل الاستخدام. Golden. تُستخدم هذه الصبغة بشكل متكرر في قياسات الأنسجة البصرية. نوصي بتحسين الصبغات على شرائح اختبار أولاً.

بعد كل خطوة، يمكن فحص الشريحة تحت المجهر للتأكد من دقة التلوين، مما يسمح بتحديد الأوقات الصحيحة لكل صبغة من المكونات. وبمجرد تحسين معيار التلوين، تُصبغ جميع شرائح التجربة في وقت واحد داخل حامل شرائح باتباع البروتوكول نفسه، وذلك لتجنب تأثير تباين التلوين على هندستها الحرارية.

بعد ذلك، يتم تغطية الشرائح بغطاء الشرائح بالطريقة القياسية. نتمنى لكم التوفيق في تجربتكم.