كريستوفر هيوز : حدث في نموذج المختبر لدراسة الأوعية الدموية (مقابلة)

مرحبا ، اسمي الدكتور كريستوفر هيوز. أنا أستاذ في جامعة كاليفورنيا في إيرفين ، ويعمل مختبري على تكوين الأوعية. ونحن مهتمون بشكل خاص بالجينات التي تنظم عملية تكوين الأوعية.

لقد قمنا بتحسين فحوصات في المختبر بناء على عمل نيلسون، وفي هذا الاختبار يمكننا أن ننظر إلى جميع العمليات المختلفة التي تحدث أثناء تكوين الأوعية، نقوم بتغطية حبات تيديكس، الخرز الصغير بالخلايا البطانية. ثم نقوم بتضمينها في المواد الهلامية الفيبرينية. نحن نقدم عوامل النمو.

وعلى مدار عدة أيام ، تنبت الخلايا البطانية من الخرز. إنهم يهاجرون ، ويتماشى ، ويتكاثرون ، ويصنعون الأنابيب ، ويتفرعون ويشكلون مفاغرة. بحيث يكون لدينا شعيرات دموية كاملة مثل الشبكة في الثقافة.

حسنا ، بعض المشاكل المتعلقة بفحوصات envivo وتكوين الأوعية الدموية ، على سبيل المثال ، تلك التي يتم إجراؤها في الفئران هي أنها كثيرة ، ليس من السهل جدا التلاعب بالنظام. من الصعب أن تتخيل عندما يحدث هذا داخل ، لا يمكنك حقا رؤية تكوين الأوعية يحدث. وإذا كنت ترغب في التلاعب بالنظام في ثقافاتنا المختبرية ، فمن السهل جدا التلاعب وراثيا بالخلايا البطانية ، وتشغيل الجينات وإيقاف تشغيلها ، والنظر إلى تأثيرات ذلك على تكوين الأوعية الدموية.

ومن الصعب جدا القيام بذلك في بأكمله. عليك أن تقوم بالضربة القاضية أو الضربات. إذن هاتان هما الميزتان الرئيسيتان.

إنه ، من السهل التلاعب به ومن السهل تصوره. لذلك على مر السنين ، تم تطوير عدد من فحوصات عدم التخلق في المختبر المختلفة ولها جميعا مزاياها وعيوبها. وعلى وجه الخصوص ، أحد الأشهر هو مقايسة هلام المصفوفة حيث توضع الخلايا البطانية فوق هذه المصفوفة خارج الخلية المسماة ماتريجل.

والمشكلة هناك هي أن الخلايا البطانية تصنع هياكل تشبه الحبل ، لكنها لا تصنع أوعية مناسبة بالألمنيوم. أنت لا ترى تنبت ، ولا ترى مفاغرة. هناك نماذج جل الكولاجين ، والتي يمكن أن تكون جيدة.

هناك الكثير من هؤلاء لا ترى تكاثر الخلايا البطانية. لا تميل إلى رؤية مفاغرة. يعتمد اختبار هلام الفيبرين الذي طورناه على نموذج من قبل نيلسون كار نشر في منتصف التسعينيات.

وقد قمنا الآن بتحسين ذلك بشكل كبير بحيث يمكننا رؤية جميع مراحل تكوين الأوعية. يمكننا مشاهدة الإنبات الأولي ، الهجرة. نرى تكاثر الخلايا ، ونرى تكوين التجويف ، ونحصل على التفرع ، وأخيرا نحصل على مفاغرة لتشكيل شبكة وعائية كاملة في المختبر.

لذا فإن هذا الاختبار هو حقا ، نعتقد أن أفضل نظام في المختبر إذا كنت تريد إلقاء نظرة على كل تلك المراحل المختلفة لتكوين الأوعية. ميزة أخرى لدينا مع هذا الفحص في المختبر هي أنه يمكننا القيام بالتقاط الليزر ، والتشريح الدقيق ، ويمكننا تدوير الثقافة بحيث تصبح مسطحة جدا ، ثم استخدام مجهر التشريح الدقيق لالتقاط الليزر. يمكننا في الواقع إخراج الخلايا الفردية وعلى وجه الخصوص نحن مهتمون بخلايا الطرف.

