الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

مرحبا ، اسمي تانيا ويج وأنا طالبة دكتوراه وأعمل في مختبر مناعة الأورام ومناعة الزرع في مستشفى جامعة كولونيا. تركز دراساتي بشكل أساسي على الخلايا البائية المنشطة بقرص مضغوط 40 البحرية وقدرتها على تحفيز الاستجابات المناعية في الجسم الحي. في الأصل ، تم إنشاء خلايا CD 40 B البشرية كخلايا بديلة تقدم مستضد للخلايا المتغصنة.

تهدف هذه الخلايا إلى استخدامها لأغراض العلاج المناعي في البيئات السريرية ، يتم إنشاء خلايا CD 40 B تحت إشارات CD 40 والتحفيز باستخدام IL أربعة. وفقا لهذا النظام ، يمكن توسيعها على مدى عدة أسابيع. بعد تحسين توليد خلايا CD 40 B البشرية من PBMC في مختبرنا ، قمنا بنقل هذا المبدأ بنجاح إلى الفئران وهذا ما أريد أن أريكم اليوم.

بدءا من الطحال ، نقوم بتوليد خلايا بائية منشطة CD 40 في غضون 14 يوما من زراعة الخلايا. الخطوات الرئيسية هي تحضير الخلايا المغذية ، لذلك نستخدم خط الخلية المنقلة CD 40 ، وهو ملتصق ويصبح مشعا ب 78 رماديا ومطليا على ستة ألواح آبار. ثانيا ، نبدأ زراعة CD 40 DB البحرية باستخدام خلايا SPOC المنقاة حديثا من ستة فئران سوداء ، والتي تتم معالجتها بالإنترلوكين البحري أربعة بيتا ماكاب إلى الإيثانول والسيكلوسبورين A. ثم يتم نقل هذه الخلايا على خلايا الفيتا المشعة على ستة ألواح آبار.

يتكرر هذا الإجراء كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى اليوم 14 من زراعة الخلايا. لننتهي بخلايا بائية منشطة بحرية عالية النقاء CD 40 ، نبدأ في توليد الخلايا البائية المنشطة CD 40 البحرية باستخدام خلايا SP المنقاة حديثا تخثر الفئران LXi. أولا نقوم بغسل الخلايا SP عن طريق تعليق الخلايا في 50 مليلتر من وسط الغسيل البحري CD 40 B.

ثم قم بتدوير الخلايا لمدة سبع دقائق بسرعة 1300 دورة في الدقيقة المقابلة 260 5G لتحديد عدد الخلايا. قم بإعادة تعليق الخلايا تماما في 10 ملليلتر من وسط الغسيل البحري CD 40 B ، وأخيرا امزج الخلايا عن طريق الدوامة. ثم حدد عدد الخلايا.

قم بتدوير الكمية المطلوبة من الخلايا لمدة سبع دقائق عند 1300 دورة في الدقيقة المقابلة 260 5G باستخدام لوحة بستة آبار. تحتاج خمسة في 10 إلى الخلايا الست لكل بئر ، وبالتالي 30 في 10 إلى الخلايا الست لكل مورد لوحة. أنفق الكمية المطلوبة في نقطة واحدة 25 في 10 من الخلايا الست لكل مليلتر في وسائط استزراع CD 40 B البحرية.

ثم استكمل حديثا تعليق الخلية ب IL البحرية أربعة بتركيز وحدة واحدة لكل مليلتر لتحفيز السيكلوسبورين A بتركيز oh 0.63 ميكروغرام لكل مليلتر لمنع نمو الخلايا التائية و 100 ميكرومولار Beamer CAPTA الإيثانول. الآن معلق الخلية جاهز للتحفيز بخلايا الفير. نحن نستخدم خلايا المعالج المنقولة بتقنية CD 40 البحرية لتحفيز تمايز بقاء الخلية وتكاثرها حيث يمكن لخط الخلية الثقيل البقاء على قيد الحياة في الثقافة لعدة أشهر.

استبعاد فقدان تعبير الساق البحرية CD 40 بواسطة الثعلب بانتظام. CD 40 Ligand transfected healer عبارة عن خط خلية الالتصاق المزروع عند 37 درجة مع 5٪ CO2 في وسط الاختيار مع الجليد B بتركيز O 0.2 ملليغرام لكل مليلتر. للاختيار ، يجب ألا يصبح خط الخلايا الظهارية الملتصق هذا متشاققا تماما ويجب تقسيمه مرتين في الأسبوع لتقسيم الخلايا الملتصقة.

