طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية

أعدّ الباحثون في جامعة جورجيا ومدرسة وارنيل للغابات والموارد الطبيعية المادة التالية. يصف هذا الفيديو التوضيحي عملية حصاد أنسجة الخشب واللحاء، وما يلي ذلك من عزل لـ RNA من شجر Pinus Teta، المعروف باسم صنوبر لوب لولي، وهو أهم نوع من المخروطيات لإنتاج المنتجات الحرجية في الولايات المتحدة. وبمجرد قطع الشجرة، وفي هذه الحالة شجرة عمرها 40 عاماً، يتم تقسيم الساق الرئيسية إلى قطع يبلغ طولها 50 centimeters تقريباً.

يتم بعد ذلك تحزيز البرغي طوليًا باستخدام المنشار الجنزيري في عدة مواضع لتسهيل إزالة اللحاء. وباستخدام مطرقة وإزميل خشب، يُرفع اللحاء حتى يصبح من الممكن تقشيره على شكل أقسام. بعد ذلك، تُزال الأنسجة التدفقية يدويًا عن طريق نزعها من الجانب الداخلي لأقسام اللحاء وغمرها فورًا في النيتروجين السائل.

بمجرد إزالة اللحاء، يمكن جمع الطبقة الرقيقة من الخشب الثانوي عن طريق كشط سطح القطعة باستخدام شفرة حلاقة أحادية الجانب. يُوضع نسيج الخشب المائي فوراً في النيتروجين السائل. وفي عملية الحصاد هذه، قمنا أيضاً بجمع عينات من خشب التفاعل، والذي يُشار إليه عادةً باسم خشب الضغط والخشب المقابل، وذلك قبل قطع الأغصان من الساق الرئيسية.

يتم أولاً تحديد اتجاه الطرف باستخدام طلاء الرش لتمكين تحديد المناطق التي تحتوي على نوعي الأنسجة: الخشب المقابل (opposite wood) في الجزء العلوي من الطرف، والخشب الانضغاطي (compression wood) في الجزء السفلي. وأثناء عملية إزالة اللحاء، يتم أولاً تحزيز الأطراف باستخدام منشار كهربائي على طول الخطوط التي تفصل بين الخشب الانضغاطي والخشب المقابل، ثم تُجرى عملية إزالة اللحاء بنفس طريقة التعامل مع براغي الساق الرئيسية، مع مراعاة إزالة اللحاء فقط في المنطقة التي تقابل نوع التفاعل.

يتم إزالة الخشب الذي يتم حصاده في أي وقت محدد. وعادة ما يكون من الأكثر صعوبة إزالة أقسام اللحاء الكبيرة من هذه الأغصان الصغيرة. تُجمع عينات خشب التفاعل من الخشب الثانوي الثانوي بنفس الطريقة المستخدمة مع الخشب الثانوي الطبيعي عن طريق الكشط بشفرة الحلاقة والغمر الفوري في النيتروجين السائل.

لاحظ اللون البني المائل للاحمرار المميز لخشب الضغط. وتجدر الإشارة إلى أن جمع ومعالجة عينات متعددة من شجرة كبيرة يتطلب تكاتف العديد من الأشخاص، حيث يقوم كل فرد بمهمة محددة لضمان جمع جميع أنواع الأنسجة في وقت واحد للمساعدة في تقليل تحلل RNA؛ ثم تُنقل العينات المجمدة في النيتروجين السائل لاحقاً إلى أكياس تخزين مصنفة وتوضع على الثلج الجاف لنقلها إلى المختبر. تتمثل خطوتنا الأولى في سحق النسيج باستخدام مطحنة التجميد specs model 68 50، ومقارنةً بالطحن باستخدام الهاون والمدقة، فإن هذه الخطوة تزيد بشكل كبير من إنتاجية استخلاص RNA لعينات الأنسجة الخشبية، مع الحفاظ على برودة العينات باستخدام النيتروجين السائل.

يتم أولاً تفتيت النسيج يدوياً إلى قطع أصغر ووضعه في غرفة العينة. ثم تُدرج الغرفة في الحامل وتُثبَّت في مكانها، وتُطحن العينة لمدة دقيقتين. ويكون المنتج النهائي بقوام مسحوق خشن.

تتم عملية بروتوكول استخلاص الـ RNA على مدار يومين. في اليوم الأول، يتم إضافة 2.5 grams من الأنسجة المجمدة إلى محلول استخلاص الـ RNA الذي تم تسخينه إلى 65 °C. تُرج العينة بقوة لضمان الامتزاج، ثم يُضاف حجم مساوٍ من الكلوروفورم وتُخلط العينة مرة أخرى عن طريق القلب اللطيف.

توضع العينة بعد ذلك على عجلة دوارة لمدة خمس دقائق. ثم تُنقل العينة إلى أنابيب Teflon Oakridge عالية السرعة وتُفصل بجهاز الطرد المركزي في دوار SS 34 بسرعة 12,000 RPM لمدة خمس دقائق. يتم استخلاص الجزء المائي العلوي في أنبوب جديد ويُضاف إليه نصف حجم من الكلوروفورم.

