الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

في هذا الإجراء، يتم تصوير ديناميكيات التعبير الجيني في أنسجة النبات بمرور الوقت باستخدام الروبوتات؛ حيث يتم أولاً تعقيم بذور الفاصوليا ووضعها بين مناشف ورقية مبللة في وعاء زراعة أنسجة لغرض الإنبات. وبعد أربعة أيام، يتم إزالة السويقات وقصفها ببنية DNA تحتوي على محفز مدمج مع GFP. ثم توضع السويقات في أطباق بتري وتثبت على نظام روبوتي مخصص لجمع الصور ثنائي الأبعاد. وقد تمت برمجة الروبوت لالتقاط صور لكل قطعة نسيج كل ساعة لمدة 100 ساعة.

تخضع الصور لتحليل الصور، مما يوفر بيانات كمية عن كثافة تعبير GFP بمرور الوقت. مرحباً، أنا جون فاينر، مدير مختبر التحول النباتي في قسم البستنة وعلوم المحاصيل بجامعة ولاية أوهايو. وأنا كارلوس هيرنانديز غارسيا، طالب دكتوراه في المختبر النهائي بجامعة ولاية أوهايو.

سيعرض لكم كارلوس اليوم البروتوكول الذي طورناه لتحليل التعبير الجيني في أنسجة النبات باستخدام البروتين الفلوري الأخضر. نحن نستخدم هذا الإجراء الذي طورناه في المختبر لقياس نشاط سلالة OD. وللقيام بذلك، قمنا بدمج هذا المحفز في منطقة تسبق جين GFP، والذي يمثل الجين المراسل لدينا.

سأوضح لكم كيفية إدخال التحكم في المحفز إلى عروق فاصوليا ليما وإرسال تطبيق على نظامنا المخصص لالتقاط الصور الروبوتي. وسأختتم بمراجعة البروتوكول الخاص بنا لتحليل الصور. لذا، لنبدأ هذا الإجراء بتعقيم سطح بذور فاصوليا ليما باستخدام الإجراءات القياسية.

ضع البذور المعقمة في أوعية magenta GA سبعة بين طبقات من المناشف الورقية المبللة، ثم قم بحضنها لمدة أربعة أيام عند 25 درجة مئوية. نستخدم هنا ناقل تعبير ذو عدد نسخ مرتفع، وهو مفيد لتحليلات المحفز وعناصر المحفز. يحتوي هذا الناقل على جين GFP، الذي يُستخدم لتصور وظيفة المحفز أو عنصر المحفز في الأنسجة المحولة قبل ساعة إلى ساعتين من عملية القصف.

استأصل أجنة بذور الفاصوليا العريضة (lima bean CU leadin) من غلاف البذور. يجب أن تكون أجنة CU leadin المناسبة للقذف الجزيئي صفراء إلى خضراء فاتحة، ومسطحة، وخالية من أي تلف قد يتداخل مع تحليل الصور اللاحق. فور الاستئصال، ضع 12 جنينًا من CU leadin في طبق بتري يحتوي على وسط زراعة OMS المكون من أملاح MS، وخمسة فيتامينات، و3% sucrose، و0.2% gel rate عند pH 5.7. بعد ذلك، قم بترسيب بنية DNA على جسيمات التنجستن M 10. أولاً، وقبل الاستخدام مباشرة، أعد تعليق الجسيمات في ماء معقم لتصل إلى تركيز 100 milligrams per milliliter.

بعد ذلك، في أنبوب طرد مركزي سعة 0.6 ملليلتر، أضف 25 µL من الجسيمات، و5 µL من DNA بتركيز 1 µg/µL، و25 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 2.5 M، و10 µL من spermine بتركيز 100 mM. قم بحضن تحضيرة DNA على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم قم بإزالة والتخلص من 50 µL من المحلول الموجود فوق الجسيمات. أعد تعليق الجسيمات المغلفة بـ DNA المتبقية في قاع الأنبوب عن طريق الرج الدوامي (vortexing).

ومباشرة بعد عملية الرج باستخدام جهاز الفورتكس، اسحب مقدار 2 µL من Eloqua. كرر خطوة الرج هذه. وفي كل مرة يتم فيها سحب Eloqua، يجب الاحتفاظ بالجسيمات المغلفة على الثلج واستخدامها في غضون 15 دقيقة.

بعد تغليف الجزيئات بالـ DNA، ضع 2 µL من الجزيئات عبر الجزء العلوي من مرشح سرنجة في منتصف شاشة الترشيح. ثم ضع مرشح السرنجة في وحدة تثبيت المرشح داخل غرفة تدفق الجزيئات أو غرفة PIG. ضع حبيبة فاصوليا ليمية على حاجز يتكون من شاشة مصهورة في قاع كأساً زجاجياً، بحيث يكون الجانب المحوري للأعلى.

