الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

في هذه المقالة نصف بروتوكول لنمو وتوسيع الخلايا الظهارية للقصبات الهوائية البشرية من أجزاء الشعب الهوائية البشرية المعزولة حديثا. يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام ، الترميز والخدش ، وألواح مزرعة مائة ملليمتر ، وإصلاح أنسجة الشعب الهوائية ، وزرع أنسجة الشعب الهوائية ، ومرور الخلايا الظهارية القصبية البشرية التي تنمو مهدبة ، والخلايا الظهارية القصبية البشرية على الآبار. قبل أن تبدأ ، لاحظ أن جميع الخطوات تتم في خزانة السلامة البيولوجية.

ما لم ينص على خلاف ذلك ، يرجى قراءة قسم المواد والكواشف والتحضير والتأكد من أنك قد أعددت بشكل أساسي. الترميز التالي ، ثقافة حل المخزون ، حلول التفكك المتوسطة ، الطلاء والخدش. يجب عمل لوحات ثقافة مائة ملم في توقيت جرينتش.

حافظ على كل شيء معقما. ضع ألواح ثقافة معقمة مائة ملم ومحلول طلاء. في ماصة BST ، تدور مطحنتان من محلول الطلاء ولوحة مائة ملم لتغطية قاعدة اللوحة.

تأكد من أن محلول الطلاء يغطي قاعدة اللوحة بالتساوي. قم بإخراج المحلول المتبقي واستخدمه لتغطية صفيحة مائة ملليمتر ثانية. كرر ذلك لأكبر عدد ممكن من الأطباق حسب الحاجة.

عدد الألواح المطلوبة باختلاف عدد مستخلصات الأنسجة. تأكد من أن محلول الطلاء يغطي قاعدة الألواح بالتساوي. كما هو موضح.

غطي الأطباق بأغطيتها. اترك الألواح تجف في الحاضنة لمدة ساعة إلى ساعتين واستنشق محلول الوصول قبل الاستخدام لمسح أنسجة الشعب الهوائية. يمكن وضع ألواح الاستزراع المطلية غير المستخدمة في كيس معقم وتخزينها عند أربع درجات مئوية لوقت لاحق.

استخدم مقصات ومشع ومخطوطة وملقط نظيفة وصغيرة وحادة بالرش مع 70٪ من الإيثانول وقم بإحضار الألواح المطلية بالخدش BSC عن طريق الضغط بقوة بمشرط لتشكيل XS صغير عميق لا يقل عن أربعة لكل لوحة. إذا لم يكن الخدش عميقا بدرجة كافية ، فلن تستقر قطع الأنسجة في المحاقن وستطفو خارج الأنسجة في طبق P ثلاثي. اشطف أنسجة الشعب الهوائية البشرية المعزولة جيدا في BSS out.

افتح قطع الشعب الهوائية. إحضار الأنسجة إلى BS ونقل إلى لوحة زراعة الأنسجة مائة ملليمتر معقمة مع يسمى DM EM لحم الخنزير F 12 بالإضافة إلى 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. استخدم المقص الصغير الحاد لتقطيع الأنسجة إلى قطعتين إلى ثلاث قطع مكعبة.

ضع قطعة واحدة من الأنسجة المقطوعة في وسط كل X بالملقط واضغط عليها. اترك قطع المناديل أو X برفق تلتصق باللوحة لبضع ثوان. ثم أضف برفق 10 مل من الوسائط الكاملة إذا كانت الأنسجة تطفو بعد إضافة الوسائط ، استخدم الملقط لدفع الأنسجة إلى حواف X أو عمل X.It جديدة قد يكون من الضروري عمل X جديدة إذا لم تكن النتوءات عميقة بدرجة كافية.

ضع الألواح في الحاضنة وقم بتغيير الوسائط كل ثلاثة إلى أربعة أيام ، وتكون الأنسجة جاهزة للزراعة. عندما تنمو خلايا ظهارية كافية حول الأنسجة لتغطية مناطق من سنتيمتر إلى سنتيمترين ، يستغرق ذلك حوالي أربعة أسابيع. استخدم ألواح مطلية ومخدوشة بمائة ملليمتر.

