تحليل شامل للالتركيبية جدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الأول : اللجنين

تحديد محتوى اللجنين وتكوين جدران الخلايا النباتية بالمواد النباتية المجففة ، والتي تخضع لعمليات استخراج مختلفة. تتكون المادة الناتجة من جدران الخلايا فقط ثم يتم تقسيمها لتحديد محتوى اللجنين. تخضع مادة الجدار للتحلل المائي بواسطة بروميد الأسيتيل ويتم قياس المواد الأحادية القابلة للذوبان بواسطة قياس الطيف بالأشعة فوق البنفسجية لتحديد تكوين اللجنين.

يتم تحلل مادة الجدار عن طريق التحلل الخلوي. ثم يتم اشتقاق مكونات اللجنين القابلة للذوبان إلى مشتقاتها المالحة ثلاثية الميثيل المتطايرة ، والتي يمكن فصلها وقياسها كميا باستخدام كروماتوغرافيا الغاز جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي. يتم توضيح تحديد تكوين عديد السكاريد المصفوفة ومحتوى السليلوز في مقطع فيديو آخر بعنوان التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية ، الجزء الثاني الكربوهيدرات.

مرحبا ، أنا ماركوس باولي ، رئيس منشأة تحليل الجدار في مركز أبحاث الطاقة الحيوية في البحيرات العظمى هنا في جامعة ولاية ميشيغان. أنا كليف فوستر ، مدير منشأة جدار الخلية التحليلي. سنعرض لك الإجراء الخاص بكيفية تحديد محتوى وتكوين عينات الكتلة الحيوية النباتية.

تقوم النباتات بتحويل الطاقة الضوئية من الشمس إلى طاقة كيميائية مثل الكتلة الحيوية. تتكون الكتلة الحيوية النباتية بشكل أساسي من جدران الخلايا ، وهي شبكة معقدة من مجموعة متنوعة من البوليمرات التي تغلف جميع الخلايا النباتية. نحدد هنا تكوين مواد جدار الخلية النباتية لتقييم إمكانية تحويل هذه اللجنين Cellose X ، والتي تعد موردا متجددا وفيرا للغاية إلى وقود حيوي.

سنركز اليوم على لجنين البوليفينول في مقطع فيديو آخر بعنوان التحليل التركيبي الشامل لجدران الخلايا النباتية ، الجزء الثاني من الكربوهيدرات. سنركز على تحليل عديد السكاريد. لبدء هذا الإجراء ، أضف ثلاث كرات من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 5.5 ملم إلى أنبوب غطاء لولبي سعة ملليلتر وحوالي 60 إلى 70 ملليغرام من الهواء أو المواد النباتية المجففة بالتجميد.

يمكن طحن المادة إلى مسحوق ناعم باستخدام جدار العين ، روبوت طحن وتوزيع. يأخذ جدار العين الأنبوب ويهزه لمدة 30 ثانية ، حيث يتم طحن المادة إلى مسحوق ناعم بسبب الكرات المعدنية ، ثم يتم فك مسحوق النبات المضغوط بإجراء بديل غير آلي منخفض الإنتاجية. يتم تقديم تسهيل الرجعية في الجزء الثاني ، أضف 1.5 متر من الإيثانول المائي بنسبة 70٪ إلى دوامة المواد الأرضية تماما وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.

يعمل هذا العلاج على إذابة معظم البروتينات وعضيات الخلايا ، وشفط المادة الطافية ، وإضافة حجم واحد إلى واحد إلى الحجم. يهز محلول الميثانول الكلوروفورم إلى الحبيبات غير القابلة للذوبان في الكحول جيدا لإعادة تدوير الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي. يستخرج الميثانول الكلوروفورم المركبات الكارهة للماء مثل الدهون بعد الطرد المركزي ، ويستنشق المادة الطافية ويعيد تعليق الحبيبات و 500 ميكرولتر من الأسيتون.

لتجفيف العينة ، تبخر المذيب بتيار من الهواء عند 35 درجة مئوية حتى يجف ، يمكن تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة حتى مزيد من المعالجة. لبدء إزالة النشا من عينة ريوس ، قم بتعليق الحبيبات و 1.5 مل من 0.1 مولار أسيتات الصوديوم درجة الحموضة خمسة تغطي الأنابيب وقم بتسخينها في كتلة تسخين لتحويل النشا إلى جلتنة. بعد تبريد التعليق على الجليد ، أضف مزيج الإنزيم المتحلل للنشا ، وغطاء الأنبوب ، واحتضان الدوامة تماما للتعليق طوال الليل.

في شاكر عند 37 درجة مئوية ، يضمن شاكر الدوران الخلط المناسب. بعد الحضانة الليلية ، قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق التسخين في كتلة تسخين على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على نشا قابل للذوبان.

اغسل الحبيبات المتبقية ثلاث مرات باستخدام 1.5 مل من الماء في كل مرة عن طريق الدوامة, الطرد المركزي, والصب كما هو موضح من قبل. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الأسيتون وتبخر المذيب بتيار من الهواء عند 35 درجة مئوية حتى يجف. العينات المجففة التي تحتوي على جدار أو ساق خلية معزولة ، لا توجد سليلوز جاهزة لمزيد من التحليل ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.

ابدأ بوزن واحد إلى 1.5 ملليغرام من مادة جدار الخلية المحضرة. يمكن وزن المادة يدويا أو بطريقة آلية باستخدام جدار العين كما هو موضح في الجزء الثاني. اشطف جدران الأنبوب ب 250 ميكرولتر من الأسيتون لجمع مادة جدار الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب وتبخير الأسيتون برفق شديد تحت تدفق الهواء.

