تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

يوضح هذا الفيديو طريقة لتشريح واستزراع العصبونات الزورقية من الحبل الشوكي الجنيني. تبدأ العملية بحصاد أجنة الجرذان في اليوم الجنيني E 13، ثم تشريح الحبال الشوكية واستخراجها. وخلال عملية التشريح، يتم فتح الحبال الشوكية على طول الصفيحة السقفية وتجهيزها بوضعية الكتاب المفتوح.

يتم تشريح شرائح من الأنسجة الظهرية وجمعها في أنبوب. ثم يتم تفكيك الأنسجة الظهرية إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام التريبسين والتقطيع الميكانيكي. بعد ذلك، تُزرع العصبونات الموصلة على شرائح غطاء زجاجية مغطاة بالبولي-لايسين أو في أطباق زراعة الأنسجة.

ويمكن استخدامها بعد ذلك لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لنمو المحاور العصبية وتوجيهها. مرحبًا، أنا سباستيان من مختبر البيولوجيا الجزيئية للنمو العصبي في معهد مونتريال للأبحاث السريرية. مرحبًا، أنا ستيف موين، أيضًا من مختبر البيولوجيا الجزيئية للنمو العصبي.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتشريح واستزراع العصبونات الموصلة من الحبل الشوكي الجنيني. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتوجيه المحاور العصبية. لذا، فلنبدأ.

سيتم اليوم تشريح الحبال الشوكية من أجنة جرذان في اليوم الجنيني E 13 تم حصادها حديثاً ووضعها في طبق يحتوي على وسط L 15 طوال عملية التشريح. ومن المهم الحفاظ على الأجنة والمحاليل مبردة على الثلج. تذكر أنه في جميع خطوات التشريح، من الضروري عدم شد الحبل الشوكي لأن ذلك قد يعيق عزل حبل شوكي سليم تماماً.

باستخدام مجهر تشريحي، افصل الجنين عن جميع الأنسجة خارج الجنينية والأغشية الجنينية. ثم ضع جنيناً واحداً في طبق التشريح. استخدم مقصات دقيقة لقطع الرأس والأجزاء الخلفية من الزوايا الموضحة هنا.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء سطح مستوٍ يساعد في وضع الجنين لضمان سهولة الوصول إلى الحبل الشوكي. ضع الجنين بحيث يكون الجانب البطني للأسفل مع توجيه الطرف الأمامي بعيداً. استخدم الملقط لتثبيت الجنين بإحكام من أحد الجانبين.

لا تضغط بقوة أو تترك الملقط وإلا سيتعرض النسيج للتمزق باستخدام الزوج الثاني من الملاقط. أمسك الجلد من جانب الحبل الشوكي. قم بلف طرفي ملقط التثبيت.

قم بإزالة الجلد الذي يغطي ظهر الجنين للكشف عن الحبل الشوكي الملفوف بسحايته، وذلك لفصل الأنسجة الموجودة على يمين الحبل الشوكي جزئياً. استخدم ملقطاً مغلقاً لوخز الأنسجة بدءاً من مستوى ملقط التثبيت، مع الاقتراب قدر الإمكان من الحبل الشوكي دون لمسه.

كرر هذه العملية عدة مرات على طول الحبل الشوكي. سيؤدي ذلك إلى ربط بعض عقد الجذر الظهرية وتعطيل الأعضاء البطنية. اترك بعض الأنسجة متصلة عند الطرفين الأمامي والخلفي، بدءاً من الطرف الأمامي.

استخدم إبرة تنجستن على شكل خطاف لقطع السحايا وفتح الحبل الشوكي على طول الصفيحة السقفية. قم بتدوير الجنين بمقدار 180 درجة وقم بتفكيك الأنسجة من الجانب المتبقي باستخدام الطريقة ذاتها.