ولذا فإننا نقطع هذه الأشياء ويمكننا أن ننظر إلى التعبير الجيني ، خاصة في الخلايا الطرفية مقابل خلايا الجذع ، الخلايا التي تصنع التجويف بالفعل. وفرضيتنا هي أنه سيكون هناك تعبير جيني تفاضلي بين هاتين المجموعتين من الخلايا. يمكننا أن ننظر إلى ذلك ، سيكون من المستحيل إلى حد كبير القيام بذلك في نظام في الجسم الحي.

لذلك نعتقد أن هذه ميزة رئيسية أخرى لاستخدام هذا الفحص في المختبر. العمل المبكر الذي تم إنجازه في هذا ، كما ذكرت نيلسون ريكون ، استخدموا الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة. وهناك الكثير من التفكير في أن الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة ، الخلايا التي قد ترغب في استخدامها لاختبار مثل هذا لأنه في الجسم الحي ، فإن EC الأوعية الدموية الدقيقة هي التي تشكل أوعية جديدة.

قررنا أن نحاول القيام بذلك باستخدام ve. هذه هي الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية لعدة أسباب. أحدها هو أنه من السهل جدا الحصول على هذه الخلايا.

يمكنك الذهاب إلى المستشفى ، ويمكنك الحصول على الحبل السري من أجنحة الولادة ، ويمكنك عزل الخلايا بسهولة بالغة. وأيضا تم استخدام هذه الخلايا في الثقافة لسنوات عديدة. إنها مميزة بشكل جيد للغاية.

ولذا قمنا بإعداد هذا الاختبار وتحسينه حتى نتمكن من استخدام هذه الخلايا لهذه الأسباب. ومن المثير للاهتمام ، اتضح أن هذه الخلايا البطانية للأوعية الكبيرة تبدو وكأنها تأخذ شكل الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة والثقافة. يفقدون الكثير من الجينات التي يتم التعبير عنها عادة بواسطة الأوعية الدموية الكبيرة ويبدأون في التعبير عن الجينات التي ترتبط عادة بالخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة.

وهي قادرة تماما على تكوين الشعيرات الدموية مثل براعم صنع اللومن وجعل ما يبدو عليه العالم كله شعيرات دموية حقيقية في الثقافة. لذا فهي سهلة الاستخدام ، وسهلة الاستخدام ، وتفعل ما نريدهم أن يفعلوه. تنبت وتصنع أوعية مناسبة بالألمنيوم.

عندما نريد تحديد هذا الاختبار ، فهناك طريقتان يمكننا اتباعهما. يمكننا أن ننظر إلى المعايير الكمية حقا مثل عدد البراعم ، وطول البراعم ، وقطر البراعم ، وعدد نقاط الفروع ، وعدد مفاغرة ، لكننا ننظر أيضا إلى المعايير النوعية. وهكذا يمكننا أن ننظر إلى هل يشكلون لومن؟

وهذا على الأرجح هو أكثر ما يهتم به. في الكثير من المقايسات التي نقوم بها هو تكوين التجويف المناسب. وهذا في الحقيقة أكثر من تقييم نوعي ، على الرغم من أنه مع زيادة حجم الأوعية ، يمكن للمرء في الواقع قياس قطر تلك التجويف أيضا.

لذلك نستخدم الخلايا الليفية في هذه الثقافات. نقوم بتضمين الخرزات في هلام الفيبرين ونقوم بوضع الخلايا الليفية فوق الجل. الخلايا الليفية ضرورية للغاية للإنبات السليم وتكوين التجويف.