ضع الحاجز، الذي يُستخدم كمنصة لدعم الأنسجة أثناء القصف في غرفة مسدس الجزيئات. ولقصف النسيج، افتح أولاً الصمام المؤدي إلى المفرغة لتفريغ الغرفة. وعندما يصل الفراغ إلى 760 millimeters of mercury، قم بتنشيط الملف اللولبي وتحرير الهيليوم لدفع الجزيئات.

يبلغ ضغط الهيليوم المستخدم لتسريع الجسيمات من 50 إلى 60 PSI. بعد قصف الجسيمات، أغلق صمام خط التفريغ وقم بتحرير التفريغ باستخدام صمام العادم. عند تحرير التفريغ، افتح باب الغرفة لاستعادة co leadin المقصف وإعادة co leadin إلى الجانب dal.

يتم النقل إلى وسط استنبات OMS لغرض التكميم وتحديد ملف التعبير الجيني. يتم قصف ما لا يقل عن ثلاث عينات لكل بنية DNA. كما يتم إدراج ضابط موجب يعطي ملف تعبير جيني مدروس جيداً.

أصبحت الشرائح الجانبية الآن جاهزة للتصوير. قم بتشغيل مصباح الزئبق وانتظر لمدة 30 دقيقة حتى يسخن المصباح. قم بتشغيل مصادر الطاقة لكاميرا SPOT R-T-C-C-D ووحدة التحكم في المحرك، التي تدير حركة منصة الروبوتات المصممة خصيصاً، والتي تتسع لثماني ألواح.

اضبط مجموعة المرشحات للكشف عن GFP من خلال اختيار مجموعة المرشحات GFP two عند طول موجي للإثارة يبلغ 480 نانومتر وطول موجي للانبعاث يبلغ 510 نانومتر على مجهر تشريحي MZ L three. بعد ذلك، قم بتعقيم أغطية أطباق بتري المصنوعة من البوليكربونات السميكة عن طريق الرش بـ 70%ethanol. وتعمل هذه الأغطية المتخصصة المستخدمة لتغطية قاعدة طبق بتري على منع التكثف أثناء عملية جمع الصور.

ضع الأطباق التي تحتوي على cuan المقصف على المنصة الروبوتية وأحكم ربط برغي التثبيت الجانبي لتثبيتها في مكانها. الآن، افتح تطبيق البرنامج المخصص الذي يتحكم في كل من المنصة الروبوتية وعملية الحصول على الصور. قم أيضاً بفتح مفتاح التحكم في الضوء الأبيض عبر البرنامج، ثم وجه المنصة إلى وضع السكون (home position).

يتم تنفيذ هذه الخطوة قبل تحديد المواضع. لكل دليل توجيه (coddle leadin) في علامة تبويب المحرك (motor tab)، اختر اللوحة الأولى. ستقوم المنصة بوضع مركز طبق بتري تحت عدسة المجهر.

باستخدام أزرار مسافة التحريك، قم بتحديد موضع CU LEADIN الأول بدقة لجمع الصور. وباستخدام ميزة الوضع المباشر، حرك cuddle leaden إلى منطقة العرض المناسبة. وبالنسبة لـ cuddle leaden الأول، استخدم المقابض اليدوية في المجهر التشريحي لضبط التركيز وتعيين التكبير على 1.6 x. وبمجرد تحديد المنطقة المطلوبة، انقر فوق زر إضافة هذا الموضع.

سيقوم البرنامج بإضافة إحداثيات هذه المنطقة إلى ملف جدول المواقع، وستعود المنصة إلى مركز مواضع الطبق المحددة لجميع الـ coens المتبقية على الأطباق. باستخدام أزرار مسافة التحريك، استخدم براغي التسوية اليدوية الثلاثة الموجودة أسفل كل طبق على منصة الروبوتات لضبط التركيز للـ coan المتبقية على نفس الطبق. بعد إدخال جميع إحداثيات جميع الـ coan، قم بحفظ إحداثيات جدول المواقع.

أدخل معاملات مجموعة الصور مثل نوع الضوء، والذي يكون باللون الأزرق لبروتين GFP، وإعداد التعريض الضوئي، بالإضافة إلى تحديد مكان تخزين الصور كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. انتقل إلى علامة تبويب التحكم في وقت الالتقاط وقم بتعيين الفاصل الزمني لاكتساب الصور وإجمالي عدد دورات جمع الصور. وعادة ما يتم جمع الصور كل ساعة لمدة 100 ساعة.

إنشاء ملفات تعريف محددة بدقة للتعبير الجيني. ابدأ عملية الحصول على الصور بفتح علامة تبويب جدول الموضع ثم النقر على زر تشغيل الجدول. اعزل نظام جمع الصور عن الضوء الخارجي عند نهاية عملية جمع الصور التي تستغرق 100 hour.

