Name: فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: تعلم تقنية التحويل الوراثي الفسيفسائي في أسماك الزرد لتحليل عناصر المحسّن المرتبطة بتنظيم النسخ الجيني. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم تنمية الهيكل العظمي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر السيدة باولا لتربية الأسماك روي ممتازة ، وEkker ستيف لهدية كريمة من البلازميد pDB600. وتم تمويل هذه الدراسات من جانب منحة لسادس من NHGRI.

1. اختيار واستنساخ تسلسل حفظها للاختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على المرء أولا تحديد متواليات التنظيمية المحتملة لاختبار وظيفية. نحن نعتمد على الحفاظ على التسلسل التطوري كمعيار لتحديد متواليات ، وغالبا ما تستخدم PhastCons الخوارزمية ، الذي هو في متناول الجميع باعتباره المسار على متصفح الجينوم UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). ومع ذلك ، هناك العديد من الخوارزميات الأخرى المتاحة لتقييم الحفظ عبر تسلسل الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة لدينا تحديد تسلسل لدينا ، ونحن تصميم الاشعال لتضخيم كل تسلسل الحمض النووي من الجيني. وينبغي اختيار الاشعال لتضخيم المنطقة بالاضافة الى الحفاظ أزواج قاعدة 30 أو أكثر على أي من الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التضخيم من متواليات اخترنا استخدام نظام تاكارا TaqTM لوس انجليس. سوف polymerases الأعمال الأخرى ، ولكن من المهم أن استخدام مزيج يتضمن انزيم مع القدرة على تصحيح التجارب المطبعية ، لتقليل فرص الأخطاء التي أدخلت خلال التضخيم. علينا التحقق من حجم amplicon بواسطة agarose هلام إستشراد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم 8/GW/TOPO PCR TA الاستنساخ كيت (Invitrogen) لاستنساخ منتج PCR إلى مواقع تحتوي على دخول ناقلات attL إعادة التركيب ، لإنشاء بوابة دخول استنساخ. رد فعل الاستنساخ هو أكثر كفاءة مع المنتج PCR جديدة ، لذلك فمن الأفضل لأداء الاستنساخ خلال يوم واحد من PCR. يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة سبكتينوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا التحقق من نتاج الاستنساخ بواسطة TA هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRI للافراج عن إدراج ، وتأكيد حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. أوصينا تسلسل للتحقق من إدراج تسلسل والتوجيه ؛ ويمكن أيضا استخدامه لتضخيم الاشعال تستعمل لأجل التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ من الدخول ، وزيارات مكوكية تسلسل غير الترميز التي تحفظها تأشب LR لدينا ناقلات الوجهة عبارة جاهزة ، pGW_cfosGFP1 ، وذلك باستخدام عبارة LR Clonase الثاني انزيم ميكس (Invitrogen). يتم تنفيذ التحول في سلالات DH5α تليها اختيار المقاومة أمبيسيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا التحقق من نتاج إعادة التركيب من قبل LR هضم ~ 500ng من البلازميد مع EcoRV للافراج عن إدراج ، والتأكد من حجم إدراج بواسطة agarose هلام إستشراد. مرة واحدة وقد تم استنساخ رصدوا دقيقة ، ونحن نستعد DNA البلازميد باستخدام HiSpeed ​​Qiagen ® مجموعة ميدي البلازميد. ونحن كذلك تنقية البلازميد باستخدام تنقية PCR QIAquick كيت ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة ، وأزل الحمض النووي مع 30 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. وتضعف البلازميد إلى تركيز من 125 نانوغرام / ميكرولتر وتخزينها في 4 درجات مئوية قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو كتب الحمض النووي الريبي الترميز الفنية انزيم transposase Tol2 في المختبر من plasmid2 pDB600 و. نحن تنقية البلازميد باستخدام لوار الإعدادية Qiagen عدة ، ثم يصبح خطي 10-20 ميكروغرام مع XbaI. ويتم تجميع مرنا في أعقاب بروتوكول mMESSAGE كيت mMACHINE (Ambion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكننا تطهير وترسيب الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الطقم. resuspend نحن RNA إلى التركيز النهائي لل1μg/μl ~ ، أو 20 ميكرولتر عن رد فعل واحد ، في الماء ريبونوكلياز الحرة ، وتحديد القياس الطيفي بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. نحن نحلل أيضا ~ 1μg من الحمض النووي الريبي التي agarose هلام إستشراد للتحقق من النسخ الكاملة الطول. على الرغم من أن تاي القياسية أو هلام TBE غير كافية لهذا التحليل ، ينبغي أن تستخدم في تغيير طبيعة وشملت عينة العازلة مع عدة نسخ وفقا لتعليمات الطقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علينا اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase فعالية عن طريق إجراء عمليات الحقن التي تحتوي على (الشكل 1) البلازميد معروفة. بعد التحقق ، ينقسم الحمض النووي الريبي في aliquots الصغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية ، لتجنب تكرار وذوبان refreezing من aliquots الفردية. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. الزرد الجنين حقنوا محسن Sox10 الماوس كعنصر تحكم (الأعلى) Brightfield صورة (القاع) GFP مضان الصورة. يتم اختبار كل دفعة جديدة من الحمض النووي الريبي لtransposase الفعالية. </li></ol> 2. Microinjection الأجنة الزرد لتحليل الفسيفساء المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن لسحب الإبر microinjection من 1.2 ملم خيوط الزجاج OD الشعرية على بولير P - 97 Micropipette سوتر ، مع برنامج مصمم لانتاج تلميح قوي مع تفتق حاد نوعا ما على اختراق chorions سليمة. علينا كسر نصائح باليد تحت stereomicroscope إلى القطر الخارجي حوالي 15 ميكرون ، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وشريحة ميكرون. ويمكن إجراء هذه الإبر في اليوم قبل الحقن ، وتخزينها في صحن عقد مغطاة للحفاظ على نظافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحافظ على موقعنا في الزرد دورة العادية ضوء الظلام ، مع 14 ساعة من الضوء ، في إطار conditions3 القياسية. في اليوم قبل أداء microinjections ، أنشأنا الأسماك للتزاوج موقوتة في خزانات تربية صغيرة ، كل منها يتكون من خزان القاعدة ، وإدراج فترة زمنية محددة ، وغطاء بلاستيكي. نضع ثلاث إناث أو اثنين من الذكور لكل طنكرانك في صفوف متوازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح يوم من microinjections ، وبعد فترة وجيزة من بدء دورة الضوء ، ونحن نبدأ الجمع بين الذكور والإناث في نظام المياه المعالجة النظيفة لإنتاج البيض. فمن المهم للاطمئنان على الأسماك في كثير من الأحيان ، وجمع البيض في غضون بضع دقائق من زرع ، للحصول على دفعات تتزامن أيضا. يمكن الحفاظ على إنتاج البيض لمدة سنتين إلى ثلاث ساعات ، من خلال الاستمرار في الجمع بين مجموعات من الأسماك الطازجة في جميع أنحاء الصباح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع تجويف واسع ، 5 1 / 4 "زجاج باستور ماصة مزودة مبة اللاتكس ، ونحن فرز الأجنة التي تم جمعها في 60 × 15 مم أطباق بتري ، ملأ جزئيا مع Medium2 الأجنة ، في مجموعات من 50 الأجنة ، وعلامة في الوقت التي يتم جمعها على غطاء كل طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السمك مرة واحدة بدأت زرع ، ونحن نستعد الطازجة حل حقن عن طريق المزج ما يلي في أنبوب microfuge على الجليد : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td></td></tr><tr><td> ينقول الأسهم البلازميد (125ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Transposase RNA الأسهم (175ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> الفينول الأسهم الحمراء (2 ٪ في H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المياه مجانا </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> وضعت الإبر الحقن في عقد الأطباق ويشغلها pipetting 500 قطرات من محلول الحقن NL على نطاق واسع في نهاية كل إبرة. بعد يوجه السائل إلى غيض من خلال العمل الشعري ، ويمكن أن تضاف إلى حل إضافية مجموعه 1،5-2 ميكرولتر. نحن نستعد اثنين على الاقل من الإبر لكل حل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحميل شغل الإبرة في ناحية عقد الإبرة حامل بيكو مضخة هوائية أو ما شابه ذلك حاقن الضغط ، وتكوين وتوصيلها إلى خزان N2 فقا لتعليمات الشركة الصانعة. نحن معايرة حقن كميات من خلال قياس قطرها من قطرات الزيت المعدني في طرد على شريحة