يتم رج العينة بجهاز الفورتيكس لمدة دقيقة واحدة، ثم توضع مرة أخرى على العجلة الدوارة لمدة خمس دقائق. وبعد عملية طرد مركزي ثانية، يتم استخلاص الجزء المائي مجدداً في أنبوب بولي بروبيلين عالي السرعة سعة 50 mil، ويُطرد مركزياً بسرعة 10,000 RPM لمدة 20 دقيقة. ولإزالة أي جسيمات متبقية، تُصب العينة في أنبوب Falcon سعة 50 mil، ويُضاف إلى العينة ربع حجم من كلوريد الليثيوم بتركيز 10 molar.

يتم خلط العينة عن طريق الرج ووضعها في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي اليوم الثاني، يتم أولاً طرد العينة المرسبة باستخدام كلوريد الليثيوم مركزياً بسرعة 11,000 RPM لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

يتم سكب الطور العلوي والتخلص منه، ثم تُقلب الأنابيب على مناديل كيميائية (chem wipes) لمدة دقيقة واحدة. ولإزالة أي سائل زائد، يتم إعادة تعليق كتلة الـ RNA، والتي يجب أن تكون مرئية، في 800 µL من منظم SSTE الساخن الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 65 °C. تأكد من السحب والضخ بالماصة عدة مرات وحول حواف الكتلة لضمان ذوبانها بالكامل في المحلول.

بعد ذلك، انقل الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعاد تعليقه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خالي من الـ RNA من نوع two mil and beyond. سخّن العينة لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حمام مائي عند 65 درجة مئوية، متبوعاً بالرج باستخدام جهاز vortex لضمان إعادة تعليق العينة بالكامل. يمكن تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر.

الآن، أضف حجماً مساوياً من الكلوروفورم والفينول المنظم. قم برج العينة بجهاز الفورتكس لمدة تتراوح بين 15 إلى 20 ثانية، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي الدقيق بسرعة 14,000 RPM لمدة ثلاث دقائق. استخلص الجزء المائي في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف حجماً مساوياً من.

يتم خلط العينة بجهاز vortex ومعالجتها بالطرد المركزي الدقيق كما في عملية الاستخلاص السابقة. وفي مرحلة الاستخلاص العضوي النهائية، يتم أولاً معالجة أنابيب Lock gel بالطرد المركزي الدقيق بسرعة 11,000 RPM لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، تُضاف عينة الـ RNA الناتجة من عملية الاستخلاص السابقة إلى هلام فصل الأطوار (phase lock gel)، يليه إضافة نصف حجم من الكلوروفورم، ثم يُمزج المزيجان عن طريق الماصة بلطف. بعد ذلك، يتم طرد العينة مركزياً بسرعة 11,000 RPM لمدة خمس دقائق، وتُنقل عينة الـ RNA الموجودة في الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي جديد من نوع ambion RNA free. الخطوة التالية هي ترسيب بسيط للـ RNA في العينة بإضافة عُشر حجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar وبدرجة pH 4.8 وحجمين من الإيثانول بتركيز 100%.

يتم رج العينة بجهاز الـ vortex، ثم توضع لفترة وجيزة في مجمد بدرجة حرارة 80- °C لمدة 30 دقيقة، ثم تُطرد مركزياً باستخدام جهاز الـ micro fuge لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. يتم سحب السائل الطافي بعناية، وتُغسل الرواسب البيضاء الصغيرة بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 70% المبرد بالثلج، ثم يُسحب السائل وتُكرر عملية الغسل بالإيثانول بعد السحب النهائي. ويُترك الإيثانول المتبقي ليتبخر عن طريق ترك الأنابيب مفتوحة على طاولة المختبر لمدة خمس دقائق.

يتم إعادة تعليق رواسب الـ RNA في 100 µL من ماء DEPC، ويتم ذلك عن طريق الرج الدوامي والتسخين عند 65 °C. يمكن تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر. ثم يتم تحديد تركيز العينة.

يتم حساب نسب 260/280 و260/230 طيفياً لتقدير مدى تلوث العينة بالبروتينات والكربوهيدرات. ويُستخدم الفصل الكهربائي لهلام AGROS بنسبة 1% لتقدير جودة العينة نوعياً والكشف عن التلوث بالحمض النووي الجينومي وتفكك الـ RNA. كما يتم تقييم سلامة العينات الحرجة بشكل أكبر باستخدام جهاز Agilent 2100 bioanalyzer لتحديد نسب 28S/18S الريبوسومية ورقم سلامة الـ RNA. شكراً لمشاهدتكم الفيديو الخاص بنا حول حصاد عينات الأنسجة وعزل الـ RNA الكلي من صنوبر LOB lolly.

الأفراد التاليون هم المسؤولون عن تصوير وإنتاج هذا الفيديو التدريبي.