الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

في هذا الإجراء ، يتم تصوير ديناميكيات التعبير الجيني في الأنسجة النباتية بمرور الوقت باستخدام الروبوتات ، ويتم تعقيم بذور الفاصوليا الأولى ووضعها بين المناشف الورقية المبللة في حاوية زراعة الأنسجة للإنبات. بعد أربعة أيام ، تتم إزالة العملة وقصفها ببنية الحمض النووي التي تحتوي على محفز مدمج في GFP يتم تثبيت Coan الموضوعة في أطباق Petri على نظام جمع صور روبوتات ثنائي الأبعاد مصمم خصيصا. تمت برمجة الروبوت لالتقاط صور لكل قطعة من الأنسجة كل ساعة لمدة 100 ساعة.

تخضع الصور لتحليل الصور ، والبيانات الكمية المسجلة حول شدة تعبير GFP بمرور الوقت. مرحبا ، أنا جون فاينر ، مدير مختبر تحويل النبات في قسم البستنة وعلوم المحاصيل في جامعة ولاية أوهايو. أنا كارلوس هيرانديز جارسيا ، طالب دكتوراه في المختبر النهائي في جامعة ولاية أوهايو.

سيوضح لك كارلوس اليوم البروتوكول الذي طورناه لتحليل التعبير الجيني والأنسجة النباتية باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر. نستخدم هذا الإجراء الذي طورناه في المختبر لقياس إجهاد نشاط OD. للقيام بذلك ، قم بمروجنا الأول في المنبع لجين GFP ، وهو جينات مراسلنا.

سأوضح لك كيف نقدم عنصر التحكم في المروج في Lima vein Cataly ونرسل تطبيقا على نظام التقاط الصور الآلي المخصص الخاص بنا. سأنهي بمراجعة بروتوكولنا لتحليل الصور. لذلك دعونا نذهب لبدء هذا الإجراء ، سطح بذور الفاصوليا المعقمة باستخدام الإجراءات القياسية.

ضع البذور المعقمة في سبع حاويات أرجوانية GA بين طبقات من المناشف الرطبة والورقية واحتضنها لمدة أربعة أيام عند 25 درجة مئوية. هنا نستخدم متجه تعبير رقم النسخ العالي ، وهو مفيد لتحليلات عناصر المروج والمروج. يحتوي هذا المتجه على جين GFP ، والذي يستخدم لتصور وظيفة عنصر المحفز أو المحفز في الأنسجة المحولة قبل حوالي ساعة إلى ساعتين من القصف.

Excise lima bean CU leadin من معاطف البذور. يجب أن يكون الرصاص CU المناسب للقصف أصفر إلى أخضر فاتح مسطح وخاليا من أي ضرر قد يتداخل مع مزيد من تحليل الصورة مباشرة بعد الاستئصال ، ووضع 12 cu من الرصاصين في طبق بتري مع وسط ثقافة OMS يحتوي على أملاح MS ب خمسة فيتامينات و 3٪ سكروز و 0.2٪ معدل هلام عند درجة الحموضة 5.7. بعد ذلك ، قم بترسيب بنية الحمض النووي على جزيئات التنغستن M 10 أولا ، قبل الاستخدام مباشرة ، قم بإعادة تعليق الجسيمات في الماء المعقم إلى تركيز 100 ملليغرام لكل مليلتر.

ثم في أنبوب fuge سعة 0.6 مل ، أضف 25 ميكرولتر من الجسيمات ، وخمسة ميكرولترات من الحمض النووي عند ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر ، و 25 ميكرولترا من 2.5 كلوريد الكالسيوم المولي و 10 ميكرولتر من 100 مللي مولار من المنوية. احتضان مستحضر الحمض النووي على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم قم بإزالة وتخلص من 50 ميكرولترا من المحلول فوق الجسيمات. أعد تعليق الجسيمات المطلية بالحمض النووي والتي تبقى في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الدوامة.

وبعد الدوامة مباشرة ، قم بإزالة Eloqua سعة ميكرولترين. كرر هذه الخطوة الدوامة. في كل مرة تتم فيها إزالة Eloqua ، يجب حفظ الجزيئات المطلية على الجليد واستخدامها في غضون 15 دقيقة.

الآن بعد أن تم طلاء الحمض النووي على الجسيمات ، ضع ميكرولترين من الجسيمات من خلال الجزء العلوي من مرشح الحقنة في منتصف شاشة المرشح. ثم ضع مرشح المحقنة في وحدة تثبيت المرشح داخل مسدس تدفق الجسيمات أو غرفة PIG. ضع حبة ليما ، جنبا إلى جنب المحوري لأعلى ، والذي يتكون من شاشة مذابة في قاع الدورق .