بعد ذلك، قم بفصل الأنسجة الموجودة على الجانب الأيسر من الحبل الشوكي تماماً، وهو الجانب الذي تم إتلافه سابقاً وكان في الأصل جهة اليمين، ثم ضع الحبل الشوكي على جانبه واستخدم الملقط لإزالة معظم الأنسجة الميزنكيمية المتبقية وعقد الجذور الظهرية. استخدم الملقط لتقشير جزء صغير من السحايا. في هذه المرحلة، تكون السحايا والحبل الشوكي عبارة عن طبقتين من الأنسجة المتراصة فوق بعضها البعض.

استخدم الملقط لتثبيت الجزء الأكبر من الحبل الشوكي عند الطرف الأمامي. أمسك القطعتين المنفصلتين بالملقط وقم بإزالة السحايا. يجب أن تكون الحركة سلسة ومستمرة، حيث إن التقشير غير المنتظم قد يؤدي إلى تمزق طبقة السحايا و/أو الحبل الشوكي.

إذا تمزقت طبقة السحايا أثناء السحب، فإن جزء الحبل الشوكي الذي يظل ملتصقاً بالسحايا عادةً ما يكون غير قابل للاسترداد، على الرغم من أن ذلك قد يكون ممكناً في بعض الأحيان. استخدم ماصة بلاستيكية لنقل الحبل الشوكي المعزول بلطف إلى طبق يحتوي على وسط L 15 مع 10% مصل خيل معطل حرارياً على الثلج قبل معالجة المزيد من الأجنة.

تذكر تغيير الوسط في طبق التشريح بوسط L 15 المبرد للحفاظ على برودة الجنين والمساعدة في الحفاظ على سلامة الأنسجة. قم بحصاد الحبال الشوكية من جميع الأجنة قبل الانتقال إلى عمليات تشريح الحبل الشوكي الظهري. لبدء تشريح الحبل الظهري، ضع حبلاً شوكياً واحداً تم عزله حديثاً في طبق بتري يحتوي على L 15 مع 10% من مصل الحصان المنشط حرارياً.

قم بقص الجزء الأمامي الأعرض، والذي يتضمن جزءاً من الدماغ الخلفي. ثم ضع الحبل الشوكي بشكل مسطح وبسطه كأنه كتاب مفتوح. تقع الأنسجة الظهرية في الأجزاء الأكثر جانبية من الحبل الشوكي المفتوح، وأثناء تثبيت الحبل بإبرة تنجستن مستقيمة، استخدم إبرة تنجستن على شكل حرف L لقص شريحة تعادل تقريباً خمس عرض نصف الحبل الشوكي؛ علماً بأن قص شرائح أعرض سيزيد من الإنتاجية، ولكنه سيقلل من نقاء المزرعة.

انقل عدة شرائح ظهرية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter يحتوي على وسط L 15 مع 10% horse serum وضع الأنبوب على الثلج. ستتم بقية الإجراءات بالقرب من غطاء زراعة الأنسجة أو بداخله. وبالنسبة لهذه المزارع، من المهم تحضير المحاليل والمعدات مسبقاً، وعادةً ما يكون ذلك قبل عملية التشريح.

تستخدم خطوة التجميع أنابيب باستا مصقولة بالنار بمقاسين، أحدهما بقطر يبلغ نصف الحجم الأصلي والآخر أصغر قليلاً. قبل البدء، يتم طلاء الأنبوبين المصقولين بالنار بوسط يحتوي على المصل عن طريق سحب الوسط إلى داخل الأنابيب وتركه لمدة 30 ثانية. سيقلل هذا من عدد الخلايا التي تلتصق بالزجاج أثناء عملية التجميع.

ابدأ بالتحقق من استقرار الشرائط الظهرية في قاع الأنبوب. تحت غطاء التدفق الصفائحي، قم بإزالة معظم السائل الطافي من الـ SUP باستخدام ماصة بلاستيكية. اغسل بسرعة باستخدام ثلاثة milliliters من محلول HBSS البارد الخالي من المغنيسيوم والكالسيوم.