نظرا لأن بعض الأنسجة قد لا تكون ناجحة. يعتمد عدد اللوحات على عدد قطع الأنسجة التي تزرعها. إذا كنت تستخدم أطباقا تم طلاؤها وتخزينها مسبقا عند أربع درجات مئوية ، فقم بإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام باستخدام الملقط ، التقط الأنسجة بعناية من اللوحة الأصلية وضعها في وسط المحور في اللوحة الجديدة واضغط برفق على المناديل بدون نتوء.

دع الأنسجة تلتصق باللوحة. لبضع ثوان ، أضف الوسائط واحتضنها. أضف موصوفا سابقا ل X explan.

لذلك ملتان من الرحلات وحل مخزون EDTA لكل لوحة زراعة الأنسجة مائة ملم. قم بتخفيف المخزون بستة مل من الستيریل 0.01 مولار PBS واثنين من محلول المرق إلى ستة مل PBS للتركيز النهائي من التربسين عند 50 ميكروغرام لكل مل و EDTA بمعدل مائة ميكروغرام لكل مل. بعد ينقل [إكسبلتس] إلى لوحة جديدة, يستنشق وسائط من لوحات مع واحدة [تو] اثنان سنتيمتر حلقات الخلية.

أضف ثمانية مليل من القطرات المخففة الدافئة وقم بوضع محلول لكل طبق مائة ملم. وضع حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى 15 دقيقة. تحقق بشكل متكرر.

سيؤدي ترك التربسين لفترة طويلة إلى إتلاف الخلايا. افحص الألواح تحت المجهر للتأكد من رفع معظم الخلايا ، وسوف تدور الخلايا لأعلى وتنفصل كما هو موضح في ثمانية مليل من الدفء. 10٪ FBS في الوسائط لكل لوحة لإلغاء تنشيط EDT الحل.

اجمع أحجام جميع الألواح في أنبوب واحد أو أنابيب منفصلة من أنسجة مختلفة. عد الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي Hema Cytometer عند مائة G لمدة خمس دقائق. سوف تتشكل حبيبات الخلية في قاعدة الأنبوب ، وتقوم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسائط كاملة إلى تركيز الخلية المطلوب.

ضع كل من مليوني إلى 3 ملايين خلية لكل قارورة T 75 وأضف وسائط كاملة حسب الحاجة. احتضان وتغيير الوسائط. كل ثلاثة إلى أربعة أسابيع ، تنمو الخلايا إلى التقاء فرعي في قارورة D 75.

في غضون أربعة أسابيع تقريبا ، يجب رفع الخلايا وتوسيعها أو استخدامها عند التقاء فرعي لمنع التقاء الجسم. ابدأ بإعداد الأغشية القابلة للاختراق للآبار. استخدم إدخالات 6.5 ملم التي تتناسب مع ألواح الآبار المتعددة 24 بئر.

أضف وسيطا إلى جانبي الغشاء. أشر ستة ميل في الأسفل و 0.1 ميل في الأعلى. احتضان ساعة واحدة في حاضنة زراعة الخلايا.

قم بإزالة الوسط بعناية من جانبي الغشاء. البدء بالحجم القاعدي أولا يعني بعناية أن الغشاء يمكن أن يتلف بسهولة. لذا قم بتدوير الوسيط أسفل جانب ملحق المزرعة، واستخدم الحجم الموصى به.

سيؤدي عدم القيام بذلك إلى تسرب الوسائط إلى خلايا البذر الأخرى. بعد الحضانة المسبقة للدعم القابل للاختراق ، قم بوضع الماصة بعناية في الجانب الملحمي من الغشاء لآبار 6.5 ملم عند 0.1 مل من تعليق الخلية إلى الجانب الملحمي من الغشاء. الماصة 0.6 م ، متوسطة على الجانب القاعدي من الغشاء.