ضع الحاجز ، الذي يستخدم كمنصة لدعم الأنسجة أثناء القصف في غرفة مسدس الجسيمات. لقصف الأنسجة ، افتح أولا الصمام المؤدي إلى الفراغ لإخلاء الغرفة. عندما يصل الفراغ إلى 760 ملم من الزئبق ، قم بتنشيط الملف اللولبي وإطلاق الهيليوم لدفع الجسيمات.

ضغط الهيليوم المستخدم لتسريع الجسيمات هو 50 إلى 60 رطل لكل بوصة مربعة. بعد قصف الجسيمات ، أغلق صمام خط التفريغ وحرر الفراغ باستخدام صمام العادم. عندما يتم تحرير الفراغ ، افتح باب الغرفة لاستعادة الرصاص المشترك الذي تم قصفه وإعادة الرصاص المشترك إلى جانب dal.

ما يصل إلى وسيط ثقافة OMS للقياس الكمي والتنميط التعبيري. قصف ما لا يقل عن ثلاثة رصاص مشترك لكل بنية الحمض النووي. يتم أيضا تضمين عنصر تحكم إيجابي ، والذي يعطي ملف تعريف التعبير الجيني المدروس جيدا.

الرائد المشترك جاهز الآن للتصوير. قم بتشغيل مصباح الزئبق وانتظر لمدة 30 دقيقة حتى يسخن المصباح. قم بتشغيل مصادر الطاقة لكاميرا SPOT R-T-C-C-D ووحدة التحكم في المحرك ، التي تقود حركة منصة الروبوتات المصممة خصيصا ، والتي تحتوي على ثماني لوحات.

اضبط مجموعة المرشحات للكشف عن GFP عن طريق تحديد مجموعة مرشح GFP الثانية عند إثارة 480 نانومتر وانبعاث 510 نانومتر على مجهر تشريح MZ L ثلاثي. بعد ذلك ، قم بتعقيم أغطية أطباق بتري السميكة المصنوعة من البولي كربونات عن طريق الرش بنسبة 70٪ من الإيثانول. الأغطية المتخصصة المستخدمة لتغطية قاعدة طبق بتري ، تمنع التكثيف أثناء جمع الصور.

ضع الألواح التي تحتوي على كوان مقصف على منصة الروبوتات وشد برغي التثبيت الجانبي لربطها في موضعها. افتح الآن تطبيق البرنامج المخصص الذي يتحكم في كل من منصة الروبوتات والحصول على الصور. افتح أيضا مفتاح التحكم في الضوء الأبيض للبرنامج باستخدام البرنامج ، وقم بتوجيه المنصة إلى موضع المنزل.

يتم ذلك قبل الدخول في المراكز. لكل رصاص في علامة تبويب المحرك ، حدد اللوحة الأولى. ستضع المنصة مركز طبق بتري تحت هدف المجهر.

باستخدام أزرار المسافة المتحركة ، ضع بدقة أول CU LEADIN لجمع الصور. باستخدام ميزة الوضع المباشر ، انقل رصاص الحضن إلى منطقة العرض المناسبة بالنسبة إلى أول رصاص للعناق ، استخدم المقابض اليدوية على مجهر التشريح لضبط التركيز وضبط التكبير على 1.6 x. بمجرد تعيين منطقة الاهتمام، انقر فوق الزر إضافة هذا الموضع.

سيضيف البرنامج إحداثيات هذه المنطقة إلى ملف جدول الموضع وستعود المنصة إلى مركز مواضع مجموعة اللوحة لجميع اللوحات المتبقية على اللوحات. باستخدام أزرار المسافة المتحركة ، استخدم مسامير التسوية اليدوية الثلاثة الموجودة أسفل كل لوحة على منصة الروبوتات لضبط التركيز على القطعة المتبقية على نفس اللوحة. بعد إدخال جميع إحداثيات كل coan ، احفظ إحداثيات جدول الموضع.

أدخل معلمات مجموعة الصور مثل نوع الضوء ، وهو اللون الأزرق لإعداد GFP والتعريض الضوئي ، بالإضافة إلى تحديد مكان تخزين الصور كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المصاحب. انتقل إلى علامة التبويب التحكم في وقت الالتقاط وقم بتعيين الفاصل الزمني للحصول على الصور والعدد الإجمالي لدورات جمع الصور. عادة ما يتم جمع الصور كل ساعة لمدة 100 ساعة.

إنشاء ملفات تعريف تعبير جيني محددة جيدا. ابدأ الحصول على الصور عن طريق فتح علامة تبويب جدول المراكز ثم النقر فوق زر جدول التشغيل. عزل نظام جمع الصور عن الضوء الدخيل في نهاية مجموعة الصور لمدة 100 ساعة.