في حالة عدم وجود الخلايا الليفية ، نحصل على بعض النمو. ومع ذلك ، تميل الخلايا البطانية إلى عدم الارتباط ببعضها البعض. ما يحدث هو أنهم يهاجرون بعيدا عن بعضهم البعض.

وبالتالي فإن أي هيكل تقوم بتطويره على هذا البرعم يميل إلى الانهيار. وبعد بضعة أيام ، تخضع الخلايا البطانية لموت الخلايا المبرمج. لذلك يبدو أن الخلايا الليفية تصنع عوامل ضرورية لتكوين الأوعية الدموية ، على الأقل في هذا النظام المختبري.

وقد كنا مهتمين جدا بمعرفة ماهية هذه العوامل. ما وجدناه هو أن الخلايا الليفية تفرز شيئا ما في الوسط ، حتى نتمكن من أخذ وسط الحالة من الخلايا الليفية وهذا سيدعم الإنبات السليم وتكوين التجويف. لذلك نحن بالتأكيد نتعامل مع عامل قابل للذوبان.

لذلك من الواضح أننا مهتمون جدا بمعرفة ما الذي تصنعه الخلايا الليفية وهو أمر مهم جدا لتكوين الأوعية في هذا النظام. لقد جربنا جميع المشتبه بهم المعتادين ، VEGF ، fg F الأساسي ، موجودون في الثقافة ، إضافة المزيد لا يحل محل الخلايا الليفية. لقد جربنا أيضا angiopoietin one و TGF beta و H و GF وما إلى ذلك وما إلى ذلك.

حتى الآن لم نعثر على العامل الحيوي. لذا ما نقوم به الآن هو تنقية العوامل من وسط الحالة من الخلايا الليفية. إذن، نضع وسيط الحالة على أعمدة مختلفة، الكاتيون، التبادل، استبعاد الحجم، ونحصل على كسور من ذلك لها نشاط.

ونحن الآن نتابع هذا النشاط ونأخذ تلك الكسور ، ونوجد أيها نشط ، ومن هناك يمكننا تشغيلها على المواد الهلامية ، والتأكد من أن لدينا عددا قليلا نسبيا من النطاقات على الهلام ومن ثم يمكننا قطعها وتسلسلها حسب مواصفات الكتلة. وهذا يعطينا الكثير من الأيام المثيرة للاهتمام. لدينا عدد غير قليل من الجينات المرشحة الآن التي نختبرها بشكل فردي لمعرفة ما إذا كانت في الواقع العامل الذي نبحث عنه.

لذلك اختبرنا الكثير من العوامل الوعائية المعروفة ونعلم أن GF النباتي و FGF الأساسي ضروريان بالفعل للإنبات المناسب في هذا الفحص. لكنها ليست القصة الكاملة. هناك عوامل مشتقة مهمة ، كما ذكرت ، وإحدى الطرق التي نظرنا بها إلى هذا هي أننا أخذنا الخلايا السرطانية ، وهي شديدة الأوعية الدموية في الجسم الحي ، فهي تولد أورام كبيرة في الفئران وهي شديدة الأوعية الدموية.

وقد نظرنا إلى هذه الخلايا السرطانية وهي تعبر عن مستويات عالية جدا من النباتيات ووضعناها في ثقافاتنا. لذلك استبدلنا الخلايا الليفية بهذه الخلايا السرطانية وهي لا تدعم تكوين الأوعية الدموية القوية في هذا الفحص. وهذا مثير جدا للاهتمام.

ما يوحي به ذلك هو ، وقد اقترح هذا من قبل أشخاص آخرين أيضا ، هو أن هناك تداخلا بين الورم ، السدى S ، وهو الخلايا الليفية والخلايا الداعمة الأخرى في الأنسجة والخلايا البطانية. وقد تنتج الخلايا السرطانية بعض العوامل التي تعمل مباشرة على الخلايا البطانية ، ولكنها تنتج أيضا عوامل أخرى تحفز الخلايا الليفية والخلايا اللحمية الأخرى لتكوين عوامل تدعم أيضا تكوين الأوعية الدموية القوية.