قم بتغذية الخلايا من الجانبين الملحمي والقاعدي لمدة 10 أيام. لإنشاء تبادل ثقافي جيد التمايز ، متوسط مرتين في الأسبوع. باستخدام الطريقة الموضحة ، قم بإزالة الحجم القاعدي.

أولا ، استبدل الحجم الملحمي ، أضف 0.6 مل من الوسط إلى الجانب القاعدي من الغشاء. تعزز هذه الطريقة ارتباط الخلايا بالغشاء وتمنع الخلايا من التعرض للهواء لفترات طويلة من الزمن. تبادل الوسائط بسرعة وإعادة الحاضنة.

قم بإنشاء واجهة سائل هواء في اليوم 10 عن طريق إزالة وسط AAL واستبدال 0.6 مل من الوسط على الجانب القاعدي من الغشاء. الحفاظ على الخلايا في واجهة سائل الهواء لمدة ستة أسابيع تغيير الوسائط مرتين في الأسبوع. ستبدأ الخلايا الهدبية في الظهور بعد أربعة أسابيع من تكوين الأذن.

واجهة سائلة. ستحقق الخلايا تمايزا موحدا إلى خلايا مهدبة. بعد ستة أسابيع من إنشاء واجهة سائل الأذن.

شرائح الشعب الهوائية البشرية مع الخلايا الظهارية السليمة من explan and transplants. في دراستنا ، حدثت ثقافات ناجحة من مخطط أنسجة الشعب الهوائية في ثمانية من أصل تسعة أنسجة. عندما أصيبت إحدى الثقافات الظهارية بالعدوى ، وصلت حلقات الخلايا الظهارية إلى نصف قطر سنتيمتر إلى سنتيمترين في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

استزراع X explan الناجحة مرة أخرى حتى ست مرات. تظهر جميع الثقافات الناجحة دليلا على هجرة الخلايا في غضون 48 ساعة من بدء عمليات الزرع ، أو X explan كما هو موضح في الخلايا البائية لها مظهر مرصوف بالحصى مميز لهذه الخلايا الظهارية كما هو موضح في B. وفي الأشكال اللاحقة ، كشف التلوين المناعي لمستحضرات السيتوزين للخلايا من explan والخلايا المزروعة على زلات الغطاء أن جميع الخلايا كانت إيجابية للسيتوكيراتين الخاص بالظهارة ، نمت خلايا الشعب الهوائية للزراعة الفرعية البشرية إلى التقاء فرعي وقارورة T 75 موضحة هنا. لاحظ مظهر الحصى.

أظهرت خلايا الشعب الهوائية البشرية الفرعية تلطيخا مناعيا إيجابيا موحدا للكيرين و E.Can أن يظهر التلوين المناعي بأجسام مضادة محددة ضد أنواع الخلايا الأخرى أي مؤشر على تلوث الثقافات بالخلايا الليفية أو الخلايا الوسيطة أو البطانية. لمزيد من التفاصيل ، يرجى الرجوع إلى الشكل خمسة وإيضاحه في الخلايا النصية المزروعة على أغشية بوليستر قابلة للاختراق أو الآبار مع أو واجهة سائلة متمايزة إلى ظهارة مهدبة كما هو موضح هنا ، تجاهل الخلايا ولها أو عمليات الزرع إذا كانت الخلايا ذات مورفولوجيا مختلفة كما هو موضح هنا تبدأ في الظهور. في هذا البروتوكول ، قدمنا طرقا مفصلة لزراعة وتوسيع الخلايا الظهارية للقصبات الهوائية البشرية الأولية.

هناك حاجة إلى دراسات قائمة على الخلايا البشرية لتحديد المسارات المهمة لآليات أمراض الرئة البشرية والسمية والفحص الدوائي للأدوية الجديدة. نأمل أن تشجعك الطرق الموضحة هنا على زراعة الخلايا الظهارية للقصبات الهوائية البشرية من النباتات الخارجية واستخدام هذه الخلايا في أنظمة الدراسة الخاصة بك. شكرا لك ونتمنى لك التوفيق.