ميكرون. عادة ، فإن الوقت حقن 120 مللي مع ضغط 20 رطل العائد قطرات من حوالي 1 NL ، ولكن هناك اختلافات طفيفة في إبرة قطرها سوف تؤثر هذه المعايير ، ويمكن إعادة تقويم المطلوبة بين الإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ عمليات الحقن تحت stereomicroscope في 6 - 10X التكبير. علينا استخدام زوج من غرامة ملقط لعقد الجنين في مكان ، ودفع الإبرة الحقن مع الضغط المستمر من خلال المشيماء والمح الى وجود الجنين في خلية واحدة أو المرحلة المبكرة من الخلايا اثنين. من الناحية المثالية ، ونحن موقف الطرف إبرة في صفار البيض فقط دون blastomeres. وطرد ما يقرب من 1 NL حل الحقن وسحب الإبرة. لكل بناء نحن حقن ≥ 200 الأجنة. بل هو أيضا مهم جدا ، بالنسبة لكل مخلب الأجنة التي تم جمعها ، لإنقاذ طبق من الأجنة uninjected السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من حقن نحن فرز الأجنة عن طريق إزالة بويضة غير مخصبة والأجنة التالفة ، والحقن الفاشلة (مع عدم وجود أجنة أحمر الفينول في blastomeres). نحن احتضان ثم الأجنة في المتوسط ​​28.5 في جنين درجة مئوية حتى الوقت المناسب للملاحظات. </li></ol> 3. تحليل أنماط التعبير الفسيفساء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة مناسبة ، ونحن فحص الأجنة لحقن مضان. توقيت يعتمد على نمط التعبير العادية من الجين الزرد الذاتية ، ولكن نحن ننظر عادة يومية من خلال أول 5 أيام الإخصاب آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندرس الأجنة لمضان على macroscope MVX10 أوليمبوس المجهزة لepifluorescence ، ولكن أي المجهر مماثلة قادرة على التصوير منخفضة الطاقة والعمل. إذا كان هناك عدد كبير من الأجنة التي وضعت بشكل غير طبيعي أو توفي في اليوم الأول ، أن ننظر في uninjected ضوابط لهذا مخلب لمعرفة إذا كانت تبدو طبيعية. إذا كانت الضوابط تبدو عادية ، والمشكلة الأكثر شيوعا هو نقاء كافية من الحمض النووي حقن. أيضا ، الأجنة في المراحل المبكرة حساسة لالمبلغ الإجمالي للبلازميد حقن ، ولذلك فمن الممكن أن تقدير غير دقيق وتم حقن الدنا كثيرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند فحص الأجنة ، أن نضع في اعتبارنا أن سيكونون جميعا في فسيفساء لبناء حقن. وسوف يكون من الضروري أن ننظر بعناية في كل من الأجنة ، وخاصة إذا كان من المتوقع المجال للتعبير صغير. نتذكر أيضا أن التعبير يمكن أن تكون دينامية ؛ مضان قوية يوم 1 قد يختفي بحلول يوم 2 ، والأجنة السلبية للتعبير عن أول 3 ايام قد تظهر شيئا في يوم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نختار بعض الأجنة مع التعبير أكثر اتساعا ، واستخدام هذه الوثيقة لنمط مضان بواسطة تصوير مجهري. بعد 5 أيام من الملاحظات ، ينبغي إرجاع الأجنة إلى المرفق ونشأ الأسهم. في عدة أشهر ، يمكن فرزهم من البالغين لإحالته germline من الجينات المحورة. </li></ol> 4. النتائج نرى الخامس واسعةariety أنماط ومستويات التعبير ، واعتمادا على العنصر محسن يجري تحليلها. نحن مهتمون عادة في أنماط التعبير الأنسجة جدا محددة ، وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. وغالبا ما يركزون على الجينات التي أعرب عنها في الهيكل العظمي. ويبين الشكل 2 أمثلة لأنماط التعبير الفسيفساء لاحظناه في الأجنة لدينا حقن ، مع القدرة على تنظيم التعبير في الغضاريف والعظام. أخيرا ، وجزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. لهؤلاء ، ونحن غالبا ما نرى مضان القليل جدا ، وربما بضع خلايا منتشرة في جنين. أقل في كثير من الأحيان ، قد نرى مضان ، ولكن فقط في موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم ، والبشرة والعضلات والهيكل العظمي (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. مثال على أنماط التعبير الغضاريف والعظام التي لوحظت في الأجنة المحقونة. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. هناك ارتباط كبير بين مكان قريب محسن لهذا الجين والتنظيم والتعبير. جزء كبير من تسلسل اختبار لا تنظم التعبير أنسجة معينة. هذه غالبا ما يكون مضان قليلا جدا ، أو قد يكون موقعين مشتركة للتعبير خارج الرحم : البشرة والعضلات والهيكل العظمي. (الأعلى) Brightfield صورة صورة GFP (القاع) مضان.