بعد أن يتبخر الأسيتون ، أضف برفق 100 ميكرولتر من حجم 25٪ الطازج إلى حجم بروميد الأسيتيل في حمض الخليك الجليدي على طول الجدارين. لمنع تناثر البروميد الرقيق يكسر بوليمر اللجنين إلى أحاديه الأسيتيل. ثم قم بتغطية القارورة الحجمية وتسخينها على حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعتين.

سخني ساعة إضافية مع أربع رسائل نصية كل 15 دقيقة ، وأخيرا تبرد على الثلج في درجة حرارة الغرفة بعد تبريد القارورة ، أضف 400 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم المولي و 70 ميكرولترا من دوامة هيدروكلوريد هيدروكلوريد 0.5 مولار المحضرة حديثا ، وهي القوارير الحجمية. بعد ذلك ، قم بتحييد المحلول عن طريق ملء القارورة الحجمية بالضبط إلى علامة المليلتر بغطاء حمض الخليك الجليدي واقلبها عدة مرات لخلط الماصة 200 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على اللالات الأحادية المتحللة والقابلة للذوبان في لوحة بئر 96 خاصة بالأشعة فوق البنفسجية وقراءة اللوحة في قارئ لوحة البئر عند 280 نانومتر. اقرأ اللوحة ثلاث مرات على الأقل ومتوسط الامتصاص لأن الجسيمات يمكن أن تسبب اختلافا طفيفا في قيم الامتصاص.

حدد النسبة المئوية للجنين القابل للذوبان في البروميد أو A BSL باستخدام معامل النبات المناسب مع الصيغة المعروضة في البروتوكول المكتوب. اللجنين عبارة عن شبكة بوليفينول تتكون بشكل أساسي من ثلاث وحدات فرعية ، P hydroxy phenol ، gua ACell ، ووحدات السبرينغ رول لتحديد تكوين اللجنين في المادة النباتية. ابدأ بنقل ما يقرب من ملليغرامين من مادة جدار الخلية إلى أنبوب زجاجي مغطى بالمسمار لتحلل الخلايا.

بعد ذلك ، استعد لتحضير 2.5٪ بورون ثلاثي فلوريد إيثيل ، و 10٪ محلول إيثان ثيول في الديوكسان. نظرا لأن الديوكسان خطير للغاية ، فلا تأخذ أي عينات أو معدات من الغطاء. تذكر أن تعمل بحذر شديد وتستخدم بالونا مملوءا بغاز النيتروجين لإزاحة الحجم المفقود في زجاجة الديوكسان بالنيتروجين.

تحضير المحلول عن طريق خلط الأحجام التالية لكل عينة 175 ميكرولتر ديوكسان 20 ميكرولتر ETSH خمسة ميكرولتر BF ثلاثة. بعد الخلط ، أضف 200 ميكرولتر من المحلول إلى كل عينة. قم بتطهير مساحة القارورة بغاز النيتروجين والغطاء.

انتقل على الفور إلى تسخين العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة أربع ساعات مع الخلط اللطيف كل ساعة في نهاية الساعة. تفاعل تحلل ثيو الآس على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم أضف 150 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.4 مولار لتحييدها ودوامة.

لتنظيف منتجات تكسير اللجنين ، أضف مل واحد من الماء و 0.5 مل من دوامة الأسيتات واترك المراحل منفصلة. ستكون طبقة أسيتات الإيثيل في الأعلى والماء في الأسفل. انقل 150 ميكرولترا من طبقة أسيتات إثيل العلوية التي تحتوي على مكونات اللجنين إلى أنبوب بسعة ملتين ، مع التأكد من عدم نقل الماء.

بعد النقل من طبقة أسيتات إثيل العليا ، قم بتبخير المذيب باستخدام مكثف بالهواء. أضف 200 ميكرولتر من الأسيتون وتبخر. كرر العلاج بالأسيتون مرتين لإزالة الماء الزائد.

بجانب اشتقاق مكونات اللجنين إلى مشتقات ثلاثي ميثيل Cy Lane المتقلبة. أضف 500 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل ، و 20 ميكرولتر من البيورين ، و 100 ميكرولتر من أسيتاميد ثلاثي ميثيل أسيل NO biss إلى كل أنبوب. احتضان لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية.

في نهاية الساعتين ، انقل 100 ميكرولتر من التفاعل إلى قارورة GC MS وأضف 100 ميكرولتر من الأسيتون. قم بتحليل العينات بواسطة GC المجهز بمطياف الكتلة الرباعي أو كاشف تأين اللهب. للحصول على عمود وتفاصيل الجري ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب المصاحب.

فيما يلي بعض النتائج التمثيلية لتحليل اللجنين باستخدام خشب الحور كمادة نباتية. وفقا لهذا التحليل ، يتكون 22٪ من مادة الحور من لجنين البوليفينول. تم تحليل تكوين مكونات اللجنين بواسطة GCMS.

وتحدد القمم بأوقات الاحتفاظ النسبية باستخدام المعيار الداخلي رباعي الكوان أو برموز الطيف الكتلي المميزة 2 99 ميجا هرتز 2 و69 ميجا هرتز و2 39 ميجاهرتز لمونومرات sg وh على التوالي. يتم قياس تكوين مكونات اللجنين عن طريق ضبط مساحة الذروة الإجمالية على 100٪ يظهر التحليل التركيبي أن هذه العينة المعينة تحتوي بشكل أساسي على وحدات سلسلة أو S. ومع ذلك ، فإن وحدات Goya أو aol أو G وفيرة أيضا.

من الواضح أن الكمية وتكوين الوحدة أحادية السمك يمكن أن تختلف اعتمادا على الأنسجة النباتية وأنواعها. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحديد محتوى اللجنين وتكوين المواد النباتية لتحليل السكريات. تحول إلى الجزء الثاني.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.