استنشق الغسيل المتوسط مرة واحدة باستخدام 10 ملليلتر من PBS. قم بالتدوير برفق وإضافة أربعة ملليلتر من التربسين EDTA في رقائق 75 سم مربع. احتضن القارورة لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة في الحاضنة.

أخرج القارورة مرة أخرى. استخدم نقرا لطيفا لفصل الخلايا عن البلاستيك. ثم أضف 10 ملليلتر من وسط النمط الحيوي ، وقم بتدويرها برفق ونقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

قم بتدوير الخلايا المغذية لمدة سبع دقائق عند 1300 دورة في الدقيقة المقابلة 260 5G. أعد تعليق الخلايا المحببة بعناية في 10 ملليلتر من الوسط البري لتحديد عدد الخلايا لثقافة فرعية أنفق RESO 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الست في وسط اختيار 10 مليلتر ونقلها إلى قارورة 75 سنتيمترا مربعا واحتضان الخلايا المغذية عند 37 درجة في 5٪ CO2 لتحفيز CD 40. خذ بقية الخلايا القاتلة وقاتلة ، وقم بإشعاعها بدرجة 78 لمنعها من التكاثر.

قم بتخفيف الخلايا المغذية في وسط من النوع البري بكثافة خلية O 0.2 في 10 إلى الخلايا الست لكل لتر ولوحة ملليلترين لكل بئر على صفيحة من ستة آبار. دع الخلايا تصبح ملتصقة مرة أخرى قبل استخدامها كخلايا محفزة عن طريق احتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة و 5٪ CO2 لتحفيز الخلايا مع ترابط قريب من CD 40. تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا المغذية المطلية قبل يوم واحد ملتصقة.

إذا كانت الخلايا المغذية ملتصقة ، فقم بإزالة SUP natin بعناية من كل بئر ثم انقل برفق أربعة ملليلتر من التعليق الجانبي SPOC ، والذي تم تعديله إلى نقطة واحدة 25 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر قبل فترة وجيزة إلى كل بئر للتحفيز واحتضان اللوحة عند 37 درجة و 5٪ CO2 في اليوم الرابع من خلايا CD 40 B البحرية للزراعة الفرعية مرة أخرى للزراعة الفرعية الأولى للCD 40 البحرية ، الخلايا البائية المنشطة في اليوم الرابع وبعد الثقافات الفرعية كل ثلاثة إلى أربعة أيام. احصد الخلايا العنقودية برفق من صفيحة الآبار الستة عن طريق إنفاق الريوس باستخدام أنبوب 10 ملليلتر. قم بتجميع خلايا CD 40 B البحرية في أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بتدوير الخلايا لمدة سبع دقائق عند 1300 دورة في الدقيقة المقابلة 260 5G التي تم استبدالها بالكامل بالوسط بواسطة وسيط غسيل CD 40 B.

ولتحديد عدد خلايا خلايا CD 40 B البحرية ، نعلق خلايا CD 40 B البحرية عند كثافة خلية بنقطة oh 75 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في وسط زراعة CD 40 B البحري. ثم مرة أخرى ، استكمل معلق الخلية بأربعة IL بحري طازج بتركيز وحدة واحدة لكل مليلتر ، وسيكلوسبورين أ بتركيز نقطة أوه 63 ميكروغرام لكل مليلتر و 100 شعاع ميكرومولار حتى الإيثانول. بالطبع ، يجب فحص الخلايا المغذية المشعة مرة أخرى للتأكد من الالتصاق تحت المجهر مباشرة قبل الاستخدام.

إذا كانت الخلايا المغذية ملتصقة ، فقم بإزالة SUP natin بعناية من كل منها. حسنا ، قم بنقل تعليق CD 40 B البحري الذي تم إعداده قبل فترة وجيزة إلى كل بئر للتحفيز. تتكرر الثقافة الفرعية بشكل متماثل بعد ثلاثة إلى أربعة أيام مرتين في الأسبوع لينتهي بها الأمر بخلايا بائية منشطة عالية النقاء CD 40 في اليوم 14 من الاستزراع.

في هذا الوقت ، تعبر خلايا CD 40 B البحرية عن جزيئات التحفيز المشترك مثل جزيئات CD 80 و CD 86 و MHC بالإضافة إلى واحد واثنين ، والتي يمكن فحصها بواسطة Fox أثناء التوليد. يمكن استخدام الخلايا التي أنشأناها الآن لإجراء أبحاث حول تنشيط الخلايا البائية وتمايزها ووظيفتها ، على سبيل المثال ، للتحقيق في استخدامها المحتمل لأغراض العلاج المناعي.