<ol><li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li>
<li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).</li>
</ol>

وقد برهنا على النهج المستخدمة في المختبر لدينا لتحليل كفاءة القدرة على احتمال استخدام transgenesis الزرد. في معظم الأحيان ، ونحن نستخدم هذا النهج للبحث عن الأنسجة الخاصة والقدرة على الجينات البشرية المرتبطة. على الرغم من عدم وجود تسلسل واضح تناظر معظم الوقت بين الإنسان والأسماك غير الترميز متواليات ، نجد أن هذا النهج هو عادة القدرة على النجاح في تحديد الجينات للاهتمام بالنسبة لنا. العوامل الحاسمة للنجاح هي العناية في التحضير للحمض النووي الريبي البلازميد وtransposase ، والحقن وفحص...

<table><tbody><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara Bio Inc</td><td>RR02M</td><td></td></tr><tr><td>طقم استنساخ pCR8/GW/TOPO TA</td><td>Invitrogen</td><td>K2500-20</td><td></td></tr><tr><td>مزيج إنزيم Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>خلايا مختصة بكفاءة المكتبة DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>12535-019</td><td></td></tr><tr><td>خلايا مختصة بكفاءة المكتبة DB3.1</td><td>Invitrogen</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>طقم mMESSAGE mMACHINE</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>طقم HiSpeed Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>طقم QIAquick لتنقية PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>مضخة PicoPump الهوائية</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr></tbody></table>

فسيفساء transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

وقد سلط الضوء على الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري ، مع أن الكثير من الأنواع الأخرى ، والتحدي المتمثل في وظيفة محددة يرجع إلى عدم تسلسل الترميز. وظيفة واحدة بارزة نفذتها الكسر غير الترميز من الجينوم هو تنظيم النسخ الجيني ، ولكن لا توجد وسائل فعالة للتنبؤ على نطاق واسع مقرون التنظيم عناصر من تسلسل الحمض النووي الرئيسي. قمنا بتطوير بروتوكول لتقييم كفاءة من الناحية الوظيفية المحتملة مقرون عناصر التنظيم من خلال transgenesis الزرد. نهجنا يقدم مزايا هامة على خلية ثقافة تقنيات استنادا للجينات هامة تنمويا ، نظرا لأنه يقدم معلومات عن تنظيم الجينات المكانية والزمانية. على العكس ، هو أسرع وأقل تكلفة من التجارب المماثلة في الفئران المعدلة وراثيا ، ونحن نطبق بشكل روتيني لمتواليات معزولة عن الجينوم البشري. هنا نظهر نهجنا في اختيار عناصر لاختبار القائمة على الحفاظ على تسلسل وبروتوكول لدينا تسلسل الاستنساخ وmicroinjecting لهم في الأجنة الزرد.