الصور عالية الدقة، والتي تبلغ سعة كل منها حوالي خمسة ميجابايت، جاهزة الآن للتحليل الصوري. استخدم برنامج image ready لتجميع 100 صورة متسلسلة من كل مجلد. قم باستيراد جميع الصور المتسلسلة كإطارات (frames)، وقم بتغيير حجمها إلى 800 × 600 بكسل لتسريع عملية معالجة الصور.

بعد ذلك، استخدم علامات على طبقة جديدة مُدخلة، تكون مرئية في جميع الإطارات وباستخدام بقع GFP المختارة في المرجع الصوري. قم بمحاذاة كل صورة يدويًا، وعند اكتمال المحاذاة، احذف الطبقة المستخدمة كمرجع واحفظ الملف كملف PSD واحد. قم أيضًا بتصدير جميع الإطارات كملف MOV واحد باستخدام أعلى دقة.

أصبحت الملفات الآن جاهزة لبدء تقدير كمية GFP. استخدم برنامج Image J لفتح ملف MOV وقص منطقة بمساحة 400 في 300 بكسل. بعد ذلك، قم بفصل الصور المتتالية إلى قنوات حمراء وزرقاء وخضراء باستخدام أداة RGB split للقناتين الحمراء والخضراء.

اطرح فلورة الخلفية باستخدام أداة المكون الإضافي "subtract measured ROI" لكل شريحة. احسب تعبير GFP من خلال ضبط مستويات العتبة واستخدام مكون إضافي مصمم لقياس متوسط قيمة التدرج الرمادي لكل بكسل والعدد الإجمالي للبكسلات التي تعبر عن GFP. انسخ القيم الناتجة في ImageJ، ثم الصق القيم الناتجة للقناتين الخضراء والحمراء في Microsoft Office.

استخدم برنامج Excel لمزيد من معالجة البيانات لمنحك تصوراً عن نتائج محاذاة الصور. يوضح هذا الرسوم المتحركة الأول عدم دقة إعادة تموضع المنصة الروبوتية خلال التجربة التي استمرت 100 ساعة. وتعد حركة البقعة نتيجة ثانوية ناتجة عن عدم قدرة المنصة الروبوتية على العودة إلى الموضع نفسه تماماً عند كل نقطة زمنية بعد محاذاة الصور يدوياً، ويمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن GFP بسهولة، كما يمكن تصور الميزات الفريدة لنظام التتبع هذا بوضوح.

أثناء تكرار هذا الرسوم المتحركة، يرجى ملاحظة الخلايا التي تعبر عن GFP والمحاطة بدوائر؛ حيث تُظهر الخلية المحاطة بدائرة حمراء انخفاضاً سريعاً جداً في التعبير في الفترة من 18 إلى 20 ساعة بعد القصف، بينما تُظهر الخلية المحاطة بدائرة بيضاء بداية متأخرة في التعبير عن GFP. وبالإضافة إلى الرسوم المتحركة، تسمح هذه العملية بالتقدير الكمي السريع للتعبير عن GFP بمرور الوقت في النسيج المستهدف لفاصوليا ليما. وتُظهر هذه النتائج التمثيلية التقدير الكمي المقارن لشدة المحفز باستخدام محفز CAMV 35 S وأربعة محفزات مختلفة من الصويا.

لقد أظهرنا لكم للتو كيفية إدخال DNA في كتلين البراعم. يتم وضع بذور Lima vein على الكتلين، ثم يتم جمع الصور لتحليلها ومن ثم تحليل تلك الصور. نحن نستخدم هذا الإجراء بشكل روتيني في مختبرنا للتحقق من صحة محفزات النباتات المستنسخة.

يمكن توليد كمية كبيرة من البيانات من خلال إدخال محفزات نباتية مختلفة. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء معقد ويتضمن خطوات عديدة قد تحدث بها أخطاء؛ لذا من المهم عند القيام بهذا الإجراء البدء ببذور فاصوليا خطية طازجة أو على الأقل استخدام بذور عالية الجودة تم تخزينها بشكل صحيح. ومن المهم أيضاً الحصول على غطاء طبق بتري المقطوع المخصص للقصف وإعداده على الروبوت بسرعة، واستخدام غطاء طبق بتري سميك لتقليل مشاكل التكثيف.

وأخيرًا، يرجى ملاحظة أن بروتين GFP الذي نستخدمه هو إصدار آخر يسمى SGFP، من مختبر Gen HIN في جامعة هارفارد. هذا البروتين GFP ليس مستقرًا للغاية وقد يكون أفضل لتتبع التغيرات السريعة في التعبير الجيني. وهذا كل شيء، شكرًا لمتابعتكم لنا.

مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.