الصور عالية الدقة التي يبلغ عدد كل منها حوالي خمسة ميغابايت جاهزة لتحليل الصور. استخدم الصورة الجاهزة لتجميع 100 صورة متسلسلة من كل مجلد. قم باستيراد جميع الصور المتسلسلة كإطارات وقم بتغيير حجمها إلى 800 × 600 بكسل لتسريع معالجة الصور.

بعد ذلك، استخدم العلامات على طبقة جديدة تم تقديمها، والتي تكون مرئية في جميع الإطارات وباستخدام نقاط GFP المحددة في مرجع الصورة. قم بمحاذاة كل صورة يدويا عند اكتمال المحاذاة، واحذف الطبقة المستخدمة كمرجع واحفظ الملف كملف PSD واحد. أيضا ، قم بتصدير جميع الإطارات كملف MOV واحد باستخدام أعلى دقة.

الملفات جاهزة الآن لبدء القياس الكمي ل GFP. استخدم الصورة J لفتح ملف MOV واقتصاص مساحة 400 × 300 بكسل. ثم افصل الصور المتسلسلة إلى قنوات حمراء وزرقاء وخضراء باستخدام أداة تقسيم RGB للقنوات الحمراء والخضراء.

اطرح مضان الخلفية باستخدام طرح عائد الاستثمار المقاس لكل أداة مكون إضافي للشريحة. احسب تعبير GFP عن طريق ضبط مستويات العتبة واستخدام مكون إضافي مصمم لقياس متوسط قيمة المقياس الرمادي لكل بكسل والعدد الإجمالي لوحدات البكسل التي تعبر عن GFP. انسخ قيم الإخراج في الصورة J.أخيرا الصق قيم الإخراج للقنوات الخضراء والحمراء في Microsoft Office.

Excel لمزيد من معالجة البيانات لإعطائك فكرة عن نتائج محاذاة الصور. تظهر هذه الرسوم المتحركة الأولى عدم دقة إعادة تموضع منصة الروبوتات خلال تجربة 100 ساعة. الحركة الموضعية هي قطعة أثرية ناتجة عن عدم قدرة منصة الروبوتات على العودة إلى نفس الموضع بالضبط في كل نقطة زمنية بعد محاذاة الصورة يدويا ، ويمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن GFP بسهولة ويمكن تصور الميزات الفريدة لنظام التتبع هذا بسهولة.

كما تكرر هذه الرسوم المتحركة ملاحظة ، فإن GFP التي تعبر عن الخلايا المحاطة بدائرة ، تظهر الخلية المحاطة بدائرة باللون الأحمر انخفاضا سريعا جدا في التعبير في غضون 18 إلى 20 ساعة بعد القصف بينما تظهر الخلية المحاطة بدائرة باللون الأبيض بداية متأخرة لتعبير GFP. بصرف النظر عن الرسوم المتحركة ، يسمح هذا الإجراء بالقياس الكمي السريع لتعبير GFP بمرور الوقت في الأنسجة المستهدفة للحبوب الليما. تظهر هذه النتائج التمثيلية القياس الكمي المقارن لكثافة المحفز باستخدام محفز CAMV 35 S وأربعة محفزات مختلفة لفول الصويا.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إدخال الحمض النووي في الكاتالين للإنبات. تضع بذور الوريد في ليما الكاتالين على الروبوت ، وتجمع الصور لتحليل الصور وتحلل تلك الصور. نستخدم هذا الإجراء بشكل روتيني في مختبرنا للتحقق من صحة محفزات النباتات المستنسخة.

يمكن للمرء إنشاء كمية كبيرة من البيانات من إدخال مروج مصنع مختلف. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء معقد مع العديد من الخطوات التي يمكن أن تسوء عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم البدء ببذور الفاصوليا الطازجة أو على الأقل استخدام بذور عالية الجودة تم تخزينها بشكل صحيح. من المهم أيضا الحصول على غطاء قصف القصف وإعداده على الروبوت بسرعة واستخدام غطاء طبق الأليفة السميك لتقليل مشاكل التكثيف.

وأخيرا ، يرجى ملاحظة أن GFP الذي نستخدمه هو إصدار آخر يسمى SGFP ، مختبر HIN Gen الأمامي في جامعة هارفارد. هذا GFP ليس مستقرا للغاية وقد يكون أفضل لتتبع التغيرات السريعة في التعبير الجيني. وهذا هو ذلك لمشاهدتنا.

ونتمنى لك السعادة في تجاربك.