نظهر نهجنا لإيجاد العناصر المحتملة محسن من الجينات تنظم تنمويا وتقييمها من خلال وظيفتها transgenesis الزرد الفسيفساء.

فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

لقد سلط اكتمال تسلسل الجينوم البشري، إلى جانب تسلسلات العديد من الأنواع الأخرى، الضوء على التحدي المتمثل في عزو وظيفة محددة إلى غير...

مرحباً، أنا إريكا كجي من مختبر شانون فيشر في قسم بيولوجيا الخلية والتطور بجامعة بنسلفانيا. وأنا كريس ويبر، أيضاً من مختبر فيشر. وأنا شانون فيشر.سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل وظيفة عناصر المعزز (enhancer elements) باستخدام تقنية نقل الجينات في أسماك الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراسة التنظيم النسخي للجينات المهمة في التطور الهيكلي. لذا، لنبدأ.لتحديد التسلسلات غير المشفرة المحيطة بالجينات المرشحة، نستخدم خوارزمية fast cons، والتي يمكن الوصول إليها كمسار (track) في متصفح جينوم uc SC. نحن مهتمون بشكل أساسي بالجينات التي يتم التعبير عنها أثناء التطور الهيكلي، ولكن يمكن استخدام النهج ذاته لدراسة أي جينات يتم التعبير عنها في مرحلة التطور المبكر. في المثال الموضح هنا، قمنا بتحديد التسلسلات المحفوظة.في الفاصل الزمني المحيط بجين bumper البشري، نفحص الفاصل بالكامل وصولاً إلى الجينات المجاورة، ونحدد قيمة قطع منخفضة لدرجة السجل (log score) محددة الحجم تتوافق مع أعلى 5% تقريباً من التسلسلات غير المشفرة. بعد اختيار التسلسلات، يتم تصميم البادئات باستخدام برنامج primer three لتضخيم كل تسلسل من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الجينومي البشري، ويجب اختيار البادئات لتضخيم المنطقة المحفوظة بالإضافة إلى 30 زوجاً قاعدياً أو أكثر على كلا الجانبين. يتم تضخيم المنطقة المستهدفة باستخدام بوليميراز عالي الجودة مع DNA جينومي بشري، ثم تُستخدم إجراءات البيولوجيا الجزيئية المخبرية القياسية لاستنساخ المنتج المضخم في ناقل تعبير.الناقل المستخدم في هذا البروتوكول هو PG wc FOS GFPA gateway. ناقل الوجهة. بعد إنشاء الناقل، تم التوجيه بنقله.يتم أولاً نسخ الإنزيم اللازم لعملية الانتقال في المختبر باستخدام مجموعة M message M machine من شركة Ambion وبلازميد PGB 600 قبل عمليات الحقن التجريبية. ويتم اختبار فعالية كل دفعة من ناقلات الانتقال عن طريق الحقن مع مُعزز معروف مثل mouse socks. 10 enhancer.للتحضير لعمليات الحقن، يتم سحب الإبر المستخدمة في الحقن المجهري من أنابيب شعرية زجاجية بقطر خارجي 1.2 millimeter باستخدام جهاز سحب الماصات المجهرية Sutter P 97. استخدم برنامجاً ينتج طرفاً قوياً ذا استدقاق حاد لاختراق الغشاء الكوريوني السليم باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وشريحة ميكرومتر. يتم كسر الأطراف يدوياً تحت مجهر ستيريو حتى يصل القطر الخارجي إلى 15 micrometers تقريباً.يمكن تخزين الإبر لمدة يوم واحد في طبق حفظ مغطى. يتم الحفاظ على مجموعة أسماك الزيبرا في دورة ضوء وظلام منتظمة بواقع 14 ساعة من الضوء تحت الظروف القياسية في اليوم السابق لإجراء عمليات الحقن المجهري. يتم تحضير الأسماك لعمليات التزاوج الموقوتة في أحواض تربية صغيرة.ضع ثلاث إناث أو ذكرين في كل حوض في صفوف متوازية في صباح يوم الحقن المجهري بعد بدء الدورة الضوئية بفترة وجيزة. ادمج الذكور والإناث في مياه نظام نظيفة ومعالجة لإنتاج البيض. افحص الأسماك بشكل متكرر واجمع البيض خلال دقائق قليلة من الإنتاج للحصول على دفعات متزامنة جيداً.حافظ على عملية إنتاج البيض لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات عن طريق الاستمرار في تجميع مجموعات جديدة من الأسماك طوال الصباح باستخدام ماصة زجاجية واسعة الفتحة بمقاس 5.25 بوصة ومزودة بمضخة لاتكس. صنف الأجنة المجمعة في أطباق بيتري مقاس 60 × 15 مليمتر، ممتلئة جزئيًا بوسط نمو الأجنة، في مجموعات مكونة من 50 جنينًا. دون وقت التجميع على غطاء كل طبق.