اترك شريحة الأنبوب العصبي الظهرية تستقر لمدة دقيقتين. بعد ذلك، قم بإزالة HBSS باستخدام الماصة. ارفع الحجم إلى 4.7 milliliters.

باستخدام محلول HBSS الدافئ، أضف 0.3 milliliters من trypsin بتركيز 2.5% للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.15% Tryin، ثم اخلط المزيج برفق وحضنه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة سبع دقائق، مع الخلط برفق مرة واحدة في منتصف فترة التحضين. وبمجرد انتهاء فترة التحضين، أضف DNAs للوصول إلى تركيز نهائي قدره 150 units per milliliter، وكبريتات المغنيسيوم للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.15%، ثم اخلط المزيج لفترة وجيزة.

يجب أن تكون قطاعات الأنبوب العصبي الظهرية الآن مجزأة. قم بطرد شظايا الأنسجة مركزياً عند 200 G لمدة أربع دقائق. قم بإزالة السائل الطافي (SUP) باستخدام ماصة، مع ترك حوالي 50 إلى 100 µL من السائل في قاع الأنبوب.

قم بنقر الأنبوب برفق لتفكيك الراسب. بعد ذلك، اغسل الخلايا بإضافة 5 mL من محلول HBSS الدافئ. اترك الخلايا تترسب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

قم بالطرد المركزي لترسيب الخلايا ثم اغسلها مرة أخرى. هذه المرة، أعد تعليق الخلايا في 2 mL من محلول HBSS الدافئ. استخدم ماصة مصقولة باللهب ذات قطر نصف قطر الخلية لتقسيم الخلايا عن طريق السحب والدفع ببطء من أربع إلى ست مرات، مع توجيه السائل نحو جانب الأنبوب لتفكيك التكتلات الكبيرة لتقليل موت الخلايا.

تجنب تكوين الفقاعات ولا تبالغ في التهوية. استخدم أصغر ماصة زجاجية مصقولة بالنار لمزيد من تفكيك الخلايا عن طريق السحب والدفع البطيء ثلاث إلى أربع مرات بنفس الطريقة. ليس من الضروري تفكيك جميع تجمعات الخلايا، حيث تميل الخلايا الميتة والحطام إلى تكوين تجمعات.

اترك أي شظايا نسيجية تترسب لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بإزالة 20 µL من الطافي (SUP natant)، والذي يجب أن يحتوي على خلايا معلقة لعدّها في جهاز hemo soter، على أن تكون العصبونات حيوية بنسبة 95% على الأقل وفقاً لاختبار trian blue ion plate. توضع العصبونات في وسط زراعة neuro basal بتركيز مناسب لتطبيقك.

بعد مرور 16 إلى 18 ساعة، قم بتغيير الوسط إلى وسط نمو عصبي قاعدي (neural basal growth media) لتجنب إزاحة الخلايا. قم بإزالة الوسط من العصبونات بلطف باستخدام ماصة بدلاً من الشفط بمضخة تفريغ. إليكم بعض النتائج النموذجية للعصبونات الصيوانية المعزولة والمزروعة على شرائح زجاجية مغلفة بـ PLL؛ فبعد أربع ساعات من الزراعة، تظهر العصبونات وقد التصقت بالسطح، وذلك بعد مرور 30 ساعة على عملية الزراعة.

تمتلك معظم العصبونات محاور ممتدة ذات مخاريط نمو مرئية. ويمكن استخدام هذه العصبونات بسهولة في تجارب التألق المناعي. في هذا المثال، تم وسم الأنيبيبات الدقيقة باللون الأخضر، والأكتين باللون الأحمر، و NA باللون الأزرق.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تشريح وزراعة العصبونات التوصيلية من الحبال الشوكية الجنينية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن نقاء العصبونات التوصيلية يعتمد على سمك الشريط الظهري الذي يتم تشريحه. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.