لكل مجموعة من الأجنة التي يتم جمعها، احتفظ بطبق يحتوي على 50 جنينًا كعينة ضابطة غير محقونة بين عمليات جمع البيض. قم بتحضير محاليل حقن طازجة عن طريق خلط المكونات التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) واحفظها على الثلج. ضع إبر الحقن في أطباق تثبيت واملأها من 1.5 إلى 2 µL من محلول الحقن.عن طريق سحب 500 nanoliter من القطرات ووضعها على الطرف العريض لكل إبرة. سيتم سحب السائل إلى الطرف المدبب من خلال الخاصية الشعرية. قم بتجهيز إبرتين على الأقل لكل محلول حقن.قم بتحميل الإبرة المملوءة في حامل الإبر اليدوي الخاص بمضخة بيكو نيوماتيكية (pneumatic pico pump) أو أي حاقن ضغط مماثل، على أن تكون المضخة مهيأة ومتصلة بخزان نيتروجين وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بمعايرة أحجام الحقن عن طريق قياس قطر القطيرات التي يتم طردها في زيت معدني على شريحة ميكرومترية، وعادةً ما يكون وقت الحقن 120 milliseconds.بضغط قدره 20 PS، سأقوم باستخراج قطيرة بحجم نانولتر واحد تقريباً باستخدام مجهر ستيريو بتكبير من 6 إلى 10 أضعاف. ثبت الجنين في مكانه باستخدام ملقط دقيق، وادفع إبرة الحقن بضغط ثابت عبر الكوريون وصولاً إلى مح yolk الجنين في مرحلة الخلية الواحدة أو مرحلة الخليتين المبكرة؛ ضع طرف الإبرة في الـ yolk أسفل الخلايا الأرومية (blastomeres) مباشرة، ثم أفرغ ما يقرب من 1 لتر من محلول الحقن واسحب الإبرة. بالنسبة لكل بنية (construct)، نقوم بحقن 200 جنين أو أكثر. بعد اكتمال عملية الحقن، يتم فرز الأجنة عن طريق إزالة البويضات غير المخصبة، والأجنة التالفة، وحالات الحقن الفاشلة، أو الأجنة التي لا تحتوي على الفينول الأحمر في الخلايا الأرومية.نقوم بعد ذلك بحضن الأجنة ووسط الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C حتى يحين الوقت المناسب لإجراء الملاحظات. وسنعرض لكم الآن بعض النتائج النموذجية لعناصر المعزز التي تنتج أنماطاً من تعبير GFP خاصة بأنسجة معينة في جنين سمكة الزيبرا. نحن ندرس الجينات التي يتم التعبير عنها في العظام أو الغضاريف خلال.إليك مثال على عنصر مُعزز يقع في الجزء العلوي (upstream) من جين acan، والذي ينظم التعبير الجيني في غضروف الوجه والجمجمة بعد ثلاثة أيام من الإخصاب. وهنا يوجد مُعزز آخر، هذه المرة من جين bumper، والذي ينظم التعبير الجيني في الخلايا العظمية. وفي اليوم الخامس، ومن بين العديد من المُعززات التي حددناها، نجد ارتباطًا ضئيلًا بين الموقع بالنسبة للجين وتنظيم التعبير الجيني.عند اختيار التسلسلات المراد اختبارها، من المهم تذكر أن المعزز يمكن أن يوجد على بعد مئات الكيلوبازات upstream أو downstream من الجين، أو في أحد الإنترونات كما هو ظاهر في هذا الجنين. لا يبدو أن جزءاً كبيراً من التسلسلات ينظم التعبير الجيني الخاص بالأنسجة؛ وغالباً ما تظهر هذه التسلسلات فلورة ضئيلة جداً، أو قد تظهر بعض الخلايا المتناثرة في موقعين شائعين للتعبير الجيني منتبذ، وهما البشرة والعضلات الهيكلية.لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحديد عناصر المعزز المحتملة من خلال الحفظ التسلسلي واختبار وظيفتها عبر التحول الجيني الموزاييكي (Mosaic transgenesis) في أسماك الزيبرا. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم فحص جودة الـ DNA والـ RNA المستخدمين في الحقن. كما يجب التأكد من فحص جميع الأجنة المحقونة بعناية، خاصة إذا كنتم تتوقعون ظهور التعبير الجيني في مجموعة صغيرة من الخلايا فقط.هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

القرار الزماني والمكاني من التلاعب الجيني الذي يحدد طائفة من الظواهر البيولوجية التي يمكن أن التشويش. هنا نستخدم زمنيا ومكانيا...

استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا قويا لعلم الأحياء التنموي وأبحاث الأمراض البشرية نظرا لتشابهها الجيني مع الفقاريات الأعلى. يصف هذا البروتوكول منهجية لإنشاء أجنة أحادية الصيغة الصبغية يمكن استخدامها لاستراتيجيات الفحص الأمامي لتحديد الطفرات المتنحية في الجينات الضرورية للتطور الجنيني المبكر.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

الهدف من هذه الدراسة هو توضيح كيف يمكن استخدام استراتيجية التحول الفسيفسائي في أسماك الزرد لتقييم المساهمات النسبية للجينات المسرطنة المتعددة بسرعة وكفاءة في بدء الورم وتطوره في الجسم الحي.

فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض

هنا نوضح سير العمل لاستخدام نظام TetON لتحقيق التعبير الجيني الخاص بالأنسجة في زعنفة ذيل الزرد المتجددة للبالغين.

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

يعرض هذا العمل الجديد في نموذج الجسم الحي من إصابة الكلى القطعي باستخدام الكلى غفب المعدلة وراثيا الزرد. نموذج يسمح لتحريض الاجتثاث المستهدفة من الخلايا الظهارية الكلى لإظهار الآليات الخلوية للإصابة نيفرون وإصلاح.

دقة الخلوية طريقة الاجتثاث لنمذجة إصابة الكلى الحادة في تطوير الزرد

تقدم هذه الورقة طريقة تطوير وتوصيف وتتبع في الوقت الفعلي ورم خبيث في نموذج الزرد من الورم الأرومي العصبي ، وتحديدا في خط الزرد المعدل وراثيا مع الإفراط في التعبير عن MYCN و LMO1 ، والذي يتطور ورم خبيث تلقائيا.

نموذج الزرد من ورم أرومي عصبي

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

تعلم تقنية التحويل الوراثي الفسيفسائي في أسماك الزرد لتحليل عناصر المحسّن المرتبطة بتنظيم النسخ الجيني. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم تنمية الهيكل العظمي.

فسيفساء Transgenesis اسماك الزرد لتقييم متواليات محسن

استكشف المزيد من الفيديوهات